NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH...

MÉu b×a luËn v¨n th¹c sÜ cã in ch÷ nhò khæ 210x297mm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Anh Thắng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH COLLAGENASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ KHU VỰC QUẢNG TRƢỜNG BA ĐÌNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Anh Thắng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH[.]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Anh Thắng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG TỚI Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH COLLAGENASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ KHU VỰC QUẢNG TRƢỜNG BA ĐÌNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Anh Thắng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MƠI TRƢỜNG TỚI Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH COLLAGENASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ KHU VỰC QUẢNG TRƢỜNG BA ĐÌNH Chuyên ngành : Vi sinh vâ ̣t ho ̣c Mã số : 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lại Văn Hòa PGS TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Lại Văn Hòa, PGS TS Bùi Thị Việt Hà, bảo, giúp đỡ hướng dẫn suốt q trình thực đề tài, giúp tơi vượt qua khó khăn để hồn thành khóa luận tốt nghiệp, bảo cho kiến thức, kinh nghiệm quý báu sống Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô cán môn Vi sinh vật học; thầy cô, cán Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ suốt những năm học vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ths Phùng Công Thưởng đồng chí thuộc Khoa Vi sinh vật & Môi trường, Viện 69 chia sẻ, giúp đỡ tạo điều kiện lớn để tơi hồn thành đề tài Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người bên tôi, động viên giúp đỡ mặt vật chất lẫn tinh thần suốt thời gian vừa qua Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2014 Học viên Hoàng Anh Thắng MỤC LỤC NỘI DUNG ĐẶT VẤN ĐỀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 1.1 Sơ lƣợc chất collagen 1.2 Sơ lƣợc vi nấm trình sản sinh enzyme ngoại bào 1.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng tới phân hủy 12 collagen vi nấm 1.3.1 Q trình sinh tổng hợp hoạt tính collagenase vi nấm 12 1.3.2 Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 13 vi nấm 1.3.3 Nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt tính collagenase, 15 protease vi nấm công tác bảo quản lâu dài thi thể ƣớp Chƣơng 1.4 Bộ sƣu tập vi nấm phân hủy chất sinh học Viện 69 16 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU 18 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 18 2.2 Vật liệu nghiên cứu 18 2.2.1 Dụng cụ, trang bị 18 2.2.2 Mơi trƣờng ni cấy, chất, hóa chất 18 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phƣơng pháp phục hồi, lựa chọn chủng vi nấm 18 nghiên cứu 2.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra mức độ khiết chủng vi 18 nấm sau phục hồi kính hiển vi quang học 2.3.3 Phƣơng pháp làm mẫu nấm nghiên cứu kính 20 hiển vi điện tử quét (SEM) JSM-5410LV 2.3.4 Tiến hành xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 21 collagenase theo phƣơng pháp Laster Hankin, S.L Anagnistakis 2.3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu xác định số điều kiện môi trƣờng ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 21 chủng vi nấm 2.3.5.1 Nghiên cứu xác định giá trị pH ức chế khả 21 sinh tổng hợp hoạt tính collagenase chủng vi nấm 2.3.5.2 Nghiên cứu xác định giá trị nhiệt độ môi trƣờng ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 22 chủng vi nấm 2.3.5.3 Nghiên cứu xác định giá trị hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi cấy ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính 22 collagenase chủng vi nấm 2.3.5.4 Nghiên cứu xác định giá trị độ ẩm khơng khí ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 23 chủng vi nấm 2.3.5.5 Nghiên cứu xác định tổ hợp điều kiện môi trƣờng ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 24 chủng vi nấm 2.3.6 Phƣơng pháp thống kê, xử lý số liệu Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 25 3.1 Kết phục hồi lựa chọn chủng nấm sợi nghiên cứu 25 3.2 Kết nghiên cứu xác định giá trị pH ức chế khả 42 sinh tổng hợp hoạt tính collagenase chủng vi nấm 3.2.1 Kết nghiên cứu xác định giá trị pH8 42 3.2.2 Kết nghiên cứu xác định giá trị pH8,5 43 3.2.3 Kết nghiên cứu xác định giá trị pH9 44 3.2.4 Xác định mối tƣơng quan điều kiện pH môi trƣờng nuôi cấy với khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 45 chủng vi nấm nghiên cứu 3.3 Kết nghiên cứu xác định giá trị nhiệt độ môi trƣờng ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 49 chủng vi nấm 3.3.1 Kết nghiên cứu xác định giá trị nhiệt độ 140C 49 3.3.2 Kết nghiên cứu xác định giá trị nhiệt độ 160C 50 3.3.3 Kết nghiên cứu xác định giá trị nhiệt độ 180C 51 3.3.4 Xác định mối tƣơng quan ba điều kiện nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy với khả sinh tổng hợp hoạt tính 52 collagenase 15 chủng vi nấm 3.4 Kết nghiên cứu xác định giá trị hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi cấy ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính 56 collagenase chủng vi nấm 3.4.1 Kết nghiên cứu xác định giá trị hoạt độ nƣớc môi 56 trƣờng 0,6aw 3.4.2 Kết nghiên cứu xác định giá trị hoạt độ nƣớc môi 57 trƣờng 0,65aw 3.4.3 Kết nghiên cứu xác định giá trị hoạt độ nƣớc môi 58 trƣờng 0,7aw 3.5 Kết nghiên cứu xác định giá trị độ ẩm khơng khí ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 60 chủng vi nấm 3.5.1 Kết nghiên cứu xác định giá trị độ ẩm môi trƣờng 60% 60 3.5.2 Kết nghiên cứu xác định giá trị độ ẩm môi trƣờng 70% 61 3.5.3 Kết nghiên cứu xác định giá trị độ ẩm môi trƣờng 80% 62 3.5.4 Xác định mối tƣơng quan ba điều kiện độ ẩm mơi trƣờng khơng khí với khả sinh tổng hợp hoạt tính 63 collagenase 15 chủng vi nấm 3.6 Kết nghiên cứu xác định tổ hợp điều kiện môi 65 trƣờng ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase chủng vi nấm KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ẢNH VI NẤM PHÂN HỦY CƠ CHẤT PHỤ LỤC SỐ LIỆU NGHIÊN CỨU 68 MỤC LỤC HÌNH VÀ BẢNG NỘI DUNG Trang Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo hydroxyproline Hình 1.2 Trình tự xếp acid amỉn phân tử Collagen Hình 1.3 Nghiên cứu hoạt tính collagenase 12 chủng Coccidioides 12 immitis thạch Czapek có 0,5% collagen gân bị type I Hình 3.1 Aspergillus clavato - nanica Batista (T38) 27 Hình 3.2 Aspergillus silvaticus Fennell and Raper (T65) 28 Hình 3.3 Aspergillus asperescens Stolk (T116) 29 Hình 3.4 Aspergillus ustus Thom and Church (D45) 30 Hình 3.5 Acremonium ochraceum Gams (T104) 31 Hình 3.6 Cladosporium cladosporioides(Fres.) de Vries (T44) 32 Hình 3.7 Didymostilbe sp (D132) 33 Hình 3.8 Gloeosporium sp (D160) 34 Hình 3.9 Nectria inventa Pethybridge (D94) 35 Hình 3.10 Penicillium cyaneo - fulvum Biourge (T72) 36 Hình 3.11 Penicillium chrysogenum Thom (T142) 37 Hình 3.12 Penicillium casei Staub (D71) 38 Hình 3.13 Penicillium italicum Wehmer (D100) 39 Hình 3.14 Penicillium citrinum Thom (D148) 40 Hình 3.15 Scopulariopsis chartarum Morton and Smith (D162) 41 Bảng 1.1 Các loại collagen gen cấu trúc Bảng 1.2 So sánh thành phần acid amin collagen loại protein khác Bảng 1.3 Sự phân bố amino acid chuỗi polypeptide Bảng 3.1 Danh sách 15 chủng vi nấm lựa chọn nghiên cứu 26 Bảng 3.2 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 42 collagenase 15 chủng vi nấm pH8 Bảng 3.3 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 43 collagenase 15 chủng vi nấm pH8,5 Bảng 3.4 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 44 collagenase 15 chủng vi nấm pH9 Bảng 3.5 Mối tương quan pH vùng kiềm với khả sinh tổng hợp 45 hoạt tính collagenase 15 chủng vi nấm Bảng 3.6 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 49 collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện 140C Bảng 3.7 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 50 collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện 160C Bảng 3.8 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 51 collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện 180C Bảng 3.9 Mối tương quan ba điều kiện nhiệt độ môi trường nuôi cấy 52 với khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 15 chủng vi nấm Bảng 3.10 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 56 collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện hoạt độ nước môi trường 0,6aw Bảng 3.11 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 57 collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện hoạt độ nước môi trường 0,65aw Bảng 3.12 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt tính 58 collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện hoạt độ nước môi trường 0,7aw Bảng 3.13 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt 60 tính collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện độ ẩm môi trường 60% Bảng 3.14 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt 61 tính collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện độ ẩm môi trường 70% Bảng 3.15 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt 62 tính collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện độ ẩm môi trường 80% Bảng 3.16 Mối tương quan ba điều kiện độ ẩm không khí mơi trường ni cấy với khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 15 chủng 63 vi nấm Bảng 3.17 Kết nghiên cứu xác định khả sinh tổng hợp hoạt 65 tính collagenase 15 chủng vi nấm ĐKTH Bảng 3.18 Giá trị hệ số phân giải collagen 15 chủng vi nấm điều kiện độc lập tương ứng với ĐKTH 66 CÁC CHỮ VIẾT TẮT Aw : Activity water : Hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi cấy RH : Relative humidity: Độ ẩm tƣơng đối mơi trƣờng khơng khí IpH8: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện pH 8,0 IpH8,5: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện pH 8,5 IpH9: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện pH 9,0 Inđ14: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện nhiệt độ 140C Inđ16: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện nhiệt độ 160C Inđ18: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện nhiệt độ 180C Ihd0,6: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi cấy = 0,6 Ihd0,65: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi cấy = 0,65 Ihd0,7: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi cấy = 0,7 Iđâ60: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện độ ẩm tƣơng đối mơi trƣờng khơng khí = 60% Iđâ70: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện độ ẩm tƣơng đối mơi trƣờng khơng khí = 70% Iđâ80: Hệ số phân giải vi nấm điều kiện độ ẩm tƣơng đối mơi trƣờng khơng khí = 80% ĐKTH: Tổ hợp điều kiện môi trƣờng (hay Điều kiện tổ hợp) ĐẶT VẤN ĐỀ Vi nấm tự nhiên phong phú đa dạng Chúng có khả thích nghi mạnh mẽ với điều kiện sống, tồn phát triển điều kiện mơi trƣờng khắc nghiệt, nghèo chất dinh dƣỡng, có chất ức chế, dƣới điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, pH khác Có đƣợc khả vi nấm có khả thích nghi, từ sinh tổng hợp enzyme ngoại bào giúp chúng phân huỷ chất sinh học, sử dụng để tồn tại, phát triển, sinh sản Trong chất sinh học có collagen, loại protein động vật Collagen chiếm tới 25% lƣợng protein động vật có vú Nó bao gồm 29 loại khác thành phần chủ yếu mô liên kết động vật có vú, giúp cho quan có đƣợc khung mình, đồng thời tạo độ bền đàn hồi cho mô, quan tổ chức Collagen thành phần da có tổ chức nhƣ gân, sụn, xƣơng [20] Các nghiên cứu khả sinh tổng hợp hoạt tính enzyme phân huỷ chất sinh học vi nấm nói chung nhƣ phân hủy collagen cho thấy, tính chất chúng thay đổi theo điều kiện môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ, độ ẩm, pH, hoạt độ nƣớc chất, [14-17] Kết nghiên cứu Viện 69 cho thấy tồn lồi vi nấm có khả phát triển gây hƣ hỏng số vật liệu đƣợc xử lý hóa chất bảo quản Nghiên cứu độ bền vững da ƣớp bảo quản dƣới tác động vi nấm có khả sinh proteinase thấy rằng, ly khỏi mơi trƣờng bảo quản, yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, pH thay đổi, xuất loài vi nấm Aspergillus, Penicillium, Cladosporum phát triển bề mặt da ƣớp, làm thay đổi màu sắc da ƣớp, chí phát triển sâu xuống lớp dƣới, gây hƣ hại cấu trúc da [12] Các nghiên cứu khác Viện 69 cho thấy khả sinh tổng hợp hoạt tính enzyme phân hủy chất sinh học phụ thuộc vào điều kiện mơi trƣờng nhƣ, nhiệt độ, độ ẩm khơng khí, pH, hoạt độ nƣớc chất [1,2,8,9,11] Tuy nhiên, chƣa có nghiên cứu có tính chất hệ thống điều kiện môi trƣờng (nhiệt độ, độ ẩm mơi trƣờng, pH, hoạt độ nƣớc chất) có tác động ảnh hƣởng ức chế khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase chủng lồi vi nấm liên quan bảo quản thi thể ƣớp Trong thời gian qua, Viện 69 lƣu giữ đƣợc nhiều chủng vi nấm có khả sinh tổng hợp hoạt tính enzyme phân hủy cao chất khác nhau, có chủng có khả sinh tổng hợp hoạt tính collagenase Đây nguồn chủng vi nấm phục vụ cho nghiên cứu tác hại vi sinh vật thi thể ƣớp bảo quản nhƣ nghiên cứu tìm biện pháp ngăn ngừa tác hại chúng Chính vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu với mục tiêu: - Xác định đƣợc thông số yếu tố pH, hoạt độ nƣớc chất, nhiệt độ, độ ẩm môi trƣờng gây ức chế trình sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 15 chủng vi nấm phân lập đƣợc mơi trƣờng khu vực quảng trƣờng Ba Đình NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phục hồi, lựa chọn 15 chủng vi nấm đại diện, có khả sinh collagenase hoạt tính enzyme tốt từ sƣu tập Viện 69 Xác định yếu tố ảnh hƣởng tới trình phát triển, sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 15 chủng vi nấm điều kiện: - Độ pH môi trƣờng nuôi cấy: 8.0, 8.5, 9.0 (Hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1; độ ẩm khơng khí = 99% ± 1%; nhiệt độ = 250C ± 20C) - Nhiệt độ: 140C, 160C, 180C (Hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1; pH = 7,0 ± 0,2; độ ẩm khơng khí = 99% ± 1%) - Hoạt độ nƣớc: 0,60aw; 0,65aw; 0,70aw (pH = 7,0 ± 0,2; độ ẩm khơng khí = 99% ± 1%; nhiệt độ = 250C ± 20C) - Độ ẩm môi trƣờng khơng khí: 60%; 70%; 80%.(Hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1; pH = 7,0 ± 0,2; nhiệt độ = 250C ± 20C) Xác định tổ hợp điều kiện môi trƣờng (nhiệt độ =160C, RH = 70%, pH = 8,5, aw = 0,65) ảnh hƣởng đến khả phát triển, sinh tổng hợp hoạt tính collagenase 15 chủng vi nấm Từ xác định đƣợc điều kiện tối ƣu gây ức chế trình phát triển, sinh tổng hợp hoạt tính collagenase vi nấm Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc chất collagen Collagen nhóm protein ngƣời động vật, chiếm khoảng 25% lƣợng protein toàn thể Collagen tập trung chủ yếu mơ liên kết thành phần da, gân, xƣơng, dây chằng, sụn Collagen đảm nhận tính co giãn da, bị thối hóa q trình lão hóa, tác động yếu tố lý, hóa, sinh học thể xuất dấu hiệu da nhƣ tăng nếp nhăn, nhão da, săn chắc,…[20] Với da ngƣời, collagen có vai trị đặc biệt quan trọng Collagen chiếm 75% trọng lƣợng khô da, thành phần cấu trúc da Collagen cùng với elastin tạo nên cấu trúc bền vững dẻo dai cho da, nhờ mà da ngƣời đàn hồi, săn giữ đƣợc hình dáng thể Theo lứa tuổi, hàm lƣợng cấu trúc collagen bị thay đổi khả tổng hợp thể giảm cùng với thối hóa tự nhiên collagen da Từ sau tuổi 25, năm collagen thể giảm khoảng 1% khối lƣợng cấu trúc, độ dày, độ chặt chẽ giảm dần Chính mà da khô dần, nhăn nheo, nếp nhăn xuất hiện, nếp nhăn cũ sâu thêm, chùng xuống, hình dáng thể thay đổi Đó hậu lão hóa, thiếu hụt collagen từ da Cũng từ ngƣời ta nghiên cứu chế tạo loại sản phẩm bổ sung collagen cho thể đƣờng uống dùng ngồi [20] Đã có nhiều nghiên cứu bản, sâu collagen mức độ tổng quát nhƣ cấp độ phân tử Hiện ngƣời ta tìm 29 loại (type) colagen xác định đƣợc gen quy định loại collagen (Bảng 1.1) Các collagen typ I, II, III, IV chiếm tới 90% tổng số collagen thể Collagen typ I có da, gân, mạch máu, quan, xƣơng (thành phần xƣơng) Collagen typ II có sụn xƣơng, thành phần sụn Collagen typ III có Collagen typ IV thành phần cấu tạo màng tế bào [20] Collagen có kết cấu phức tạp Phân tử collagen (hay Tropocollagen) sợi dài khoảng 300 nm có đƣờng kính 1,5 nm, đƣợc tạo thành ba chuỗi polypeptit (chuỗi anpha), chuỗi xoắn với tạo nên cấu trúc xoắn collagen, chuỗi polypeptit liên kết với chuỗi liên kết hydro Các chuỗi polypeptit đƣợc tổng hợp tƣơng tự nhƣ protein khác [20] Bảng 1.1: Các loại collagen gen cấu trúc [20] Loại collagen (Type) Gene quy định Loại collagen Gene quy (Type) định I COL1A1 , COL1A2 XVI COL16A1 II COL2A1 XVII COL17A1 III COL3A1 XVIII COL18A1 XIX COL19A1 XX COL20A1 XXI COL21A1 XXII COL22A1 XXIII COL23A1 XXIV COL24A1 IV V VI COL4A1, COL4A4 COL4A5, COL4A6 COL4A2, COL4A3 COL5A1, COL5A2 COL5A3 COL6A1, COL6A2 COL6A3 VII COL7A1 VIII COL8A1, COL8A2 COL9A1, COL9A2 IX COL9A3 X COL10A1 XXV COL25A1 XI COL11A1, COL11A2 XXVI EMID2 XII COL12A1 XXVII COL27A1 XIII COL13A1 XXVIII COL28A1 XIV COL14A1 XXIX COL29A1 XV COL15A1 XXVII COL27A1 Thành phần protein collagen có gần đầy đủ loại acid amin, bao gồm tất 20 loại acid amin (Schrieber Gareis,2007) Thành phần acid amin thay đổi tùy theo nguồn gốc collagen, nhƣng tồn vài tính chất chung cho tất collagen Trong thành phần collagen không chứa cystein trytophan, nhƣng chứa lƣợng lớn glycine (Gly) chiếm khoảng 33% proline (Pro) chiếm tỉ lệ 12% hydroxyproline (Hyp) chiếm tỉ lệ 22% (Theo Balian Bowes 1977) Collagen số protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngồi thành phần collagen cịn chứa khống chiếm tỉ lệ 1% Bảng 1.2 So sánh thành phần acid amin collagen loại protein khác [19] (Số gốc/1000 gốc) Collagen Casein Albumin Glycine 363 30 19 Alanin 107 43 35 Valine 29 54 28 Leucine 28 60 32 Isoleucine 15 49 25 Serin 32 60 36 Threonine 19 41 16 Cystein - Methionine 17 16 Aspstic acid 47 63 32 Glutamic acid 77 153 52 Lycine 31 61 20 Proline Hydroxyproline liên quan tới cấu trúc bậc collagen Những amino acid giúp giới hạn quay khung polypeptide, góp phần tạo nên bền vững cho cấu trúc xoắn ốc bậc Nhóm hydroxyl hydroxylproline đóng vai trò quan trọng bền vững cấu trúc xoắn ốc bậc collagen Polypeptide collagen mà thiếu hydroxylproline tạo nên cấu trúc gấp khúc nhiệt độ thấp không bền vững nhiệt độ thân nhiệt Hydroxyproline acid amin đặc trƣng collagen mà loại protein khác khơng có Hydroxyproline đƣợc hình thành sau trình điều chỉnh proline đƣợc kết hợp vào vị trí Y chuỗi Gly-X-Y Hydroxyproline có cơng thức phân tử C H NO , khác với proline, công thức cấu tạo Hyp có gắn nhóm OH nằm vị trí cacbon gamma, acid amin có vai trò quan trọng ổn định cấu trúc collagen, dẫn xuất proline trình hình thành chuỗi collagen có xúc tác enzyme hydroxylase proline có mặt Vitamin C để giúp bổ sung thêm Oxy, thiếu vitamin C làm chậm trình tổng hợp hydroxyproline, ảnh hƣởng đến trình xây dựng cấu trúc protein gây rối loạn thể Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo hydroxyproline Phân tử collagen bao gồm chuỗi xoắn lại với tạo thành collagen triple-helix tạo thành cấu trúc 3D- mơ hình lý tƣởng cho liên kết hydro chuỗi [27] Mỗi chuỗi triple-helix quay theo chiều kim đồng hồ Triplehelix dài xấp xỉ 300nm chuỗi có khối lƣợng phân tử khoảng 105 kDa [25] Triple-helix đƣợc ổn định liên kết hydro nội chuỗi Trong cấu trúc phân tử collagen, tƣơng tác mạch polypeptide làm cho phân tử có vùng kỵ nƣớc vùng phân cực mang điện tích tạo nên khả háo nƣớc làm trƣơng nở collagen Sự biến tính collagen làm cho cầu nối bị tách phần hoàn toàn gây nên tách rời chuỗi phá hủy liên kết hydro, điều làm cấu trúc triple-helix Mơ hình “ Triple-helice” collagen dựa nghiên cứu tƣợng nhiễu xạ sợi Chuỗi nhiễu xạ sợi thể mức trung bình tồn phân tử collagen, mơ hình đặc trƣng thể xếp lặp lặp lại chuỗi polypeptid, thông thƣờng GlyPro- Hyp Một đặc điểm đặc trƣng collagen xếp đặn amino acid mắt xích chuỗi xoắn ốc collagen Mỗi sợi collagen đƣợc cấu tạo từ ba chuỗi polypeptid nối với giống nhƣ sợi dây thừng Cấu trúc collagen tƣơng tự nhƣ hình xoắn ốc, chuỗi polypeptid collagen đƣợc cấu tạo từ acid amin theo trật tự, thông thƣờng Gly - Pro - Y, Gly - X - Hyp Hình 1.2 Trình tự xếp acid amin phân tử Collagen Trong X, Y đơn vị aminoacid khác nhau, proline (Pro) hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chiều dài chuỗi Glycine chiếm gần 1/3 tổng số amino acid đƣợc phân bố cách đặn vị trí 1/3 xuyên suốt phân tử collagen Do glycine có nhánh phụ nhỏ nên lặp lại cho phép chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với hình thành nên đƣờng xoắn ốc với khoảng trống nhỏ phần lõi Tổng cộng riêng proline, hydroxyproline glycine chiếm 1/2 chuỗi Collagen Các acid amin lại chiếm 1/2 Bảng 1.3 Sự phân bố amino acid chuỗi polypeptide [19] Triple helix Tỷ lệ so với tổng ba (%) Gly - X - X 44 Gly - X - Y 20 Gly - Y - X 27 Gly - Y - Y Collagen chứa đơn vị carbonhydrate, monosaccharide galactose disaccharide glucosylgalactose, liên kết với phần dƣ hydroxylysine thơng qua nhóm hydroxyl chức amino acid Tỷ lệ mono/disaccharide phụ thuộc vào loại collagen tình trạng sinh học Chức đơn vị carbohydrate chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ, nhƣng ảnh hƣởng chúng việc gắn kết phần bên phân tử collagen hình thành nên sợi bán kính sợi đƣợc nghiên cứu Ngoài ra, phân tử collagen có vùng gồm khoảng 9-26 amino acid điểm đầu mút amino hay carboxyl chuỗi Các vùng không sát nhập với cấu trúc xoắn ốc đƣợc gọi telopeptide 1.2 Sơ lƣợc vi nấm trình sản sinh enzyme ngoại bào Nấm (fungi) nhóm lớn, đa dạng sinh giới Hiện nay, có 8.000 chi 80.000 lồi đƣợc mơ tả cơng nhận Tuy nhiên, cịn nhiều lồi khắp nơi giới chƣa đƣợc phát Theo ƣớc tính gần đây, số vào khoảng 1,5 triệu loài [20] Vi nấm có khả phát triển hầu hết dạng sinh thái, sử dụng hầu hết sản phẩm tự nhiên sản phẩm ngƣời làm Chúng sinh vật lý tƣởng sinh trƣởng vùng hoang dã, chúng có khả thay đổi mạnh mẽ để thích nghi với điều kiện sống Sự đa dạng vi nấm không khác biệt hình thái mà cịn đặc điểm sinh lý, sinh hoá chúng Ví dụ, lồi chi Aureobasidium sinh trƣởng nơi nhiệt độ thấp (vùng Antarctica) hịn đá nhiệt độ từ -100C đến -200C, chống chịu nhiệt độ thấp từ 700C đến -800C Nhƣng chi có lồi sinh trƣởng vùng nhiệt đới Phần lớn vi nấm hiếu khí sinh trƣởng hoạt độ nƣớc cao Nhƣng ngƣời ta phát đƣợc vi nấm kỵ khí cỏ cừu phát đƣợc nhiều loài sinh trƣởng đƣợc chất có hoạt độ nƣớc thấp (aw