Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây chóc máu (salasia chinensis L.) học dây gối(celastraceae) và cây ngọc nữ biển (clerodendrum inerme gaertn.) Họ cỏ roi ngựa(verbenaceae)986

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -TRẦN THỊ MINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY CHĨC MÁU (SALACIA CHINENSIS L.) HỌ DÂY GỐI (CELASTRACEAE) VÀ CÂY NGỌC NỮ BIỂN (CLERODENDRUM INERME GAERTN.) HỌ CỎ ROI NGỰA (VERBENACEAE) Chun ngành: Hóa Hữu Mã số: 62.44.27.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2010 Cơng trình hồn thành tại: Trường ðại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH Trần Văn Sung PGS TS Vũ ðào Thắng Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Văn ðậu Phản biện 2: PGS TS ðỗ ðình Rãng Phản biện 3: GS TS Phạm Xuân Sinh Luận án ñược bảo vệ trước Hội ñồng chấm luận án cấp Nhà nước họp tại: Phòng 318-C1, Trường ðại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi 14 ngày 10 tháng năm 2010 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc Gia - Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ðại học Bách khoa Hà Nội Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung (2009), Chemical constituents of Salacia chinensis L growing in Vietnam, Journal of Chemistry of Vietnam, Vol.47(2A), pp.469-473 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung (2009), Chemical constituents from Clerodendrum inerme species in Viet Nam, Traditional and Alternative Medicine (Research & Policy Perspectives), pp 170-174 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung (2008), Study on chemical constituents of Salacia chinensis L collected in Vietnam, Z Naturforsch., Vol 63b, No 12, pp 1411-1414 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung (2008), Triterpenes from Salacia chinensis L collected in Quang Binh Province, Viet Nam, International Scientific conference on “Chemistry for development and Integration”, Hanoi, pp 397-402 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, Tran Van Sung (2008), Study on chemical constituents of Salacia chinensis L collected in Thua Thien Hue, Journal of Chemistry of Vietnam, Vol.46(1), pp.47-51 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ ðào Thắng, Trần Văn Sung (2008), Một số kết nghiên cứu thành phần hóa học Ngọc nữ biển Việt Nam (Clerodendrum inerme), Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hóa Dược tồn Quốc lần thứ I, Hà Nội 12/2008, Tr 285-290 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ ðào Thắng, Trần Văn Sung (2007), Bước đầ u nghiên cứu thành phần hóa học thă m dị hoạ t tính sinh học Ngọc nữ biể n (Clerodendrum inerme) Việt Nam, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hố học Hữu toàn quốc, Hà nội 10/2007, Tr.460-464 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ ðào Thắng, Trần Văn Sung (2007), Andrograholid lupenyleste t Ngọc nữ biể n Việt Nam (Clerodendrum inerme Gaernt.), Tạp chí Hóa học, T.45 (6A), Tr 166-170 A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Ý nghĩa luận án Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.) họ Celastraceae Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) họ Verbenaceae hai ñược dân gian sử dụng thuốc ñể chữa bệnh: tiểu ñường, ung thư, viêm khớp, phong thấp, trợ tim, kháng khuẩn, ñau dày, sốt rét, viêm gan …[1, 2] Trên giới, có số cơng trình cơng bố hóa học hoạt tính chữa bệnh tiểu đường lồi Salacia chinensis L [7, 29, 30, 51, 52, 53, 57, 93, 95] Các nghiên cứu hóa học hoạt tính kháng viêm, tác dụng ức chế sinh trưởng phát triển côn trùng số chất phân lập từ Clerodendrum inerme Gaertn cơng bố [11, 12, 18, 36, 37, 46, 66, 67, 76, 82, 84] Tuy nhiên, Việt Nam hai ñược sử dụng dân gian ñể làm thuốc chữa bệnh mà chưa nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học Vì vậy, nhiệm vụ luận án đặt vấn đề nghiên cứu cách hệ thống hóa học hoạt tính sinh học hai trên, nhằm góp phần định hướng nghiên cứu sử dụng loài Việt Nam Mục tiêu luận án ● Thu thập mẫu, xác ñịnh tên khoa học hai nghiên cứu ● Phân lập xác định cấu trúc hóa học chất có Chóc máu (Salacia chinensis L.) Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) Việt Nam ● Bước đầu thăm dị hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hoạt tính gây độc tế bào ung thư dịch chiết chất phân lập ñược từ hai Những ñóng góp luận án Cây Chóc máu thu Thừa Thiên Huế, Quảng Bình Ngọc nữ biển thu Thái Bình lần nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Việt Nam 3.1 Từ cành Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu Thừa Thiên Huế, ñã phân lập xác định cấu trúc hóa học chất ñó triterpen khung lupan, hopan daucosterol Trong ñó axit 28-hydroxy-3-oxo-30-lupanoic (S5) chất 3-oxo-30-lupanal (S1) chất lần ñầu tiên phân lập từ thiên nhiên 3.2 Từ cành Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu Quảng Bình, phân lập xác ñịnh ñược cấu trúc hóa học 13 chất, ñó triterpen khung friedelan (8 chất), betulin, 14-taraxeren-3β-ol (S8), quercitrin (SF1), mangiferin (SF2) daucosterol (121) Trong hai chất 7α,21α-dihydroxyfriedelan-3-on (SCE1) 7α,29-dihydroxy friedelan-3-on (SCE3) hai chất 3.3 Từ Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) thu Thái Bình, phân lập năm chất, bao gồm: 20(29)-lupen-3β-O-yl hexacosanoat (CE1), stigmast-5-en-3β-ol (CE2), acacetin (CE3), apigenin (CE4) andrographolid (CE5) ðây lần ñầu tiên chất CE1 CE5 ñược phân lập từ 3.4 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh dịch chiết từ hai nghiên cứu cho thấy: Dịch chiết methanol thân Chóc máu Quảng Bình có hoạt tính mạnh chủng Sa, dịch chiết ethyl axetat Ngọc nữ biển có phản ứng dương tính hầu hết chủng đem thử 3.5 ðã thử hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư bốn dòng (MCF7, Hep-G2, LU, KB) 10 chất phân lập từ hai nghiên cứu kết cho thấy: • Andrographolid (CE5, 130) có khả ức chế phát triển tế bào ung thư phổi (LU) với giá trị IC 50 = 4,32µg/ml có khả ức chế phát triển dòng tế bào lại IC 50 = 11,09 20,00àg/ml ã Ch t mi 124 (SCE1) có khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm giá tr IC 50 = 16,22 27,35àg/ml ã Cht mi 120 (S5) khả ức chế phát triển dòng tế bào thử nghiệm rõ rệt dịng LU (IC 50 = 25,77 µg/ml) ðây lần nghiên cứu hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư chất andrographolid, 7α,21α-dihydroxyfriedelan-3-on axit 28-hydroxy-3-oxo-30-lupanoic cơng bố Bố cục luận án Luận án gồm 130 trang với chương, 12 bảng, 27 hình, sơ đồ, 99 tài liệu tham khảo (tiếng Việt: 7, tiếng Anh: 92) phụ lục gồm 93 hình (92 hình phổ, trang ảnh thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư) Luận án ñược bố cục sau: mở ñầu: trang, tổng quan: 27 trang, phương pháp nghiên cứu: trang, thực nghiệm: 23 trang, kết thảo luận: 62 trang, kết luận: trang, tài liệu tham khảo: 11 trang, danh mục cơng trình liên quan đến luận án: trang B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1: Tổng quan Trong phần tổng quan, luận án ñã tổng kết cơng trình nghiên cứu nước giới ñặc ñiểm thực vật, ứng dụng y học cổ truyền, thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai Salacia chinensis L Clerodendrum inerme Gaertn Tóm tắt đặc trưng cấu trúc hóa học hoạt tính bật chất từ hai ñối tượng nghiên cứu Tổng quan hóa học hoạt tính sinh học lớp chất triterpen, thành phần hóa học chủ yếu Salacia chinensis L 1.1 Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.), họ Celastraceae 1.1.1 Cây Chóc máu Cây Chóc máu thu Ấn ðộ Thái Lan ñã ñược nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học Các cơng trình cơng bố cho thấy thành phần hóa học chủ yếu Chóc máu triterpen với khung khác Các megastigman glycosid, eudesman-sesquiterpen, flavon, mangiferin, salacinol, kotalanol tìm thấy từ Một số chất phân lập từ Chóc máu có khả chữa bệnh tiểu đường chống ung thư 1.1.2 Các hợp chất triterpen Phần giới thiệu phân loại, dạng cấu trúc sinh tổng hợp triterpen, lớp chất chủ yếu tìm thấy Chóc máu Tổng quan kết nghiên cứu gần hoạt tính sinh học hợp chất triterpen như: hoạt tính kháng viêm, hoạt tính chống ung thư khối u, hoạt tính kháng virus, kháng khuẩn 1.2 Cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.), họ Verbenaceae Các kết nghiên cứu giới cho thấy Ngọc nữ biển có thành phần hố học ña dạng, chất phân lập ñược thuộc nhiều lớp chất khác như: terpenoid, steroid, flavonoid Các neoclerodan diterpenoid phân lập ñược từ ñều thể hoạt tính gây ngán ăn ức chế sinh trưởng phát triển côn trùng Chương 2: Phương pháp nghiên cứu Chương giới thiệu phương pháp sử dụng ñể phân lập chất từ cặn chiết Các phương pháp xác ñịnh cấu trúc chất phân lập Phương pháp quy trình thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư chất phân lập ñược từ nghiên cứu Chương 3: Thực nghiệm 3.1 Mô tả chi tiết nguyên liệu dùng cho nghiên cứu: Mẫu thực vật, hóa chất dùng cho nghiên cứu 3.2 Chiết tách, tinh chế xác ñịnh cấu trúc hợp chất: Mơ tả chi tiết quy trình chiết tách, phân lập tinh chế chất từ hai nghiên cứu 3.2.1 Chiết tách số liệu phổ hợp chất từ Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu Thừa Thiên Huế: Mơ tả chi tiết quy trình phân lập, tinh chế liệt kê số vật lý, số liệu phổ hồng ngoại (FTIR), phổ khối (EI-MS, ESI-MS, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-, 13C-NMR) chất (S1-S5) daucosterol phân lập ñược từ cành 3.2.2 Chiết tách, tinh chế số liệu phổ hợp chất từ Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu Quảng Bình (13chất) 3.2.3 Chiết tách, tinh chế số liệu phổ hợp chất từ Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.): Mơ tả chi tiết q trình phân lập, tinh chế liệt kê số vật lý, số liệu phổ chất phân lập ñược từ Ngọc nữ biển (CE1-CE5) 3.3 Thử nghiệm hoạt tính sinh học: Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư (in vitro) 3.3.1 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dịch chiết từ Chóc máu thu Quảng Bình Ngọc nữ biển thu Thái Bình 3.3.2 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng (LU, MCF7, Hep-G2, KB) 10 chất phân lập từ hai nghiên cứu Chương 4: Kết thảo luận Chương biện luận phân tích xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập ñược cách kết hợp phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (EI-MS, ESI-MS, HR-ESIMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR) như: H-, 13 CNMR, DEPT hai chiều (2D-NMR) như: H-1H-COSY, HSQC, HMBC, NOESY 4.1 Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu Thừa Thiên Huế Qui trình phân lập chất từ cành Chóc máu mơ tả sơ đồ 3.3 Cấu trúc hóa học chất xác định cách kết hợp phương pháp phổ IR, MS, 1H-, 13C-NMR (bảng 4.1), 2D-NMR so sánh với tài liệu tham khảo 2100g b ột c ành Chóc máu TTH 6,9g cặn EtOAc 6,81g cặn n-hexan Sắc ký cột silicagel CH2 Cl /MeOH (10% MeOH) Sắc ký cột silicagel n-hexan/EtOAc 5% EtOAc PðA 0,04g S1 (119) 0,014g 10% EtOAc PðB 0,065g S2 (59) 0,045g 20% EtOAc 30% EtOAc PðC 0,27g PðD 0,051g PðE 0,072g S3 (22) 0,25g S4 (60) 0,036g S5 (120) 0,028g Pð (0,68g) Kết tinh lại Daucosterol (121) 0,27g Sơ ñồ 3.3: Phân lập chất từ cành Chóc máu Thừa Thiên Huế • Axit 28-hydroxy-3-oxo-30-lupanoic (S5): Phổ IR S5 cho ñỉnh hấp thụ 3490 cm-1 (ν OH), 1733 cm-1 (ν C=O axit), 1706 cm-1 (ν C=O xeton) Kết hợp liệu phổ: ESI-MS: m/z = 471 [M-H]- , HR-ESIMS: m/z = 471,34761 (C30H47O 4, tính tốn 471,34798, [M-H]-), phổ 13 C-NMR DEPT xác định cơng thức phân tử chất S5 C30 H47 O4, chất dự đốn triterpen Phổ 13C-NMR, DEPT cho biết 30 nguyên tử cacbon chất S5 bao gồm: 6×CH3, 11×CH2, 6×CH 7×Cq, có nhóm C=O xeton (δ C = 220,2; C-3), nhóm cacboxyl (δC = 179,3; C-30), nhóm hydroxylmetylen (δC = 59,8; C-28) Phổ H-NMR cho tín hiệu hoàn toàn phù hợp với phổ 13 C-NMR Phân tích liệu phổ, kết hợp so sánh độ chuyển dịch hóa học nhóm metyl S5 với nhóm metyl dẫn xuất triterpen khung lupan tài liệu [37] kết luận chất S5 triterpen có khung lupan Các liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều HMBC H-1H COSY S5 cho phép xác định vị trí nhóm cacboxyl C-30 thể tương tác C-30 (δC = 179,3) với H-20 (δH = 2,72) 3H29 (δH = 1,04) Nhóm hydroxymetylen gán vị trí C-28 thể tài liệu [9], [15], [65] Kết luận chất SPA2 29-axetoxy friedelan-3-on, hợp chất thiên nhiên có Chóc máu 29hydroxyfriedelan-3-on SPA2 (30a) SPA1(122a): R = OCOCH SPA1-TP (122): R = OH Bảng 4.2: Số liệu phổ 13C-NMR SPA1, SPA1-TP, SPA2 [125MHz, CDCl3 , δ (ppm)] C SPA1 SPA1-TP SPA2 C SPA1 SPA1-TP SPA2 22,3 22,3 22,3 17 32,0 32,5 30,0 41,5 41,5 41,5 18 43,3 44,3 42,6 213,0 213,1 213,0 19 35,9 36,0 30,2 58,2 58,2 58,2 20 33,5 34,4 31,9 42,1 42,1 42,1 21 76,4 74,3 28,2 41,3 41,3 41,3 22 43,2 47,1 38,1 18,3 18,3 18,3 23 6,8 6,8 6,8 52,3 51,6 53,1 24 14,6 14,7 14,7 37,5 37,5 37,5 25 18,1 17,8 18,0 10 59,5 59,6 59,5 26 18,9 18,2 18,6 11 35,4 35,3 35,6 27 19,0 19,3 20,1 12 30,4 30,2 30,4 28 32,7 33,2 32,1 13 39,3 39,1 39,8 29 30,8 31,9 72,7 14 38,5 38,8 38,3 30 26,3 24,9 29,5 OCOCH 15 31,3 30,5 32,3 171,0 - 171,4 16 36,5 36,1 35,9 OCOCH3 21,2 21,0 * Từ dịch chiết ethyl axetat cành Chóc máu: • α ,21α -dihydroxyfriedelan-3-on (SCE1): Phổ IR cho ñỉnh hấp thụ ν max: 3446 cm-1 (OH) 1716 cm-1 (C=O) Phổ EI-MS cho pic ion phân tử m/z = 458 [M]+ Phổ HR-ESI-MS cho mảnh ion quan trọng 11 m/z = 481,36494 (C30H 50 O3Na, theo tính tốn 481,36522, [M+Na]+ ) Như công thức phân tử SCE1 C 30H50 O3, dự đốn hợp chất triterpen Phổ 13 C-NMR DEPT cho biết phân tử chất SCE1 có 30 ngun tử cacbon đó: tín hiệu nhóm >C=O δC 212,3; hai nhóm >CH-OH δC 68,8 δ C 73,8; tín hiệu cịn lại là: 8×CH3, 9×CH2, 4×CH, 6×Cq Các tín hiệu proton phổ H-NMR hồn tồn đồng với phổ 13 C-NMR So sánh số liệu nhóm metyl SCE1 với dẫn xuất triterpen khung friedelan tài liệu [8], [92] kết luận chất SCE1 friedelanon triterpen có nhóm hydroxyl Kết luận ñược khẳng ñịnh thêm nhờ ion phân mảnh ñặc trưng khung m/z = 271, 245, 203, 177 151 [33] Phân tích số liệu phổ 2D-NMR cho biết: nhóm hydroxyl gắn vào vị trí C-7α thể tương tác C-7 (δC = 68,8) với 2H-6 (δH = 2,00; 1,41) H-8 (δ H =1,49) phổ HMBC; H-7 (δ H =4,08) với 2H-6 (δ H = 2,00; 1,41) H-8 (δH =1,49) phổ 1H- 1H COSY; H-7 (δ H =4,08) với 3H-24 (δ H = 0,8), 3H-25 (δ H = 0,93) 3H-26 (δ H = 1,17) phổ NOESY Nhóm hydroxyl thứ hai ñược xác ñịnh C-21α thể tương tác C-21(δH = 73,8) với 3H-29 (δ H =0,98), 3H-30 (δH = 1,08), 3H-28 (δH = 1,23), 2H-22(δH = 1,61; 1,25) phổ HMBC; H-21(δH = 3,7) với 2H-22 (δH = 1,61; 1,25) phổ H-1H COSY; H-21 (δ H = 3,7) với 3H-28 (δH = 1,23) 3H-30 (δH = 1,08) phổ NOESY Nhóm C=O khẳng định vị trí C-3 nhờ tương tác 3J CH C-3 (δC = 212,3) với 3H-23 (δH = 0,91), 2H-1 (δH = 1,99; 1,68), 2H-2 (δH = 2,41; 2,30) phổ HMBC Qua liệu phổ phân tích sau tra Science Finder kết luận chất SCE1 triterpen có cấu trúc 7α,21α-dihydroxyfriedelan-3-on • 7α ,29-dihydroxyfriedelan-3-on (SCE3): Phổ IR chất SCE3 cho ñỉnh hấp thụ ν max = 3532 (OH) 1714 cm-1 (C=O) Phổ HRESI-MS cho pic ion phân tử m/z = 497,33922 (C30 H50 O 3K, theo tính 12 tốn 497,33915, [M+K]+ ) Cơng thức phân tử suy từ liệu phổ MS, 13 C-NMR DEPT C 30H50 O3 Phổ 1H-, 13 C-NMR DEPT SCE3 phù hợp so với SCE1, ngoại trừ khác biệt nhóm metyl bị thay nhóm hydroxymetylen có tín hiệu nhóm >CHOH Các liệu phổ SCE3 cho phép dự đốn chất dihydroxyfriedelan-3-on tương tự SCE1, có khác biệt vị trí nhóm hydroxyl Căn vào mối tương tác phổ HMBC, H-1H COSY NOESY, nhóm >CH-OH xác định vị trí C-7α tương tự SCE1 Nhóm -CH 2OH xác ñịnh C-29, nhờ mối tương tác xa δC 71,4 (C-29) với δ H 1,00 (H 3-30) δ H 1,19 (H-19); δ H 3,37 (Hb -29) với δ C 29,5 (C19) δ C 33,5 (C-20); δ H 3,46 (Ha-29) với δ C 29,1 (C-30) δC 33,5 (C-20) phổ HMBC; tương tác NOE δH 1,18 (H-28) với δH 1,00 (H-30) cho thấy vị trí C-30 phải nhóm metyl, vị trí C-29 29-hydroxyl, kết luận ñược khẳng ñịnh thêm so sánh số liệu phổ phân tích với số liệu phổ chất 29-hydroxyfriedelan-3-on tài liệu [15], [96] Kết hợp liệu phổ sau tra Science Finder kết luận chất SCE3 triterpen có cấu trúc 7α,29-dihydroxyfriedelan-3-on Hình 4.17: Phổ HMBC SCE1 Hình 4.25: Phổ HMBC SCE3 13 Bảng 4.3*: Số liệu phổ 13C-NMR SCE1, SCE2, SCE3 [125Hz, CDCl3, δ (ppm)] ( 4.3* :có nội dung gộp lại từ bảng (4.3+4.4+4.5) luận án) C SCE3 SCE1 SCE2 C SCE3 SCE1 SCE2 21,9 21,9 22,2 16 36,1 36,5 36,0 41,2 41,2 41,3 17 29,7 31,8 32,2 212,3 212,3 214,4 18 42,4 43,5 44,1 58,3 58,2 58,1 19 29,5 36,2 29,5 42,6 42,6 42,0 20 33,5 34,3 38,3 52,3 52,6 41,0 21 28,0 73,8 71,2 68,9 68,8 18,1 22 38,3 47,6 44,6 58,7 57,6 50,8 23 6,9 6,9 6,5 39,1 39,1 37,4 24 15,9 15,9 14,4 10 58,9 58,9 59,3 25 19,0 19,2 19,1 11 35,9 35,7 35,0 26 20,8 19,0 19,4 12 30,4 30,2 29,7 27 18,9 19,7 19,4 13 40,1 40,3 39,0 28 31,9 32,8 32,9 14 40,4 39,7 38,7 29 71,4 25,4 16,5 15 35,4 33,6 29,8 30 29,2 31,2 73,3 • 21α ,30-dihydroxyfriedelan-3-on (SCE2): Từ liệu phổ thu ñược SCE2, kết hợp so sánh với tài liệu [91], xác định chất SCE2 có cấu trúc 21α,30-dihydroxyfriedelan-3-on SCE3(123): Chất SCE1(124): Chất SCE2 (125) 4.2.2 Các chất phân lập từ Chóc máu thu Quảng Bình Sơ đồ 3.5 mơ tả qui trình phân lập chất từ cặn chiết Chóc máu 14 1800g b ột Chóc máu QB 5,73g cặn n-hexan 10,5g cặn EtOAc - Sắc ký cột silicagel (11 phân ñoạn) - CH2 Cl2/MeOH = 80/20 Sắc ký cột silicagel n-hexan/EtOAc 2% EtOAc PðA 0,12g S6 (28) 0,093g 3% EtOAc PðB 0,153g S7 (76) 0,084g 4% EtOAc PðC 0,05g S8 (83) 0,036g 5% EtOAc PðD 0,17g S9 (78) 0,091g Pð (1,67g) - Sắc ký lọc gel (MeOH) SF1 (126) 0,11g (0,006%) Sơ ñồ 3.5: Phân lập chất từ Chóc máu Quảng Bình • Friedelan-3-on (S6): Phân tích liệu phổ thu ñược S6 (IR, ESI-MS, H-, 13C-NMR, DEPT), kết hợp so sánh với tài liệu cơng bố [34], kết luận cấu trúc S6 friedelan-3-on • Friedelan-3β-ol (S7): Từ liệu phổ thu ñược S7, kết hợp tham khảo tài liệu [49], cấu trúc chất S7 xác định friedelan-3β-ol • 14-taraxeren-3β-ol (S8): Cơng thức phân tử chất S8 xác định thông qua liệu phổ ESI-MS (m/z = 427 [M+H]+) phổ 13 C-NMR C30H 50O Tín hiệu nhóm metyl phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hóa học nguyên tử cacbon phổ 13 CNMR cho biết chất S8 triterpen khung taraxeran So sánh liệu phổ S8 với tài liệu [11], cho phép kết luận chất S8 14taraxeren-3β-ol ðây lần ñầu tiên hợp chất ñược phân lập từ lồi Salacia chinensis L Chất S8 có khả ức chế enzym acetylcholinesterase (AchE) với giá trị IC50=79àM [63] ã Axit 3,4-secofriedelan-3-oic (S9): T cỏc d liệu phổ thu ñược S9, kết hợp tham khảo tài liệu [90] cho phép kết luận hợp chất S9 axit 3,4-secofriedelan-3-oic 15 Bảng 4.6: Dữ liệu phổ 13C-NMR S6-S9 [125Hz, CDCl 3, δ (ppm)] C S6 S7 S8 S9 22,3 15,8 37,8 21,1 41,5 35,2 27,2 37,4 213,1 72,7 79,1 179,1 58,2 49,2 39,0 36,1 42,1 37,1 49,3 37,8 41,3 41,7 18,8 39,0 18,2 17,6 33,7 18,1 53,1 53,2 38,8 53,0 S6 (28): R = O 37,5 38,4 48,8 39,1 S7 (76): R = H, OH 10 59,5 61,4 37,6 59,8 11 35,6 35,4 17,5 35,3 12 30,5 30,6 35,2 30,2 13 39,8 37,8 37,7 39,6 14 38,3 39,7 158,1 38,3 15 32,8 32,4 116,9 32,3 16 36,0 36,1 36,7 36,1 17 30,0 30,0 38,0 30,0 18 42,8 42,8 48,8 42,9 19 35,4 35,6 41,4 35,3 20 28,2 28,2 28,8 28,2 S8 (83) 21 32,5 32,8 33,7 32,9 22 39,3 39,3 33,1 39,3 23 6,8 10,0 33,4 7,6 24 14,7 16,4 21,3 19,4 25 18,0 18,3 29,9 17,9 26 20,3 18,7 25,9 20,2 27 18,7 20,1 28,0 18,8 28 32,1 31,8 18,8 32,1 29 31,8 35,0 15,4 35,0 30 35,0 32,1 15,5 31,9 S9 (78) • Quercitrin (SF1): Từ số liệu phổ ESI-MS (m/z = 447 [M-H] -), 13 C-NMR, DEPT cho biết công thức phân tử SF1 C21 H20 O11 Phân tích số liệu phổ H- 13C-NMR, tham khảo tài liệu [95], khẳng ñịnh chất SF1 quercitrin hay quercetin-3-O-α-Lrhamnopyranoside • Mangiferin (SF2) chiết từ Chóc máu: Phân tích phổ IR, 1H-, 13 C- 16 NMR DEPT kết hợp so sánh với số liệu tài liệu [74], kết luận chất SF2 mangiferin Hợp chất có nhiều lồi Mangifera indica L có hoạt tính kháng virus cao Nó cịn tìm thấy với hàm lượng cao lồi thuộc chi Salacia Các nghiên cứu gần ñây cho thấy thử nghiệm chuột, mangiferin có khả làm giảm glucose máu bệnh tiểu ñường type [31] SF2 (52) SF1 (126) Như vậy, thành phần hóa học Chóc máu triterpen có khung lupan, hopan, friedelan, taraxeran Hai mẫu nghiên cứu thu hái hai vùng với địa hình, khí hậu, thổ nhưỡng khác vào hai thời ñiểm khác (năm 2006 2007), nên phần lớn triterpen thu từ mẫu có khung khác nhau, khác với triterpen ñược phân lập từ Salacia chinensis L có nguồn gốc từ Thái Lan 4.3 Cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) Từ dịch chiết ethyl axetat Ngọc nữ biển ñã phân lập xác ñịnh cấu trúc hóa học chất là: • 20(29)-lupen-3 β -O-yl hexacosanoat (CE1): Phổ FT-IR CE1 cho ñỉnh hấp thụ ñặc trưng 3074 cm-1 (=CH); 1727cm-1 (>C=O este) Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử m/z = 805 [M+H]+ , pic m/z: 409 [C30H48 +H]+ ion phân mảnh cách 14 28 ñơn vị khối lượng 299; 285; 271; 243; 229; 191; 163; 149 Sự xuất mảnh ion m/z = 409 triterpen cắt mảnh liên kết C-O 17 Các số liệu phổ khối phân tích cho phép dự đốn CE1 triterpen ancol este hóa với axit béo mạch thẳng Từ liệu suy công thức phân tử axit béo C25 H51 COOH (M = 396) Phổ 1H- 13 C-NMR khẳng định cho giả thiết Phân tích chi tiết liệu phổ 1H-, 13 C-NMR (bảng4.7) DEPT kết hợp so sánh với tài liệu [16], cấu trúc chất CE1 ñược xác ñịnh 20(29)-lupen-3βO-yl hexacosanoat Bảng 4.7: Số liệu phổ 13 C-NMR chất CE1 (CDCl 3, 125 MHz) Vị trí 10 11 12 δC (ppm) 38,4 t 31,9 t 80,7 d 37,9 s 55,4 d 18,2 t 34,3 t 40,9 s 50,4 d 37,1 s 21,0 t 25,2 t Vị trí 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 δC (ppm) Vị trí δ C (ppm) 38,1 d 25 16,6 q 42,9 s 26 16,2 q 27,5 t 27 14,6 q 35,6 t 28 18,0 q 43,0 s 29 109,4 t 48,4 d 30 19,3 q 48,0 d 1’ 173,7 s 150,9 s 2’ 34,9 t 29,7 t 3’ – 25’ 40,0 t 26’ 14,1 q 28,0 q 16,0 q • Stigmast-5-en-3β -ol (CE2): Phân tích số liệu phổ EI-MS (m/z = 414 [M]+), 1H-, 13 C-NMR DEPT chất CE2, kết hợp tham khảo tài liệu [71], kết luận chất CE2 stigmast-5-en-3β-ol • Apigenin (CE4): Các liệu phổ IR, MS, 1H-, 13C- NMR DEPT CE4 hồn tồn đồng với liệu phổ chất 5,7,4’trihydroxy flavon (apigenin) [82] ðây hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá như: chống oxi hoá, kháng viêm chống ung thư, ngăn cản hình thành axit uric, Apigenin khơng độc nên hoạt chất cần thiết dược phẩm [22], [47], [50], [73] 18 • Acacetin (CE3): Từ liệu phổ thu ñược, kết hợp tham khảo tài liệu [52], kết luận CE3 acacetin Bên cạnh hoạt tính chống oxi hóa, acacetin cịn thể hoạt tính gây độc số dịng tế bào ung thư người [52] Bảng 4.8: Dữ liệu phổ 1H-, 13 C- NMR CE3 CE4 Vị trí 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 5-OH 7-OH 4'-OH 4'-OCH3 [500, 125 MHz, DMSO-d6, δ (ppm)] CE4 CE3 δH δC δH 163,7 6,77 (1H, s) 102,8 6,86 (1H,s) 181,7 161,1 6,19(1H, d, 2,0) 98,8 6,20 (1H, d, 2,0) 164,1 6,48 (1H, d, 2,0) 93,9 6,51 (1H, d, 2,0 ) 157,3 103,7 121,1 7,92 (2H, dd, 6,9, 1,9) 128,4 8,03 (2H, d, 8,9) 6,93(2H, dd, 6,9, 1,9) 115,9 7,11 (2H, d, 8,9 ) 161,4 6,93(2H, dd, 6,9, 1,9) 115,9 7,11 (2H, d, 8,9) 7,92(2H, dd, 6,9, 1,9) 128,4 8,03 (2H, d, 8,9) 12,95 (1H, s) 12,91 (1H, s) 10,82 (1H, s) 10,3 (1H, s) 3,86 (3H,s) δC 163,3 103,5 181,7 161,4 98,9 164,2 94,0 157,3 103,7 122,8 128,2 114,5 162,3 114,5 128,2 55,5 • Andrographolid (CE5): Phân tích liệu phổ IR, ESI-MS, 1D- 2D-NMR CE5, kết hợp so sánh với tài liệu [56] cho phép kết luận cấu trúc chất CE5 3α,14α,19-trihydroxy-8(17),12E-entlabdadien-16,15-olid hay andrographolid ðây diterpen có khung ent-labdan phân lập trước từ Xuyên tâm liên [Andrographis paniculata (Acanthaceae)] Hoạt tính kháng viêm gây ñộc tế bào ung thư 19 bạch cầu dòng M1 andrographolid dẫn xuất cơng bố [46], [56] Bảng 4.9: Dữ liệu phổ 1H-, 13 C-NMR, chất CE5 [500, 125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] Vị trí 13 H C Vị trí 11 1,85 (m,1H) 37,4 t 1,20 (m,1H) 1,80 (m, 2H) 28,2 t 3,42 (m,1H) 80,3 d 42,8 s 1,24 (m,1H) 55,6 d 1,82 (m,1H) 1,29 (m,1H) 13 H C 149,2 d 128,5 s 65,8 d 15 2,55 (m,1H) 2,57 (m,1H) 6,91 (dt, 1,6, 6,8, 1H) 4,95 (d, 6,1) 4,45 (dd, 6,1, 10,3, 1H) 4,22 (dd, 2,2, 10,3, 1H) 24,2 t 16 - 171,8 s 17 1,84 (m,1H) 56,5d 19 10 - 39,2s 20 4,89 (s, 1H) 4,63 (s, 1H) 1,24 (s, 3H) 4,17 (d, 11,0, 1H) 3,31 (d, 11,0, 1H) 0,71 (s, 3H) 109,1 t 1,98 (m,1H) 38,1 t 2,41 (m,1H) 147,2s 12 13 14 18 25,0 t 75,2 t 23,0 q 64,4 t 15,3 q 29 28 21 18 12 13 11 19 10 CE1 (127) 14 15 CE2 (128) CE3 (116): R= CH CE4 (129): R= H CE5 (130) 20 26 24 25 17 16 22 23 HO 20 27 4.4 Hoạt tính sinh học 4.4.1 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh dịch chiết Các dịch chiết từ thân Chóc máu thu Quảng Bình Ngọc nữ biển thu Thái Bình ñược ñem thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh, kết ñược trình bày bảng 4.10 bảng 4.11 Bảng 4.10: Các dịch chiết từ Chóc máu thu Quảng Bình Tên chủng vi sinh vật kiểm ñịnh (IC 50) Stt Tên mẫu Ec Pa Bs Sa Ca n-hexan cành EtOAc cành 195,6 MeOH cành 65,5 n-hexan EtOAc MeOH 140,2 Bảng 4.11: Các dịch chiết từ Ngọc nữ biển Stt Cặn chiết n-hexan EtOAc MeOH Tên chủng vi sinh vật kiểm ñịnh Ca Ec Pa Bs MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC - - 128 - - 128 - - 128 - 128 - Sa MIC MBC 128 - 128 - Kết cho thấy dịch chiết methanol thân Chóc máu Quảng Bình có hoạt tính mạnh chủng Staphylococcus aureus (Sa) khuẩn tụ cầu gây bệnh người chủ yếu bệnh cấp tính Dịch chiết ethyl axetat Ngọc nữ biển hoạt tính hầu hết chủng đem thử, chủng Bs Sa cịn có tác dụng ức chế (MIC) gây chết (MBC) 4.4.2 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào Kết thử hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư 10 chất phân lập từ nghiên cứu ñược ñưa bảng 4.12 21 Bảng 4.12: Kết thử hoạt tính gây ñộc tế bào Stt Tên dòng tế bào [IC 50 (µ µg/ml)] MCF7 LU HepG2 KB Ký hiệu mẫu Andrographolid (CE5) 11,09 4,32 18,36 20,00 29-nor-21α-H-hopan-3,22-dion (S2) >128 117,33 >128 >128 Axit 28-hydroxy-3-oxo-30-lupanoic (S5) 69,48 25,77 61,79 62,90 Friedelan-3-on (S6) >128 >128 >128 >128 Friedelan-3β-ol (S7) >128 >128 >128 >128 Axit 3,4-secofriedelan-3-oic (S9) 77,12 67,07 88,14 83,61 7α,21α –dihydroxyfriedelan-3-on (SCE1) 27,35 19,27 16,22 16,86 21α,30-dihydroxyfriedelan-3-on (SCE2) >128 >128 >128 >128 7α,29-dihydroxyfriedelan-3-on (SCE3) >128 >128 >128 >128 10 21α-axetoxyfriedelan-3-on (SPA1) >128 >128 >128 >128 11 Elipticine 0,31-0,62 0,31-0,62 0,31-0,62 0,62-1,25 Kết thử hoạt tính cho thấy: + Chất CE5 (andrographolid), diterpen phân lập từ Ngọc nữ biển có khả ức chế 50% phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm Với dòng tế bào ung thư phổi chất thể hoạt tính rõ rệt với IC50 = 4,32µg/ml + Chất 7α,21α-dihydroxyfriedelan-3-on (SCE1) phân lập từ Chóc máu Quảng Bình có khả ức chế phát triển bốn dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 16,22 đến 27,35µg/ml, rõ rệt ñối với dòng tế bào Hep-G2 + Chất axit 28-hydroxy-3-oxo-30-lupanoic (S5) phân lập từ Chóc máu Thừa Thiên Huế thể khả kìm hãm phát triển dịng tế bào ung thư rõ với dòng tế bào LU 22 KẾT LUẬN Cây Chóc máu thu Thừa Thiên Huế, Quảng Bình Ngọc nữ biển thu Thái Bình ñã lần ñầu tiên ñược nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Việt Nam Từ cành Chóc máu (Salacia chinensis) thu Thừa Thiên Huế, ñã phân lập xác ñịnh cấu trúc hóa học chất, bao gồm: 3-oxo-30lupanal (S1, 119), 29-nor-21α-H-hopan-3,22-dion (S2, 59), betulin (S3, 22), 21α-H-22(29)-hopen-3β,30-diol (S4, 60), axit 28-hydroxy-3oxo-30-lupanoic (S5, 120) daucosterol (121) Trong axit 28-hydroxy-3-oxo-30-lupanoic (S5) chất 3-oxo-30-lupanal (S1) chất lần ñầu tiên ñược phân lập từ thiên nhiên Từ cành Chóc máu (Salacia chinensis L.) thu Quảng Bình, phân lập xác định ñược cấu trúc hóa học 13 chất, bao gồm: 7α,29-dihydroxyfriedelan-3-on (SCE3, 123), 7α,21α- dihydroxyfriedelan-3-on (SCE1, 124), 21α,30-dihydroxyfriedelan3-on (SCE2, 125), friedelan-3-on (S6, 28), friedelan-3β-ol (S7, 76), axit 3,4-secofriedelan-3-oic (S9, 78), 14-taraxeren-3β-ol (S8, 83), betulin (22), quercitrin (SF1, 126), mangiferin (SF2, 52) daucosterol (121) Trong chất 7α,21α-dihydroxyfriedelan-3-on (SCE1) 7α,29dihydroxy friedelan-3-on (SCE3) hai chất Hai chất gốc có 21α-hydroxyfriedelan-3-on (122) 29hydroxyfriedelan-3-on (30) xác định thơng qua việc phân lập xác định cấu trúc sản phẩm axetyl hóa chúng Từ Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme Gaertn.) thu Thái Bình phân lập chất: lup-20(29)-en-3β-O-yl hexacosanoat 23 (CE1, 127), stigmast-5-en-3β-ol (CE2, 128), acacetin (CE3, 116), apigenin (CE4, 129) andrographolid (CE5, 130) ðây lần ñầu tiên chất CE1 CE5 ñược phân lập từ Hoạt tính sinh học: 4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Dịch chiết methanol thân Chóc máu Quảng Bình có hoạt tính rõ rệt ñối với chủng Staphylococcus aureus (Sa) với giá trị IC 50 = 65,5µg/ml Dịch chiết ethyl axetat Ngọc nữ biển có hoạt tính hầu hết chủng đem thử với MIC = 128µg/ml 4.2 Hoạt tính gây độc tế bào: ðã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư bốn dịng: ung thư vú (MCF7), ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (LU), ung thư biểu mô (KB) 10 chất phân lập từ hai nghiên cứu, kết cho thấy: Hai chất 124 (SCE1), 120 (S5) andrographolid (CE5, 130) có khả ức chế phát triển bốn dòng tế bào ung thư thử nghiệm Trong đó, andrographolid thể rõ rệt với dịng LU IC 50 = 4,32µg/ml, chất SCE1 thể giá trị IC 50 từ 16,22 đến 27,35µg/ml, chất S5 thể rõ rệt với dòng LU IC50 = 25,77 µg/ml DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ðẾN LUẬN ÁN ðà ðƯỢ C CƠNG BỐ Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ ðào Thắng, Trần Văn Sung (2009), Các kết thành phần hóa học Chóc máu (Salacia chinensis L.), Tạp chí Hóa học, Vol 47 (4A), pp 192-196 24 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung (2009), Chemical constituents of Salacia chinensis L growing in Vietnam, Journal of Chemistry of Vietnam, Vol.47(2A), pp.469-473 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung (2009), Chemical constituents from Clerodendrum inerme species in Viet Nam, Traditional and Alternative Medicine (Research & Policy Perspectives), pp 170-174 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung (2008), Study on chemical constituents of Salacia chinensis L collected in Vietnam, Z Naturforsch., Vol 63b, No 12, pp 1411-1414 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, and Tran Van Sung (2008), Triterpenes from Salacia chinensis L collected in Quang Binh Province, Viet Nam, International Scientific conference on “Chemistry for development and Integration”, Hanoi, pp 397-402 Tran Thi Minh, Nguyen Thi Hoang Anh, Vu Dao Thang, Tran Van Sung (2008), Study on chemical constituents of Salacia chinensis L collected in Thua Thien Hue, Journal of Chemistry of Vietnam, Vol.46(1), pp.47-51 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ ðào Thắng, Trần Văn Sung (2008), Một số kết nghiên cứu thành phần hóa học Ngọc nữ biển Việt Nam (Clerodendrum inerme), Hội nghị Khoa học Công nghệ Hóa Dược tồn Quốc lần thứ I, Hà Nội 12/2008, Tr 285-290 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ ðào Thắng, Trần Văn Sung (2007), Bước ñầu nghiên cứu thành phần hóa học thăm dị hoạt tính sinh học Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme) Việt Nam, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hố học Hữu toàn quốc, Hà nội 10/2007, Tr.460-464 Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Vũ ðào Thắng, Trần Văn Sung (2007), Andrograholid lupenyleste từ Ngọc nữ biển Việt Nam (Clerodendrum inerme Gaernt.), Tạp chí Hóa học, T.45 (6A), Tr 166-170 25 ... phần hóa học chủ yếu Salacia chinensis L 1.1 Cây Chóc máu (Salacia chinensis L.), họ Celastraceae 1.1.1 Cây Chóc máu Cây Chóc máu thu Ấn ðộ Thái Lan nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học Các cơng... Cây Chóc máu thu Thừa Thiên Huế, Quảng Bình Ngọc nữ biển thu Thái Bình ñã lần ñầu tiên ñược nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Việt Nam 3.1 Từ cành Chóc máu (Salacia chinensis L.). .. Trần Văn Sung (2007), Bước ñầu nghiên cứu thành phần hóa học thăm dị hoạt tính sinh học Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme) Việt Nam, Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Hố học Hữu toàn quốc, Hà nội 10/2007,