Định danh VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS bằng phương pháp hiện đại và truyền thống

PowerPoint Presentation BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS Nhóm thực hiện Nhóm 11 GVHD Hoàng Xuân Thế Bế Thị Hoài Thương Đào Vũ Thùy Trang Trần Thị Thảo Tiên Lê Thị Bảo Trân Nguyễn Thị Thu Thủy NỘI DUNG Tình hình ô nhiễm Đặc điểm Cơ sở phân tích Quy trình phân tích Thiết bị, dụng cụ, môi trường Ví dụ, giải thích quy trình An toàn trong phân tích Kết luận Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là một loại vi khuẩn trong cùng một nhó.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GVHD: Hoàng Xuân Thế Nhóm thực hiện: Nhóm 11 ⸙ ⸙ ⸙ ⸙ ⸙ Bế Thị Hoài Thương Đào Vũ Thùy Trang Trần Thị Thảo Tiên Lê Thị Bảo Trân Nguyễn Thị Thu Thủy NỘI DUNG Tình hình nhiễm Đặc điểm Cơ sở phân tích Quy trình phân tích Thiết bị, dụng cụ, mơi trường Ví dụ, giải thích quy trình An tồn phân tích Kết luận TÌNH HÌNH Ơ NHIỄM Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus loại vi khuẩn nhóm với vi khuẩn gây bệnh tả, vi khuẩn có hình que cong dấu phẩy ngắn, vi khuẩn gram âm, không sinh nha bào, di động nhờ lông đầu Chúng sinh sống, phát triển tốt môi trường kiềm mặn, tồn nước biển động vật biển tơm, cá, ốc, sị bị chết 650C sau 10 phút, chúng không phát triển nhiệt độ 150C Tình hình nước ngồi nước Tình hình ngồi nước  Vibrio parahaemolyticus Tsunesaburo Fujino phát lần vào năm 1950  Ở Nhật Bản ghi nhận 272 ca bệnh Tình hình nước  Vụ ngộ độc thức ăn tập thể ăn tôm rang bị nhiễm Vibrio parahaemolylicus Hải Phòng năm 1983  Năm 2002, ghi nhận 548 trường hợp tiêu chảy, xét nghiệm có 53% dương tính với V.parahemolyticus Các yếu tố nguy gây nhiễm Thói quen ăn hải sản sống chưa nấu chín Nhiễm khuẩn q trình chế biến thức ăn bảo quản loại hải sản Lây nhiễm chéo vi khuẩn phát triển thực phẩm khác Có tiền sử bệnh mãn tính ĐẶC ĐIỂM Vibrio vi sinh vật Gram âm, hình que hai đầu khơng tạo hình dấu phẩy, di động, sống kị khí tùy ý, có phản ứng catalase oxidase (+), lên men glucose không sinh hơi, không sinh H2S, nhạy cảm với Vibriostaticum O/129 Vibrio Parahaemolyticus cần muối để tăng trưởng thường xuyên phân lập từ vùng ven biển Phản ứng ADH (-), LDC Vibrio parahaemolyticus có (+) có khả khử phản ứng oxidase (+), nitrate thành nitrite phát triển không lên men sucrose… canh trypton 240C CƠ SỞ PHÂN TÍCH 3.1 Phương pháp truyền thống Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 79051:2008 ISO /TS 21872-1:2007 Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn ni – phương pháp phát vibrio spp có khả gây bệnh đường ruột – phần 1: phát vibrio parahaemolyticus 3.2 Phương pháp đại Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710 -19:2019 ( xuất lần 1) Bệnh thủy sản – Quy trình chuẩn đốn – Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tôm 3.1 Phương pháp truyền thống Phạm vi áp dụng • Tiêu chuẩn quy định phương pháp phát lồi Vibrio gây bệnh đường ruột người: V parahaemolytius • Tiêu chuẩn áp dụng cho: • Các sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn ni • Các mẫu mơi trường khu vực chế biến vận chuyển thực phẩm Thuật ngữ định nghĩa • Vibrio parahaemolyticus có khả gây bệnh đường ruột:Vi sinh vật tạo thành khuẩn lạc điển hình mơi trường đặc chọn lọc cho thấy đặc tính sinh hóa mơ tả, tiến hành theo tiêu chuẩn • Phát Vibrio parahaemolyticus có khả gây bệnh đường ruột: Xác định có mặt hay khơng có mặt Vibrio parahaemolyticus lượng sản phẩm xác định, tiến hành thử theo tiêu chuẩn 10 Phát L-lyzin tách nhóm ▸ Thao tác: cacboxyl Cấy dung dịch muối lỏng (LCD) bề mặt Thêm khoảng ml dầu khống vơ trùng lên mặt mơi trường Ủ 370C 24h ± 3h ▸ Kết quả: Sau ủ thấy có màu vàng chứng tỏ phản ứng âm 54 tính Phát indol Thao tác •Cấy khuẩn nghi ngờ vào ống chứa ml môi trường muối trypton- tryptophan •Ủ 370C 24h ± 3h Sau ủ, thêm ml thuốc thử Kovacs Kết quả: Hình thành vịng màu nâu-vàng chứng tỏ phản ứng âm tính 55 Đọc kết ▸ Không phát V parahaemolyticus 25g mẫu rắn 56 Qua thử nghiệm sinh hóa nên kết luận không phát Phương pháp PCR (TCVN 871019) ▸ Tiêu chuẩn quy định phương pháp phát định quy trình chẩn vi khuẩn Vibrio đốn bệnh hoại tử gan parahaemolyticus gây tụy cấp tính tơm bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) cấp tính tôm (AHPND) 57 ▸ Tiêu chuẩn quy Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) • Ngun nhân gây bệnh xác định vi khuẩn V.parahaemolyticus • Gây bệnh lồi tơm Penaeus monodon, P vannamei, P chinesis • Đã tác động đến khu vực sản xuất tôm chủ lực thuộc tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, Kiên Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu Cà Mau 58 ▸ Nguyên tắc: Phương “ pháp phân tích nhằm xác định DNA mầm bệnh có hay không tồn mẫu kiểm tra dựa vào việc xác định đoạn DNA đích có khuếch đại hay 59 không Vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm phát thơng qua kỹ thuật realtime PCR, với DNA chiết tách từ canh tăng sinh từ mẫu mô bệnh tơm với biểu triệu chứng điển hình nhằm rút ngắn tối đa thời gian xét nghiệm ▸ PHƯƠNG THỨC HOẠT ĐỘNG Các chủng vi khuẩn nuối cấy môi trường NB ( Nitrient Broth) sử dụng để tách DNA sử dụng nguồn AND khuôn mẫu cho phản ứng PCR sử dụng nguồn ADN khuôn mẫu cho phản ứng PCR sử dụng cặp AP3 cặp mồi Toxin 60 PHƯƠNG THỨC HOẠT ĐỘNG Chu kỳ nhân nhiệt phản ứng PCR đước áp dụng sau:  Giai đoạn tiền biến tính 940C phút, theo sau với 35 chu kỳ nhiệt gồm giai đoạn biến tính phút 940C  Giai đoạn bắt cặp 30 giây 530C  Giai đoạn tổng hợp 40 giây 720C Kết thúc với giai đoạn kéo dài phút 720C Sản phẩm PCR điện di thạch agarose 1% dung dịch Tris-acetateEDTA có bổ sung Ethelium Bromine đọc kết ánh sáng đèn UV 61 CHUẨN BỊ VÀ TIẾN HÀNH Chuẩn bị mẫu nuôi cấy nuôi cấy qua đêm 35-20 0C TSB – 2% NaCl Ly tâm ml dịch nuôi cấy ống ly tâm siêu nhỏ phút 15.000g rửa viên hai lần nướC muối sinh lý Cho viên lại 1,0ml dh 20 0C đun sôi 10 phút Bảo quản mẫu -200C sử dụng Phân tích gel garose sản phẩm PCR 62 Kết ▸ Sử dụng cặp mồi AP3 Toxin gây hoại tử gan tụy cấp xác định chủng vi khuẩn V Parahaemolyticus KC12.020, Vibrio sp KC13.14.2 Vibrio sp.KC13.17.5 chủng vi khuẩn gây bệnh AHPND 63 AN TOÀN TRONG PHÂN TÍCH 64 Theo TCVN 6404:2016 65 Nhân 66 KẾT LUẬN  Khi nghi ngờ có vi khuẩn Vibrio mẫu, môi trường tốt để phân lập chúng thạch Thiosulfate-citrate-mật-sucrose (TCBS) Môi trường sử dụng toàn giới 40 năm phương tiện lựa chọn cố gắng nuôi loài Vibrio Một ưu điểm khác biệt TCBS không cần tiệt trùng (hấp tiệt trùng) trước sử dụng Mơi trường có tính chọn lọc phân biệt Vibrio Đặc tính chọn lọc dựa nồng độ muối độ pH cao cho phép loài Vibrio phát triển ức chế chi khác có thực phẩm mẫu lâm sàng nơi có Vibrio quan trọng mặt lâm sàng  PCR có lẽ tốt nhất, với chi phí nhược điểm Đây phương pháp nhạy, phát bốn tế bào mililit mười tế bào mẫu cá V parahaemolyticus tiết kiệm thời gian đáng kể Do chất PCR, có độ đặc hiệu cao, đoạn mồi cung cấp cho protein đặc trưng loài sử dụng 67 68 Thanks for watchin g! ... Phát Vibrio parahaemolyticus có khả gây bệnh đường ruột: Xác định có mặt hay khơng có mặt Vibrio parahaemolyticus lượng sản phẩm xác định, tiến hành thử theo tiêu chuẩn 10 11 3.1 Phương pháp truyền. .. phản ứng 6 VÍ DỤ GIẢI THÍCH QUY TRÌNH PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG ▸ Kiểm tra 44 ▸ Phương ▸ Nguyên tắc: cân lượng mẫu có mặt pháp truyền xác định nuôi ủ môi V thống (TCVN trường lỏng chọn lọc Từ parahaemol... trước rửa 24 Phương pháp PCR điện di 4.2 Nguyên tắc: Phương pháp phân tích nhằm xác định ADN mầm bệnh có hay khơng tồn mẫu kiểm tra dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có khuếch đại hay không