Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của loài xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.F.) Nees) và loài vân mộc hương (Saussurea costus (Falc.) Lipsch.) ở Việt Nam893

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY MỴ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI XUYÊN TÂM LIÊN (ANDROGRAPHIS PANICULATA (BURM.F.) NEES) VÀ LOÀI VÂN MỘC HƯƠNG (SAUSSUREA COSTUS (FALC.) LIPSCH.) Ở VIỆT NAM Ngành: Hóa học Mã số: 9440112 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Hà Nội – 2021 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS VS Châu Văn Minh PGS.TS Trần Thu Hương Phản biện 1: GS TS Nguyễn Văn Tuyến Phản biện 2: GS TS Nguyễn Hải Nam Phản biện 3: GS TS Nguyễn Đình Thành Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi 09 00 ngày 29 tháng 04 năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 80% dân số sử dụng y học cổ truyền, đặc biệt dược liệu chăm sóc sức khỏe ban đầu Trong q trình nghiên cứu phát triển thuốc, kinh nghiệm sử dụng thuốc dân gian yếu tố quan trọng làm tăng tỷ lệ thành cơng tìm kiếm hợp chất dẫn đường (lead compounds) để tổng hợp thuốc thơng qua việc giảm thời gian, tiết kiệm chi phí độc hại với thể sống Do đó, dược liệu đối tượng thu hút mạnh mẽ quan tâm nhà khoa học giới nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất Theo Từ điển thuốc Việt Nam, loài Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm f.) Nees) sử dụng làm thuốc chữa bệnh như: viêm đường tiết niệu, viêm phổi, huyết áp cao …Trong đó, lồi Vân mộc hương (Saussurea costus (Falc.) Lipsch.) dùng để trị bệnh như: đau mỏi xương khớp, trúng độc, tiểu tiện bế tắc Các nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy hai lồi chứa nhiều lớp chất đáng quan tâm như: terpenoid, flavonoid, iridoid, steroid, alkaloid, anthraquinone, lignan…Các nghiên cứu hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết hợp chất phân lập từ hai lồi có hoạt tính quan trọng như: gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxi hóa, bảo vệ gan,… Do đó, chúng tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học số hoạt tính sinh học lồi Xun tâm liên (Andrographis paniculata (Burm f.) Nees) loài Vân mộc hương (Saussurea costus (Falc.) Lipsch.) Việt Nam” Mục tiêu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học hai loài Xuyên tâm liên (A paniculata) Vân mộc hương (S costus) Đánh giá số hoạt tính sinh học hợp chất phân lập để tìm kiếm hoạt chất tiềm Nội dung luận án Nghiên cứu phân lập hợp chất từ phần mặt đất loài Xuyên tâm liên rễ loài Vân mộc hương Việt Nam Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO số hợp chất phân lập Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào số hợp chất phân lập Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết loài Vân mộc hương loài Xuyên tâm liên Những đóng góp luận án Đây nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai lồi Xun tâm liên (A paniculata) Vân mộc hương (S costus) Việt Nam với kết nghiên cứu sau: • Từ dịch chiết phần mặt đất Xuyên tâm liên, 16 hợp chất (APT1-APT16) phân lập xác định cấu trúc, có 04 hợp chất APT1, APT2, APT7 APT12; hợp chất APT15 lần phân lập từ loài Xuyên tâm liên Việt Nam • Từ dịch chiết rễ Vân mộc hương, 16 hợp chất (SAL116) phân lập xác định cấu trúc, có 02 hợp chất SAL1, SAL2 Các hợp chất SAL4, 5, 10 lần phân lập từ chi Saussurea DC Việt Nam Các hợp chất SAL8, SAL11-13, SAL15 lần phân lập từ lồi Vân mộc hương Việt Nam • Đã tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS 30 hợp chất (SAL1-16, APT1-8, APT11-16) phân lập Kết là, hợp chất SAL2, 3, 6, 9, 10, 12-16 APT11 có biểu hoạt tính, đó, hợp chất SAL6, 10, 16 có hoạt tính mạnh với IC 50 = 7,08 ± 0,34; 2,40 ± 0,06 5,55 ± 0,24 μM; hợp chất SAL3, 12, 14, 15 có hoạt tính trung bình với IC50 = 14,79 ± 1,09 đến 27,29 ± 1,03 μM; hợp chất SAL2, 9, 13 có hoạt tính yếu với IC50 = 33,88 ± 1,02 đến 64,57 ± 1,86 μM Hợp chất APT11 có hoạt tính ức chế tốt với IC 50 = 13,41 ± 0,57 μM • Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 05 dòng tế bào ung thư người: tuyến tiền liệt (LNCaP), gan (HepG2), biểu mô (KB), vú (MCF7) da (SK-Mel-2) 14 hợp chất (APT1-8, APT11-16) Kết là, hợp chất APT11 có hoạt tính trung bình tất 05 dòng tế bào thử nghiệm với IC 50 từ 31,76 ± 2,42 μM đến 45,95 ± 2,92 μM • Đã tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết SAL, APT chủng vi khuẩn gram (-), chủng vi khuẩn gram (+) chủng nấm dải nồng độ 50-200 mg/mL Kết là: dịch chiết SAL, APT có hoạt tính kháng khuẩn M luteus cao đối chứng dương có hoạt tính kháng khuẩn S aureus thấp đối chứng dương (Gentamicin 200 μg/mL) Dịch chi ết SAL có hoạt tính kháng nấm C ablicans thấp đối chứng dương (Ciclopirox olamine 10 μg/mL), dịch chiết APT hoạt tính Dịch chiết SAL APT khơng có hoạt tính kháng khuẩn E coli, B subtilis, P vulgaris, P mirabilis, P aeruginosa S typhi Bố cục luận án Luận án gồm 137 trang với 48 bảng số liệu, 87 hình sơ đồ, 149 tài liệu tham khảo cập nhật đến năn 2020 Bố cục luận án gồm: Mở đầu (2 trang); Chương Tổng quan lĩnh vực nghiên cứu (28 trang); Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu (7 trang); Chương Thực nghiệm (11 trang); Chương Kết thảo luận (86 trang); Kết luận kiến nghị (3 trang); Danh mục cơng trình cơng bố luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (12 trang) NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần đề cập đến ý nghĩa khoa học, mục tiêu nội dung nghiên cứu luận án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU Phần trình bày tổng quan nghiên cứu nước quốc tế thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Xun tâm liên loài Vân mộc hương CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Phần mặt đất loài Xuyên tâm liên thu hái Văn Lâm, Văn Giang, Hưng Yên, Việt Nam vào tháng 4/2016 Rễ loài Vân mộc hương thu hái Sapa, Lào Cai, Việt Nam vào tháng 5/2018 Tên khoa học TS Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật – VAST định tên 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất Phối hợp phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC), sắc ký lỏng trung áp (MPLC) để phân lập hợp chất 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất Các phương pháp vật lý đại sử dụng để xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ đối tượng nghiên cứu, bao gồm phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS, HR-QTOF-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1D, 2D NMR), phổ CD đo độ quay cực ( [ ] ) 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Phần trình bày phương pháp: thử hoạt tính gây độc t ế bào với phương pháp SRB, thử hoạt tính ức chế sản sinh NO đại thực bào RAW264.7 kích thích LPS với phương pháp MTT, thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn, chủng nấm CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 Phân lập chất từ loài Xuyên tâm liên (A paniculata) 3.1.1 Phân lập hợp chất Phần trình bày cụ thể bước ngâm chiết phân lập chất từ phần mặt đất lồi Xun tâm liên (Hình 3.1.1) 3.1.2 Thơng số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập từ loài Xuyên tâm liên (A paniculata) Phần trình bày thơng số vật lý ki ện phổ 16 hợp chất (APT1-APT16) phân lập từ lồi Xun tâm liên, có 04 hợp chất (APT1, APT2, APT7, APT12) (Hình 3.1.1) Xuyên tâm liên (A paniculata) (Bột khô; 2,8 kg) Acetone H n-hexane c.c Column chromatography M Methanol D Dichloromethane W Water E Ethyl acetate rt Room temperature A Ng©m chiết với MeOH (3 lầnx 10L), rt CặnchiếtMeOH (M, 250 g) Bổ sung H 2O (2L) 1.Chiết phân bố lầnluợt víi n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate (3 lÇn x 2L) Cất loại dung môi Cặnn-hexane (H, 50 g) Cặndichloromethane (D, 60 g) CỈnethylacetate (E, g) Líp nc (W,2L) Diaion, c.c M/W (0, 30, 70, 100%) F1 (6,5 g) F2 (5 g) RP18, c.c M/W (1/3) F1.1 F1.2 (0,5 g) Silica gel, c.c D/M(6/1) F1.3 F1.4 (2,6 g) Silica gel, c.c D/M (8/1) APT15 (10 mg) F1.5 (0,5 g) Silica gel, c.c D/M (8/1) RP18, c.c M/W (100/1 - 0/1) F1.6 (0,63 g) F2.1 F2.2 F2.3 APT3 F1.5.1 F1.5.2 F1.5.3 F1.6.4 F1.6.3 F1.6.2 (50 mg) (27 mg) (68 mg) Silica gel, c.c D/A (1/2) APT2 F2.5 Silica gel, c.c E/M/W (7/1/0,1) F1.6.1 (63 mg) Sephadex, c.c M/W (1/1) F1.6.2.1 F1.6.2.2 (30 mg) (36 mg) APT16 (7 mg) F2.5.1 (45 mg) F1.6.1.1 (13 mg) APT5 (4 mg) F1.6.1.2 (7 mg) APT6 (3 mg) Silica gel,c.c D/M (15/1 - 5/1) F2.5.2 F2.5.3 F2.5.4 F2.7.1F2.7.2 F2.7.3 (70 mg) (63mg) (50mg) (85mg) RP18, c.c A/W (1/1,5) RP18, c.c Silica gel, c.c RP18, c.c M/W (1/1) E/M/W (8/1/0,1) M/W (1/1) APT7 (2mg) F2.7 (0,5 g) Silica gel, c.c D/M (11/1) Sephadex, c.c M/W (1/1) APT14 (2mg) APT11 (2,5 mg) Silica gel, c.c D/A(1/2) F2.6 (0,55 g) (1,6 mg) APT8 (6 mg) F2.4 Silica gel, c.c D/M(7/1) RP18, c.c A/W (1/1,2) APT12 (3 mg) APT13 (10 mg) F2.7.4 (46 mg) Silica gel, c.c RP18, c.c A/W (1/1) D/A (1/2) APT9 (7 mg) APT10 (36 mg) F2.7.5.1 (25 mg) F2.7.5 (50mg) RP18, c.c A/W (1/1,5) APT4 (2 mg) Sephadex, c.c M/W(1/1) F2.7.5.2 RP18, c.c M/W (1/1) APT1 (2,8 mg) Hình 3.1.1 Sơ đồ phân lập hợp chất từ lồi Xun tâm liên • Hợp chất Andropanioside A (APT1) Chất bột, màu trắng, độ quay cực [ ]25 : -15,25 (c = 0,05; MeOH), CD (MeOH) mdeg (λ max): -1,25 (217nm), HR-ESI-MS: m/z 519,2568 [M+Na]+ , 1H NMR (CD 3OD, 500MHz): δ (ppm) 0,93 (3H, s, H-20); 1,00 (3H, s, H-18); 1,20 (1H, dd, J = 3,0; 14,5 Hz, H a-3); 1,40 (3H, m, Ha -1/H-5/Ha-6); 1,69(2H, m, H-9/H a-11); 2,20(1H, dd, J =1,5;14,0 Hz, Hb -1); 2,30 (1H, dd, J = 2,5; 14,5 Hz, H b -3); 3,17 (1H, dd, J = 8,0; 9,0 Hz, H-2'); 3,23 (1H, d, J = 11,0 Hz, H a-19); 3,27 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-4'); 3,33 (2H, m, H-3'/H-5'); 3,65 (1H, dd, J = 6,0; 12,0 Hz, H a-6'); 3,88 (1H, dd, J = 2,0; 12,0 Hz, H b -6'); 4,12 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-2); 4,17(1H, d, J=11,0 Hz, H b -19); 4,67(1H, s, Ha-17); 4,91(1H, s, H b -17); 4,34 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1'); 7,36 (1H, s, H-14) 13C NMR (CD 3OD, 125 MHz): δ (ppm) 176,9 (C-16); 148,8 (C-8); 147,6 (C-14); 134,8 (C-13); 107,8 (C-17); 104,9 (C-1'); 78,7 (C-2); 78,2 (C-5'); 77,9 (C3'); 75,5 (C-2'); 72,1 (C-15); 71,8 (C-4'); 66,4 (C-19); 62,7 (C-6'); 58,4 (C-9); 43,5 (C-1); 56,5 (C-5); 40,0 (C-10); 39,6 (C-4); 39,5 (C-3); 39,5 (C-7); 28,1 (C-18); 25,5 (C-12); 25,1 (C-6); 23,3 (C-11);17,5 (C-20) • Hợp chất Andropanioside B (APT2) Chất bột, màu trắng, độ quay cực [ ]25 : -31,7 (c = 0,1; MeOH), CD (MeOH) mdeg (λmax): -1,64 (213 nm), HR-ESI-MS: m/z 521,2718 [M+Na]+ , 1H NMR (500 MHz, CD 3OD): δ (ppm) 0,85 (3H, s, H20);1,04 (3H, s, H-18); 3,19 (1H, dd, J = 8,0; 9,0 Hz, H-2'); 3,26-3,35 (3H, m, H-3',4',5');3,26 (1H, d, J = 9,5 Hz, H a-19); 3,46 (1H, dd, J = 5,5; 12,0 Hz, Ha-17); 3,69 (1H, dd, J = 3,5; 12,0 Hz, H b-17); 3,70 (1H, dd, J = 5,5; 12,0 Hz, Ha-6'); 3,87 (1H, dd, J = 2,0; 12,0 Hz, H b-6'); 4,12 (1H, d, J = 9,5 Hz, H b-19); 4,20 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1'); 7,36 (1H, t, J = 1,5 Hz, H-14) 13 C NMR (125MHz, CD 3OD): δ (ppm) 177,0 (C16); 147,7 (C-14); 134,7 (C-13); 105,1 (C-1'); 78,3 (C-5'); 77,8 (C-3'); 75,3 (C-2'); 73,7 (C-19); 72,1 (C-15); 71,7 (C-4'); 66,3 (C-17); 62,8 (C-6'); 57,3 (C-5); 53,8 (C-9); 43,2 (C-8); 40,1 (C-1);39,3 (C-4); 39,1 (C-10); 37,3 (C-3); 32,5 (C-7); 28,1 (C-11); 28,1 (C-12); 28,1 (C-18); 22,5 (C-6); 19,4 (C-2); 15,4 (C-20) • Hợp chất Andrographic acid methyl ester (APT7) Chất dầu, không màu, độ quay cực [ ]26 : -36,9 (c = 0,04; MeOH), HR-ESI-MS: m/z 401,1931 [M+Na]+, H NMR (CD3 OD, 500MHz): δ (ppm) 0,83 (3H, s, H-20); 1,19 (1H, dt, J = 5,0; 13,5 Hz, H a-1); 1,20 (3H, s, H-18); 1,25 (1H, dd, J = 2,5; 13,0 Hz, H-5); 1,40 (1H, m, H a6); 1,60 (1H, dt, J = 3,5; 13,5 Hz, H b -1); 1,72 (1H, m, H-2); 2,08 (1H, td, J = 5,0; 13,0 Hz, H a -7); 2,43 (1H, m, H-9); 3,37 (1H, d, J = 11,0 Hz, H b-19); 3,41 (1H, m, H-3); 3,70 (3H, s, 15-OMe); 4,14 (1H, d, J = 11,0 Hz, H a-19); 4,57 (1H, d, J = 1,5 Hz, H a-17); 4,75 (1H, d, J = 1,5 Hz, Hb -17); 5,47 (1H, s, H-14); 6,11 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-12); 6,31 (1H, dd, J = 10,0; 16,0 Hz, H-11) 13 C NMR (CD3 OD, 125 MHz): δ (ppm) 175,2 (C-16); 168,4 (C-15);157,8 (C-13); 149,7 (C-8); 140,6 (C-11); 132,3 (C-12); 113,0 (C-14); 109,6 (C-17); 81,3 (C-3); 65,0 (C19); 62,4 (C-9); 55,9 (C-5); 51,7 (15-OMe); 43,8 (C-4); 39,9 (C-10); 39,4 (C-1); 37,8 (C-7); 28,9 (C-2); 24,4 (C-6);23,3 (C-18);16,3 (C-20) • Hợp chất Pashanone glucoside (APT12) Chất bột, màu vàng, độ quay cực [ ]26 : -51,25 (c = 0,08; MeOH), HR-ESI-MS: m/z 485,1414 [M+Na]+ , H NMR (500 MHz, CD OD): δ (ppm) 3,96 (3H, s, 7-OMe); 3,79 (3H, s, 6-OMe); 5,19 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1'); 6,58 (1H, s, H-8); 7,41 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-4''); 7,42 (2H, dd, J = 2,0; 9,0 Hz, H-2'', H-6''); 7,74 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-2); 7,76 (2H, t, J = 9,0 Hz, H-3'', H-5''); 8,12 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-3) 13 C NMR (125MHz, CD3 OD): δ (ppm) 195,3 (C-4); 159,5 (C-7); 158,0 (C-5); 157,2 (C-9); 144,3 (C-2); 136,8 (C-1''); 129,1 (C-3); 132,8 (C-6); 131,3 (C-4''); 130,0 (C- 5''); 130,0 (C-3''); 129,9 (C-2''); 129,9 (C- 6''); 109,3 (C-10); 102,8 (C-1'); 92,8 (C-8); 78,9 (C-5'); 75,1 (C-2');78,5 (C-3');71,6(C-4');62,7 (C-6');61,0 (6-OMe);56,7 (7-OMe) 3.2 Phân lập hợp chất từ loài Vân mộc hương (S costus) 3.2.1 Phân lập hợp chất Phần trình bày cụ thể bước ngâm chiết phân lập chất từ rễ loài Vân mộc hương (Hình 3.2.1) A c.c Acetone Column chromatography D Dichloromethane E Ethyl acetate H n -hexane M Methanol W Water V©n mộc huơng (S costus) (Rễcây khô; 2,5 kg) Chiết siêu âm,1h/1 lần, với MeOH (3 lần x 10L), 50oC Cặn chiÕtMeOH (M, 300 g) Bæsung H2 O (2L) ChiÕt phân bố với n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate (3 lần x 2L) Cấtloại dung môi Cặn n-hexane (H, 60 g) CỈn dichloromethane (D, 20g) Líp nc (W, 2L) CỈnethylacetate (E, g) MPLC D/M (100/1 - 5/1) D1 (5 g) D2 (10 g) Silica gel, c.c H/E (10/1) SAL14 (16 mg) D4 (1,5g) W1 W2 W3 (19 g) Silica gel, c.c H/E (6/1) D2A D2B D2C D2D (0,4 g) 1.Silica gel, c.c H/A (5/1) RP18, c.c M/W (2/1) SAL4 (3 mg) D3 Diaion, c.c M/W (0, 30, 70, 100%) SAL15 (8 mg) D2E (1 g) D2F (1 g) Silica gel, c.c Silica gel, c.c H/A (4/1) H/D/E(1/2/1) RP18, c.c M/W (1,5/1) SAL12 (3 mg) SAL16 (5 mg) SAL3 (3 mg) MPLC, YMC M/W (1/2) W3A W3B W3C W3D W3E W3F (4 g) RP18, c.c M/W (2/1) Silica gel,c.c H/A (2,5/1) SAL13 (4 mg) W3F1 W3G Silica gel, c.c D/M/W (9/1/0,1) W3H (2,5 g) Silica gel, c.c D/M/W (9/1/0,1) W3F2 W3F3 W3F4 W3F5 W3F6 W3H1 W3H2 W3H3 (140 mg) (200 mg) (250 mg)(690 mg)(350 mg)(154 mg) 1.RP18, c.c A/W (1/3) Silica gel, c.c D/M/W (9/1/0,1) SAL5 (3 mg) RP18, c.c RP18,c.c H/A (1/1) A/W (1/3) Silica gel, c.c E/M/W (6/1/0,1) SAL8 (4,5 mg) SAL10 (4 mg) SAL1 (2 mg) Sephadex, c.c M/W (1/1) Silicagel, c.c E/M/W (10/1/0,1) SAL7 (7 mg) W3H4 (89 mg) 1.Silica gel,c.c Sephadex D/M/W (9/1/0,1) M/W (1/1) 2.RP18, c.c A/W (1/2,5) SAL11 (6 mg) SAL2 (1,6 mg) Silica gel, c.c E/M/W (6/1/0,1) Silicagel, c.c H/A (2/1) SAL6 (4 mg) SAL9 (15 mg) Hình 3.2.1 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài vân mộc hương 3.1.2 Thông số vật lý liệu phổ hợp chất phân lập từ loài Vân mộc hương (S costus) Phần trình bày thơng số vật lý ki ện phổ 16 hợp chất (SAL1-SAL16) phân lập từ loài Vân mộc hương, có 02 hợp chất (SAL1, SAL2) • Hợp chất Saussucostusoside A (SAL1) Chất bột, màu trắng, độ quay cực [ ]20 : -23,57 (c = 0,014; MeOH), HR-QTOF-MS: m/z 449,1953 [M+Cl]– , 1H NMR (CD 3OD, 500MHz): δ (ppm) 0,78 (3H, s, H-14); 3,15 (1H, br d, J = 13,0 Hz, H5); 3,2 (1H, m, H-2'); 4,20 (1H, br s, H-3); 4,23 (2H, s, H-12); 4,26 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1'); 4,62 (1H, br s, H a-15); 4,98 (1H, br s, H b15); 5,16 (1H, br s, Ha-13); 5,22 (1H, d, H b -13) 13 C NMR (CD 3OD, 125 MHz): δ (ppm) 157,6 (C-11); 152,2 (C-4); 110,0 (C-15); 108,7 (C-13); 102,1 (C-1ʹ); 83,4 (C-3); 78,3 (C-3ʹ); 78,0 (C-5ʹ); 75,2 (C-2ʹ); 75,0 (C-7); 71,8 (C-4ʹ); 63,1 (C-12); 62,9 (C-6ʹ); 39,6 (C-5); 37,1 (C9);36,9 (C-1);36,4(C-10);35,6 (C-6);32,8(C-8);29,3 (C-2);15,7(C-14) • Hợp chất Saussucostusoside A (SAL2) Chất bột, màu trắng, độ quay cực [ ]20 : -35,0 (c = 0,012; MeOH), HR-QTOF-MS: m/z 447,1813 [M+Cl]– , 1H NMR (CD OD, 500MHz): δ (ppm) 0,76 (3H, s, H-14); 2,58 (1H, brdd, J = 11,0; 11,5 Hz, H-7); 2,78 (1H, m, Hb-3); 3,16 (1H, dd, J = 7,5; 9,0 Hz, H-2'); 4,37 (1H, d, J = 7,5 Hz; H-1'); 4,56 (1H, d, J = 1,5 Hz, H a-15); 4,83 (1H, br s, H b15); 5,13 (1H, br s, Ha-13); 5,67 (1H, d, H b -13) 13 C NMR (CD 3OD, 125 MHz): δ (ppm) 178,0 (C-12); 149,6 (C-4); 149,6 (C-11); 114,9 (C-13); 108,4(C-15); 102,9(C-1ʹ); 78,1(C-5ʹ); 77,8(C-3ʹ); 76,7 (C-2); 75,1(C-2ʹ); 71,7(C-4ʹ); 62,8(C-6ʹ); 50,6 (C-5); 48,5 (C-1); 45,6 (C-3); 42,1 (C-9);41,4 (C-7);36,1 (C-10);30,8 (C-6); 27,9 (C-8); 17,6(C-14) CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài Xuyên tâm liên (A paniculata) Phần trình bày kết phân tích phổ xác định cấu trúc hóa học 16 hợp chất phân lập từ loài A paniculata 15 16 13 20 Glc-O HO 19 10 11 15 O 14 O 16 14 O 12 20 17 Glc-O H 18 APT1 Andropanioside A (mới) 19 10 11 13 12 O 17 OH H 18 APT2 Andropanioside B (mới) 15 14 HO 13 HO Glc-O 16 O 20 10 Glc-O 18 APT3: Andrographiside 15 O 14 HO 19 Glc-O 10 HO HO 10 17 HO 19 Glc-O 20 O 20 HO 19 HO HO APT9: Andrograpanin O HO HO 19 10 OH H 3CO 12 17 Glc-O 1' 10 4' 6' O 12 11 16 17 H 10 HO OCH O 10 O 13 18 H 3CO 18 19 H 14 APT11: Andropanolide H 3CO 14 APT10: Andrographolide 15 18 HO 18 15 11 17 H 17 13 OH 12 APT8: 19-O-β-D-glucopyranosylent-labda-8(17),13-dien-15,16,19triol H 20 20 16 16 12 OH 11 10 19 O O 16 13 10 18 O 18 11 H 13 GlcO 15 14 H 17 10 APT6: 14-deoxy-11,12dihydroandrographiside 14 12 15 APT7: Andrographic acid methyl ester (mới) 3 12 16 O 11 16 O 20 17 19 18 13 OCH 15 OH 11 15 APT5: Andropanoside 20 H O 13 17 14 18 14 12 APT4: Neoandrographolide H O 19 12 11 O 11 10 16 13 20 H 19 16 13 17 O 14 12 11 20 15 O Glc O 6' 4' 1' 3' 2' O APT12 Pashanone glucoside (mới) 3' H 3CO 2' OCH O A 10 O-GlcO O APT13: Andrographidine A 6'' 1'' 4'' B OH 3'' OCH3 OCH3 2'' APT14: Andrographidine F H-17 (δH 4,67) với C-7 (δC 39,5)/C-8 (δC 148,8)/C-9 (δ C 58,4), H2 -19 (δH 3,23/4,17) với C-3 (δC 39,5)/C-4 (δ C 39,6)/C-5 (δ C 56,3) Hình 4.1f Phổ H-1H COSY Hình 4.1g Phổ HMBC giãn rộng APT1 APT1 So sánh với hợp chất phlogantholide-A phân lập từ loài Phlogacanthus thyrsiflorus cho thấy APT1 xuất thêm đơn vị đường vị trí C-2 qua tương tác HMBC proton anome H-1′ (δ H 4,34) với carbon oxymethine C-2 (δC 78,7), điều khẳng định chắn dựa tương tác COSY CH 2-1/H-2/CH 2-3, tương tác HMBC H -20 (δH 0,93) với C-1 (δC 43,5); H 3-18 (δ H 1,00), H 2-19 (δH 3,23/4,17) với C-3 (δC 39,5) Phổ 1H-1 H COSY cho thấy tương tác CH2 -1/H-2/CH2 -3, H-5/CH2 -6/CH 2-7, H-9/CH2 -11/CH2 -12, H-14/CH2 -15 Phổ NOESY cho thấy tương tác H3-18 (δH 1,00) với H-5 (δ H 1,40), H-5 (δH 1,40) với H9 (δH 1,69) chứng tỏ H-5, H-9 H3 -18 có dạng β Tương tác H 2-19 (δ H 3,23; 4,17) với H3 -20 (δ H 0,93) không tương tác với H-2 (δ H 4,12) chứng tỏ H2-19, H 3-20 có dạng α H-2 có dạng β Cấu hình H-2β xác định so sánh với hợp chất 3-oxo2β-hydroxy-14-deoxyandrographolide Phổ CD xuất đỉnh píc 1,25 bước sóng λmax = 217nm chứng tỏ APT1 ent-labdane Hình 4.1h Phổ NOESY giãn rộng APT1 Hình 4.1i Phổ CD APT1 11 15 O 14 13 HO HO HO O 1' O OH HO 19 20 11 16 O 12 17 10 18 Hình 4.1j Các tương tác HMBC, COSY, NOESY APT1 Như vậy, tất kiện nêu, cấu trúc hợp chất APT1 xác định chất nhóm hình 4.1a đặt tên andropanioside A Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR APT1 chất tham khảo # δC δ Ca,b C HSQC δH a,c mult (J=Hz) HMBC 47,5 43,5 CH2 1,40 m/2,20 dd (1,5;14,0) 2, 3, 70,1 78,7 CH 4,12 t (3,5) 1' 40,3 39,5 CH 1,20 dd (3,0; 14,5) 4, 18, 19 2,30 dd (2,5; 14,5) 40,6 39,6 C 55,3 56,5 CH 1,40 m 6, 10, 19, 20 23,6 25,1 CH2 1,40 m / 1,87 m 38,0 39,5 CH2 2,00 m / 2,45 m 146,5 148,8 C 56,2 58,4 CH 1,69 m 10, 11 10 43,8 40,0 C 11 21,7 23,3 CH2 1,69 m / 1,81 m 8, 10 12 24,3 25,5 CH2 2,12 m/2,45 m 9, 13, 14, 16 13 134,3 134,8 C 14 144,3 147,6 CH 7,36 s 13, 15, 16 15 64,6 72,1 CH2 4,83 m 13, 14, 16 16 174,4 176,9 C 17 107,5 107,8 CH2 4,67 s / 4,91 s 7, 8, 18 27,2 28,1 CH3 1,00 s 3, 4, 5, 19 19 64,5 66,4 CH2 3,23d (11,0)/4,17d (11,0) 3, 4, 18 20 16,1 17,5 CH3 0,93 s 1, 5, 9, 10 1' 104,9 CH 4,34 d (8,0) 2' 75,5 CH 3,17 dd (8,0; 9,0) 3' 77,9 CH 3,33* 4' 71,8 CH 3,27 d (9,0) 5' 78,2 CH 3,33* 6' 62,7 CH 3,65 dd (6,0; 12,0) 3,88 dd (2,0; 12,0) # δ C phlogantholide A CDCl3 [Barua A.K., Phytochemistry, 1985, 24, 2037-39], aCD OD, b125MHz, c500MHz,*pic chồng chập 12 4.2 Xác định cấu trúc hoá học hợp chất phân lập từ loài Vân mộc hương (S costus) Phần trình bày kết phân tích phổ xác định cấu trúc hóa học 16 hợp chất phân lập từ loài Vân mộc hương 14 14 GlcO 10 GlcO 12 H 15 HO 15 10 H O 15 11 10 12 GlcO O GlcO O 14 11 15 13 12 H 15 14 OH 10 O 12 11 13 O SAL8: 10β,14-Dihydroxy-11βHguai-4(15)-ene-12,6α-olide-14-O-βD-glucoside 14 O 13 SAL6: Costunolide 13 14 11 12 O H SAL7: Picriside B O O 12 15 10 15 9 O 13 14 11 COOH SAL4: 11β,13-Dihydrosantamarin O 10 15 H SAL5: 11β,13-Dihydroxyreynosin β-D-glucoside OH 14 12 13 SAL3: 4α-Hydroxy-4βmethyldihydrocostol 11 OH14 13 GlcO H SAL2: Saussucostusoside B (mới) 11 12 15 13 10 H 14 10 OH SAL1: Saussucostusoside A (mới) 3 OH 11 10 O 12 HO 11 3' 2' 1' O 4' 13 15 O 10 O 12 O SAL9: Dehydrocostuslactone OH 11 13 SAL10: 3β-[4-Hydroxymethacryloyloxy]-8αhydroxycostunolide 13 14 14 H H H 10 11 O 15 HO OGlc 13 12 H 14 H 15 H 10 O OH 11 13 12 10 H 15 O SAL13: 3α,8α-Dihydroxy-11βH11,13-dihydro dehydrocostuslactone 14 10 15 H O OH 11 HO 10 H 13 12 13 14 H 11 12 SAL14: Mokkolactone H O O 13 SAL12: Sausinlactone A 14 O 11 12 O SAL11: 11β,13-Dihydro dehydrocostuslactone-8-O-β-Dglucoside HO 15 O H 10 15 O 12 11 O 13 O SAL15: 8α-Hydroxy-11βH-11,13SAL16:11β,13-Dihydrozaluzanin C dihydrodehydrocostuslactone Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 5.1.2 Hợp chất SAL1: Saussucostusoside A (hợp chất mới) 14 HO HO HO O O 1' OH 10 OH 11 H 15 SAL1 HO CH OH 12 OH CH2 OH 12 H 13 A HO HO HO O O 1' COOH H 12 OH Youngiajaponicoside D Hình 4.2a Cấu trúc hóa học SAL1, A, Youngiajaponicoside D Hợp chất SAL1 thu dạng chất bột màu trắng Góc quay cực riêng [α]D 20 = -23,57 (c = 0,014; MeOH) Phổ khối lượng phân giải cao (HR-QTOF-MS) xuất píc ion giả phân tử [M+Cl] – m/z 449,1953, tính tốn cho cơng thức C 21H34ClO8− 449,1948 đvC) Như vậy, hợp chất SAL1 có cơng thức phân tử C 21H34 O8 (Mw = 414) 14 Hình 4.2b Phổ HR-QTOF-MS SAL1 Các phổ 1H, 13 C NMR hợp chất SAL1 gợi ý sesquiterpenoid glucoside với tín hiệu proton anome δ H 4,26 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′) gợi ý xuất đơn vị đường β-D-glucose, tín hiệu phổ 13 C NMR δC 102,1 (C-1′); 75,2 (C-2′); 78,3 (C-3′); 71,7 (C-4′); 78,0 (C-5′) 62,9 (C-6′) đặc trưng cho đơn vị đường glucose, số tương tác J proton anome lớn hai proton H-1′, H-2′ vị trí diaxial, chứng tỏ cấu hình β đơn vị đường Hình 4.2c Phổ 1H NMR Hình 4.2d Phổ 13C NMR giãn rộng SAL1 SAL1 Phần aglycone xuất tín hiệu nhóm oxymethine [δC 83,4 (C-3)/δH 4,20], oxycarbon bậc bốn [δ C 75,0 (C-7)], nhóm oxymethylene [δC 63,1 (C-12)/δH 4,23], hai nhóm exomethylene [δ C 152,2 (C-4); 110,0 (C-15)/δ H 4,62; 4,98 δ C 157,6 (C-11); 108,7 (C-13)/δ H 5,16; 5,22], nhóm methyl dạng singlet [δ C 15,7 (C-14)/δH 0,78], carbon bậc bốn [δ C 36,4 (C-10)], nhóm methine [δC 39,6 (C-5)/δH 3,15], năm nhóm methylene [δC 36.9 (C-1)/δ H 1,23; 1,84], [δC 29,3 (C-2)/δ H 1,80; 2,00], [δC 35,6 (C-6)/δH 1,55; 1,6], [δC 32,8 (C-8)/δH 1,56; 1,89] [δ C 37,1 (C-9)/δH 1,30; 1,78] 15 Hình 4.2e Phổ HSQC SAL1 Hình 4.2f Phổ COSY SAL1 So sánh số liệu phổ NMR SAL1 với hợp chất 3α,7α,12trihydroxy-eudesm-4-(15),-11-(13)-diene [137] nhận thấy số liệu phổ tương ứng ngoại trừ xuất thêm đơn vị đường β-D-glucose gắn vị trí C-3 (δC 83,4) nhóm hydroxymethine thay nhóm methylene C-2 Phổ HMBC cho thấy tương tác H-12 (δH 0,78) với C-7 (δC 75,0)/C-11 (δ C 157,6)/C-13(δC 108,7) tương tác H-13 (δ H 5,16; 5,22) với C-7 (δC 75,0)/C-12 (δ C 63,1) khẳng định chắn vị trí nhóm hydroxy C-7 C-12 Vị trí nhóm oxymethine C-3 xác định dựa tương tác HMBC hai proton singlet H-15 (δH 4,62; 4,98) với C-3 (δC 83,4), điều khẳng định chắn thêm qua tương tác COSY CH 2-1/CH2 -2/H-3 Tương tác HMBC proton anome H-1ʹ (δ H 4,26) với carbon oxymethine C-3 (δC 83,4) chứng tỏ vị trí đơn vị đường β-D-glucose C-3 Hình 4.2g: Phổ HMBC SAL1 Hình 4.2h Phổ NOESY SAL1 So sánh với hợp chất 3α,7α,12-trihydroxyeudesm-4(15),11(13)diene (A) nhận thấy số liệu phổ NMR, HMBC, COSY, NOESY vị trí C-6, C-7, C-8, C-11, C-12 C-13 SAL1 tương tự cho phép xác định cấu hình α nhóm hydroxy C-7 Kết hợp hợp chất so sánh (A) tương tác NOESY Hβ -6 (δH 1,64) với H14 (δH 0,78) H β-6 (δ H 1,64) với H-12 (δ H 4,23) cấu hình 16 β Hβ-6, H-14 H-12 Tương tác NOESY H-3 (δ H 4,20) với Hα-2 (δH 2,00) H β -2 (δH 1,80) không tương tác với H-5 (δ H 1,94) cấu hình β H-3, điều khẳng định độ chuyển dịch hóa học C-3 (δ C 83,4)/δ H 4,20 (1H, br s) HO HO HO 14 15 2β O O OH 10 1' 14 OH 12 OH 11 2α 6β 12 13 Hình 4.2i Các tương tác HMBC, COSY, NOESY SAL1 Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR SAL1 chất tham khảo b C aδC HSQC δHc,e mult (J = Hz) δC δC c,d 51,9 37,6 36,9 CH2 1,23 m/1,84 m 68,9 29,2 29,3 CH 1,80 m/2,00 br dd (2,5;13,0) 47,8 83,2 83,4 CH2 4,20 br s 149,9 152,7 152,2 C 44,9 48,9 39,6 CH 3,15 br d (13,0) 36,3 31,4 35,6 CH2 1,55 m/1,64 dd (13,0; 13,5) 75,2 41,5 75,0 CH 32,9 28,8 32,8 CH2 1,56 m/1,89 m 37,5 42,4 37,1 CH2 1,30 m/1,78 m 10 36,2 37,2 36,4 C 11 157,9 149,3 157,6 C 12 63,5 172,2 63,1 C 4,23 s 13 109,4 122,4 108,7 CH2 5,16 br s/5,22 br s 14 17,3 16,8 15,7 CH3 0,78 s 15 108,5 110,2 110,0 CH2 4,62 br s/4,98 br s 103,0 102,1 CH 4,26 d (7,5) 1′ 75,7 75,2 CH 3,20* 2′ 78,8 78,3 CH 3,33* 3′ 71,9 71,8 CH 3,20* 4′ 78,0 78,0 CH2 3,09 m 5′ 63,1 62,9 CH 3,60 dd (6,5; 12,0) 6′ 3,81 dd (2,0; 12,0) a δC 3α,7α,12-trihydroxyeudesm-4(15),11(13)-diene (Ab) CD3OD [Wang H.B., J Nat Prod., 2005, 68, 762-65], δC youngiajaponicoside D CD 3OD [Chen W., Planta Med., 2006, 72, 143-150], cCD3OD, d125 MHz, e500 MHz *pic chồng chập Như vậy, cấu trúc hợp chất SAL1 xác định chất nhóm hình 4.2a 3α-(β-D-gluco-pyranosyloxy)-eudesma-4(14), 11(13) dien-7α, 12-diol đặt tên saussucostusoside A 17 4.3 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 4.3.1 Kết sàng lọc số hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ loài Vân mộc hương (S costus) loài Xuyên tâm liên (A paniculata) Đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS 16 mẫu SAL1-16 loài Vân mộc hương thực mục 2.2.3 Bảng 4.3.1.1 % Ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS SAL1-16 nồng độ 30, 100 µM Nồng độ % Ức Sai % TB Tên mẫu Sai số (µM) chế a số sống sót Kiểm sốt 100,00 1,13 >100,00 0,15 LPS 0,00 0,90 100,00 0,13 30 21,33 0,72 >100,00 2,32 SAL1 100 23,70 0,72 >100,00 2,51 68,55 30 1,56 79,02 0,94 SAL2 100 1,04 2,04 82,39 58,39 30 44,03 1,06 >100,00 1,40 SAL3 77,36 100 0,87 >100,00 0,66 30 23,27 2,25 >100,00 2,11 SAL4 100 40,88 0,60 >100,00 0,49 30 43,13 1,93 >100,00 2,23 SAL5 100 27,01 1,97 >100,00 1,42 > 100,00 30 0,53 96,46 1,44 SAL6 100 0,40 1,34 93,84 5,66 30 11,37 0,72 >100,00 1,44 SAL7 100 46,92 0,20 >100,00 1,88 30 27,96 1,31 >100,00 2,77 SAL8 100 31,28 1,64 >100,00 1,84 93,36 30 0,20 >100,00 1,37 SAL9 100 1,25 0,45 99,34 44,87 96,86 35,42 30 0,20 0,23 SAL10 86,16 4,93 100 0,35 0,50 30 30,33 0,69 >100,00 2,87 SAL11 100 35,07 1,06 >100,00 1,47 30 44,65 0,35 >100,00 2,62 SAL12 78,62 100 2,61 >100,00 1,99 30 37,74 0,40 >100,00 1,68 SAL13 100 0,20 >100,00 1,38 50,94 59,12 30 1,22 >100,00 2,37 SAL14 77,99 100 0,40 91,53 1,64 30 38,99 1,83 >100,00 2,47 SAL15 80,50 100 0,69 >100,00 2,09 30 0,60 89,54 1,31 72,96 SAL16 91,19 100 0,20 60,18 0,17 0,3 25,85 2,12 86,47 0,21 b Cardamonin 3,0 86,93 0,96 71,80 0,51 b Chất đối chứng dương; a Các thí nghiệm tiến hành lần 18 Kết đánh giá sơ ảnh hưởng 16 hợp chất (SAL1-16) đến phát triển tế bào RAW264.7 cho thấy, nồng độ 100 µM, hợp chất SAL2, 3, 6, 9, 10, 12-16 có khả ức chế >50% sản sinh NO t ế bào RAW264.7 Đánh giá hoạt tính ức chế sinh sản NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS 14 hợp chất APT1-8, APT11-16 loài Xuyên tâm liên thực mục 2.2.3 Bảng 4.3.1.2 % Ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS APT1-8, APT11-16 nồng độ 30, 100 µM Nồng độ % Ức Sai % TB Tên mẫu Sai số (µM) chế a số sống sót Kiểm sốt 100,00 1,13 >100,00 0,15 LPS 0,00 0,90 100,00 0,13 30 25,16 1,22 >100,00 2,64 APT1 100 33,33 1,83 95,07 1,21 30 18,9 0,60 >100,00 1, 32 APT 100 35,10 1,00 >100,00 1,56 30 27,04 0,20 >100,00 1,97 APT3 100 32,70 0,53 >100,00 1,06 30 15,97 0,87 94,89 2,53 APT4 100 43,93 0,69 91,40 2,01 30 4,20 0,40 97,34 2,48 APT5 100 20,60 1,50 92,03 2,15 30 8,30 0,70 99,21 2,26 APT 100 32,90 1,30 96,74 1,98 30 28,93 1,40 98,89 2,23 APT7 100 31,45 0,92 91,37 1,48 30 28,30 0,53 91,46 2,31 APT8 100 30,19 0,53 90,03 2,27 30 1,31 1,24 88,68 34,95 APT11 100 0,20 1,01 90,57 12,65 30 96,99 1,93 APT12 100 49,06 1,64 90,14 1,96 30 37,74 0,42 >100,00 1,68 APT13 100 40,94 0,21 >100,00 1,34 30 29,12 1,32 >100,00 2,27 APT14 100 35,99 0,30 96,53 1,44 30 18,99 1,53 >100,00 2,17 APT15 100 30,50 0,19 >100,00 2,02 30 22,96 0,65 99,54 1,11 APT16 100 41,19 0,23 90,18 0,13 0,3 28,9 0,80 86,47 0,21 Cardamonin b 3,0 89,9 0,20 71,80 0,51 b Chất đối chứng dương; a Các thí nghiệm tiến hành lần 19 Kết sàng lọc cho thấy, nồng độ 30 100 µM, 13 hợp chất (APT1-8, 12-16) có % ức chế 50% với giá trị 88,69 ± 1,31 90,57 ± 0,20 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 14 hợp chất APT1-8, APT11-16 loài Xuyên tâm liên 05 dòng tế bào ung thư: tuyến tiền liệt (LNCaP), gan (HepG2), biểu mô (KB), vú (MCF7) da (SKMel-2) theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro thực mục 2.2.3 Bảng 4.3.1.3 Kết sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào hợp chất APT1-8, APT11-16 năm dòng tế bào thử nghiệm Hợp chất Nồng độ % Ức chế phát triển tế bào ung thư a (µg/ml) LNCaP HepG2 KB MCF7 SK-Mel-2 APT1 100 18,32 12,60 17,77 19,23 21,32 20 10,65 5,77 15,38 11,02 7,38 APT2 100 4,85 6,16 1,16 0,04 4,70 20 -1,82 3,75 -6,72 -3,86 -8,11 APT3 100 11,56 12,54 6,16 16,25 10,48 20 6,02 2,96 4,70 9,04 4,71 APT4 100 10,61 8,54 6,67 11,57 12,74 20 3,22 4,76 4,64 9,89 1,70 APT5 100 2,65 6,32 0,19 8,23 3,03 20 -5,76 -0,27 -16,84 -1,45 -8,37 APT6 100 16,74 20,45 9,85 11,71 19,91 20 2,05 8,36 6,58 9,23 10,54 APT7 100 19,05 23,54 16,19 19,42 16,39 20 4,61 10,90 6,35 8,02 9,25 APT8 100 3,81 12,74 16,96 12,25 14,56 20 0,12 4,02 11,08 7,36 6,01 APT11 79,57 74,18 80,58 75,38 79,94 100 20 46,30 36,97 38,82 31,55 35,35 APT12 100 19,32 19,91 21,43 12,15 19,34 20 4,25 5,16 1,13 0,44 4,50 APT13 100 21,66 17,34 7,11 15,52 13,48 20 3,02 2,76 1,70 8,01 6,17 APT14 100 12,63 8,45 7,16 10,75 11,47 20 4,12 4,77 3,64 8,98 2,07 100 18,54 27,64 24,83 29,20 31,01 APT15 20 4,46 12,83 20,70 17,28 12,75 APT16 100 12,35 17,08 10,11 11,65 3,98 20 3,76 6,84 0,35 4,77 -1,65 Ellipticine b 10 95,29 95,53 97,52 97,56 97,73 79,25 71,26 71,32 78,32 75,36 b Chất đối chứng dương; a Các thí nghiệm tiến hành lần Kết bảng 4.3.1.3 cho thấy, nồng độ 100μM có hợp chất APT11 có % ức chế phát triển năm dòng tế bào ung thư thử nghiệm >50% với giá trị khoảng 74,18-80,58% 20 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hai dịch chiết SAL APT 08 chủng vi khuẩn (E coli, S typhi, P mirabilis, P vulgaris, P aeruginosa, S aureus , B subtilis , M luteus) 01 chủng nấm C albicans thực mục 2.2.3 Bảng 4.3.1.4 Kết sàng lọc hoạt tính kháng VSV SAL/APT Vịng kháng khuẩn (mm) Chủng VSV Gentamicin SAL/APT SAL/APT SAL/APT 200µg/ml 50 mg/ml 100mg/ml 200mg/ml P aeruginosa 145/100 0 M luteus 60/45 75/80 80/70 50/45 E coli 80/50 0 B subtilis 45/50 0 10 P mirabilis 40/40 0 S typhi 45/50 0 P vulgaris 90/50 0 S aureus 35/25 45/35 45/35 130/130 Ciclopiroxolamine 10 µg/ml 50/0 75/0 70/0 C albicans 100/100 Kết luận từ bảng 4.3.1.4 cho thấy: Ở dải nồng độ 50-200 mg/ml, dịch chiết SAL, APT có hoạt tính kháng khuẩn M luteus cao có hoạt tính kháng khuẩn S.aureus thấp Gentamicin Dịch chiết SAL có hoạt tính kháng nấm C.ablicans thấp Ciclopirox olamine, dịch chiếtAPT khơng có hoạt tính Dịch chiết SAL, APT khơng có hoạt tính kháng vi khuẩn thử nghiệm lại Từ kết sàng lọc cho thấy hợp chất phân lập từ hai loài Vân mộc hương Xun tâm liên có hoạt tính ức chế sản sinh NO gây độc tế bào, khơng có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Do đó, chất tiếp tục thí nghiệm nồng độ khác xác định giá trị IC 50 để đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO gây độc tế bào 4.3.2 Kết thử hoạt tính ức chế sản sinh NO gây độc tế bào hợp chất phân lập từ loài Vân mộc hương (S costus) loài Xuyên tâm liên (A paniculata) Bảng 4.3.2.1 Kết đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS SAL2-16 Hợp chất Giá trị IC50 (µM )a Hợp chất Giá trị IC50 (µM ) a 52,48 ± 1,25 27,29 ± 1,03 SAL2 SAL 12 SAL SAL 13 23,44 ± 0,94 64,57 ± 1,86 SAL6 SAL 14 7,08 ± 0,34 23,93 ± 0,92 14,79 ± 1,09 SAL 33,88 ± 1,02 SAL 15 SAL 10 b 2,40 ± 0,06 SAL 16 5,55 ± 0,24 Cardamonin 2,12 ± 0,04 b Chất đối chứng dương; a Các thí nghiệm tiến hành lần 21 Kết đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO cho thấy hợp chất SAL6, 10, 16 thể hoạt tính ức chế mạnh với giá trị IC 50 7,08 ± 0,34; 2,40 ± 0,06 5,55 ± 0,24μM Đáng ý, tác dụng hợp chất SAL10 tương đương với tác dụng cardamonin với giá trị IC50 2,12 ± 0,04μM Các hợp chất SAL3, 12, 14, 15 có hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC50 từ 14,79 ± 1,09 đến 27,29 ± 1,03μM Các hợp chất SAL2, 9, 13 có hoạt tính yếu với giá trị IC50 t 33,88 ± 1,02 đến 64,57 ± 1,86μM Các hợp chất khung eudesmane (SAL1-5) germacrene (SAL6-7) có tác dụng tương tự Hợp chất SAL10, với diện nhóm O- [4-hydroxy methacrylate] C-3, cho thấy tác dụng ức chế mạnh Bảng 4.3.2.2 % Ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS APT11 nồng độ 3, 10 µM Nồng độ % ức chế Sai số % TB Tên mẫu Sai số (µM) sống sót 51,09 0,90 68,67 1,06 APT11 10 1,25 64,18 0,17 65,99 Cardamonin 35,78 0,58 96,54 0,67 84,04 0,56 81,80 0,69 Kết bảng 4.3.2.2 cho thấy, nồng độ 10 µM, hợp chất APT11 có % ức chế >50% sản sinh NO tế bào RAW264.7 với giá trị 51,09±0,90 65,99±1,25 Do đó, APT11 tiếp tục thí nghiệm để xác định giá trị IC50 Kết hợp chất APT11 có hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC 50 13,41 ± 0,57μM Bảng 4.3.2.3 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất APT11 năm dòng tế bào thử nghiệm nồng độ 4, 0,8μg/mL Hợp Giá trị IC 50 (µg/ml) chất LNCaP HepG2 KB MCF7 SK-Mel-2 APT11 31,76±2,43 43,50±4,30 37,89±2,68 45,95±2,92 42,15±5,59 Ellipticine 0,45±0,07 0,48±0,08 0,46±0,02 0,43±0,06 0,51±0,07 Kết bảng 4.3.2.3 cho thấy, hợp chất APT11 thể hoạt tính trung bình tất năm dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 31,76 ± 2,43 đến 45,95 ± 2,92 μM KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trong q trình thực luận án này, chúng tơi thu kết nghiên cứu loài Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm f.) Nees) Vân mộc hương (Saussurea costus (Falc.) Lipsch.) Việt Nam sau: 22 Nghiên cứu thành phần hóa học Sử dụng kết hợp phương pháp sắc ký phổ đại phân lập xác định cấu trúc 32 hợp chất từ hai loài Xuyên tâm liên Vân mộc hương Cụ thể là: Từ phần mặt đất loài Xuyên tâm liên phân lập xác định cấu trúc 16 hợp chất (APT1-16) bao gồm 11 hợp chất diterpenoid (APT1-11), 03 hợp chất flavonoid (APT12-14) 02 hợp chất iridoid (APT15-16) Trong đó: • 04 hợp chất mới: đặt tên andropanoside A (APT1), andropanoside B (APT2), andrographic acid methyl ester (APT7) pashanone glucoside (APT12) • 12 hợp chất biết: andrographiside (APT3), neoandrographolide(APT4), andropanoside(APT5), 14-deoxy-11,12dihydroandrographiside (APT6), 19-O-β-D-glucopyranosyl-entlabda-8(17),13-dien-15,16,19-triol (APT8), andrograpanin (APT9), andrographolide (APT10), andropanolide (APT11), andrographidine A (APT13), andrographidine F (APT14), 6-epi-8-O-acetyl-harpagide (APT15), curvifloruside F (APT16) Trong đó, APT15 lần phân lập từ loài Xuyên tâm liên (A paniculata) Việt Nam Từ rễ loài Vân mộc hương phân lập xác định cấu trúc 16 hợp chất sesquiterpene (SAL1-16) bao gồm 05 hợp chất khung eudesmane (SAL1-5), 02 hợp chất khung germacrane (SAL6-7), hợp chất khung guiane (SAL8-16) Trong đó: • 02 hợp chất mới: đặt tên saussucostusoside A (SAL1) saussucostusoside B (SAL2) • 14 hợp chất biết: 4α-hydroxy-4β-methyldihydrocostol (SAL3), 11β,13-dihydrosantamarin (SAL4), 11β,13-dihydroxyreynosin-β-D-glucoside (SAL5), costunolide (SAL6), picriside B (SAL7), 10β,14-dihydroxy-11βH-guai-4(15)-ene-12,6α-olide-14-Oβ-D-glucoside (SAL8), dehydrocostuslactone (SAL9), 3β-[4hydroxymethacryloyloxy]-8α-hydroxycostunolide (SAL10), 11β,13dihydrodehydrocostuslactone-8-O-β-D-glucoside (SAL11), sausinlactone A (SAL12), 3α,8α-dihydroxy-11βH-11,13-dihydrodehydro-costuslactone (SAL13), mokkolactone (SAL14), 8αhydroxy-11βH-11,13-dihydrodehydro-costuslactone (SAL15), 11β, sss13 -dihydrozaluzanin C (SAL16) Trong đó, SAL4, 5, 10 l ần phân lập từ chi Saussurea DC Việt Nam SAL8, 11-13, 15 lần phân lập từ loài Vân mộc hương Việt Nam 23 Nghiên cứu hoạt tính sinh học Đã tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS 16 hợp chất (SAL1-16) phân lập từ loài Vân mộc hương 14 hợp chất (APT1-8, 11-16) phân lập từ loài Xuyên tâm liên Kết cho thấy, hợp chất SAL2, , 6, 9,10, 12-16 có biểu hoạt tính, cụ thể hợp chất SAL6, 10, 16 thể hoạt tính ức chế mạnh với giá trị IC50 7,08 ± 0,34; 2,40 ± 0,06 5,55 ± 0,24 μM, hợp chất SAL10 có hoạt tính ức chế mạnh 2,40 μM so với chất đối chứng dương cardamonin (IC50 = 2,12 μM) Các hợp chất SAL3, 12, 14, 15 có hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC50 từ 14,79 ± 1,09 đến 27,29 ± 1,03 μM Các hợp chất SAL2, 9, 13 có hoạt tính ức chế yếu với giá trị IC 50 nằm khoảng từ 33,88 ± 1,02 đến 64,57 ± 1,86 μM Trong hợp chất APT đem thử nghiệm, hợp chất APT11 có hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC 50 13,41 ± 0,57 μM Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP), ung thư gan (HepG2), ung thư biểu mô (KB), ung thư vú (MCF7) ung thư da (SK-Mel-2) 14 hợp chất (APT1-8, 11-16) phân lập từ loài Xuyên tâm liên Kết cho thấy, có hợp chất APT11 có hoạt tính trung bình tất 05 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 31,76 ± 2,42 μM đến 45,95 ± 2,92 μM Đã tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết SAL, APT chủng vi khuẩn gram (-), chủng vi khuẩn gram (+), chủng nấm dải nồng độ 50-200 mg/mL Kết là: SAL, APT có hoạt tính kháng khuẩn M luteus cao có hoạt tính kháng khuẩn S aureus thấp Gentamicin SAL có hoạt tính kháng nấm C ablicans thấp Ciclopirox olamine, APT khơng có hoạt tính SAL, APT khơng có hoạt tính kháng khuẩn E.coli, B.subtilis, P.vulgaris, P.mirabilis, P.aeruginosa, S.typhi KIẾN NGHỊ Trên sở kết thu được, kiến nghị: Hợp chất SAL10 thể hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào RAW264.7 kích thích LPS với giá trị IC50 = 2,40 ± 0,06 μM Do vậy, cần nghiên cứu sâu hoạt tính kháng viêm hợp chất để định hướng cho thực nghiệm in vivo Mở rộng nghiên cứu hoạt tính khác hợp chất phân lập từ hai loài khuôn khổ luận án để định hướng cho nghiên cứu 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Nguyen Thi Thuy My, Tran Thi Hong Hanh, Pham Thi Cham, Nguyen Xuan Cuong, Tran Thu Huong, Tran Hong Quang, Nguyen Hoai Nam, Chau Van Minh (2020) Andropaniosides A and B, two new ent-labdane diterpenoid glucosides from Andrographis paniculata Phytochemistry Letters, 35, 37-40 (SCI-E) Tran Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Thuy My, Pham Thi Cham, Tran Hong Quang, Nguyen Xuan Cuong, Tran Thu Huong, Nguyen Hoai Nam, and Chau Van Minh (2020) Diterpenoids and Flavonoids from Andrographis paniculata Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 68(1), 96-99 (SCIE) Tran Thi Hong Hanh, Pham Thi Cham, Nguyen Thi Thuy My, Nguyen The Cuong, Nguyen Hai Dang, Tran Hong Quang, Tran Thu Huong, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam & Chau Van Minh (2021) Sesquiterpenoids from Saussurea costus Natural Product Research, 35 (9), 13991405 (SCI-E) ... tế thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Xuyên tâm liên loài Vân mộc hương CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Phần mặt đất loài Xuyên tâm liên thu hái Văn... Đây nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai lồi Xun tâm liên (A paniculata) Vân mộc hương (S costus) Việt Nam với kết nghiên cứu sau: • Từ dịch chiết phần mặt đất Xuyên tâm liên, ... (Saussurea costus (Falc.) Lipsch.) Việt Nam” Mục tiêu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học hai loài Xuyên tâm liên (A paniculata) Vân mộc hương (S costus) Đánh giá số hoạt tính sinh học hợp chất