Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng nhân chồi in vitro của cây bưởi trụ lông (citrus maxima (burm ) merr )

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG  ĐẶNG THỊ HỒNG LINH NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI IN VITRO CỦA CÂY BƢỞI TRỤ LÔNG (Citrus maxima (Burm.) Merr.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Đà Nẵng - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG  ĐẶNG THỊ HỒNG LINH NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI IN VITRO CỦA CÂY BƢỞI TRỤ LÔNG (Citrus maxima (Burm.) Merr.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 7420201 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn: TS Trần Quang Dần Đà Nẵng - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả dƣới hƣớng dẫn TS Trần Quang Dần, Khoa Sinh – Môi trƣờng Đại học sƣ phạm- Đại học Đà Nẵng chƣa đƣợc công bố cơng trình khác trƣớc Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả Đặng Thị Hồng Linh i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin chân thành cảm ơn BGH trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng, khoa Sinh – Môi trƣờng, thầy cô chuyên ngành Công nghệ Sinh học truyền dạy cho nhiều việc làm quen phát triển kĩ thực hành thí nghiệm q trình tơi thực đề tài Khoá luận, nhƣ năm học đại học Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến TS Trần Quang Dần ngƣời thầy tâm huyết tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi định hƣớng cho tơi suốt q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn bạn 17CNSH ln hỗ trợ nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình tất bạn bè ln động viên, khích lệ vật chất lẫn tinh thần để đạt đƣợc kết tốt Xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu loài bƣởi 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại khoa học 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Thành phần hóa học gía trị bƣởi 1.1.5 Đặc điểm bƣởi Trụ Lông 1.2 Giới thiệu nhân giống in vitro thực vật 1.2.1 Ƣu điểm 1.2.2 Hạn chế 10 1.2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro 11 1.3 Các vấn đề liên quan đến nhân giống in vitro 13 1.3.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng chất điều hòa sinh trƣởng đến 13 1.3.2 Tính bất định mặt di truyền 17 1.3.3 Mẫu đƣa vào nuôi cấy 18 1.3.4 Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu cấy 18 1.3.5 Hiện tƣợng thủy tinh thể 19 1.3.6 Khống chế điều kiện môi trƣờng 20 1.3.7 Những trở ngại thƣơng mại hóa 21 1.3.8 Nhân giống in vitro việc sử dụng giống ƣu lai 21 1.4 Hiện trạng nghiên cứu có múi 21 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 21 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 22 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 iii 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.2 Phạm vi nghiên cứu 24 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Khử trùng mẫu hạt 24 2.3.2 Ảnh hƣởng độ tuổi hạt đến khả nảy mầm 25 2.3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân chồi đoạn chồi bên 25 2.3.4 Khử trùng mẫu chồi bƣởi Trụ Lông 25 2.3.5 Phƣơng pháp xử lí số liệu 26 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Khả nhân chồi đoạn chồi bên từ hạt 27 3.1.1 Ảnh hƣởng Javel đến hiệu khử trùng hạt 27 3.1.2 Ảnh hƣởng độ tuổi hạt đến khả nảy mầm hạt 28 3.1.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân chồi đoạn chồi bên 30 3.2 Khả nhân chồi đoạn chồi bên tự nhiên 31 3.2.1 Ảnh hƣởng HgCl2 đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên 32 3.2.2 Ảnh hƣởng Javel đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên 32 3.2.3 Ảnh hƣởng công thức khử trùng kết hợp đến hiệu khử 33 3.2.4 Ảnh hƣởng chất kháng sinh đến hiệu khử trùng đoạn 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 Kết luận 36 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC 41 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA: Acid Abscisic ADN: Acid deoxyribonucleic ATP: Adenozin triphotphat BAP: 6-benzylaminopurine Cs: Cộng GA3: Axit gibberellic IBA: Indole 3-butyric acid L: Lít MS: Murashige Skoog (1962) NAA: α-naphthalen acetic acid v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tiêu đề bảng Trang 1.1 Các dung dịch khử trùng nuôi cấy mô 11 2.1 Công thức khử trùng chồi bƣởi Trụ Lông 26 3.1 Ảnh hƣởng điều kiện khử trùng đến khả nảy mầm hạt 27 3.2 Ảnh hƣởng độ tuổi đến khả nảy mầm hạt 29 3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân chồi đoạn chồi bên từ hạt 30 3.4 Ảnh hƣởng HgCl2 đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên tự nhiên 32 3.5 Ảnh hƣởng Javel đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên tự nhiên 33 3.6 Ảnh hƣởng công thức khử trùng kết hợp đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên ngồi tự nhiên vi 33 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tiêu đề hình Trang 2.1 Cây bƣởi Trụ Lơng đƣợc trồng làng Đại Bình 24 3.1 Mẫu hạt bƣởi Trụ Lông sau tuần đƣợc khử trùng Javel 28 3.2 Mẫu hạt bƣởi độ tuổi khác sau tuần 29 3.3 Mẫu cấy đoạn chồi bên từ hạt sau tuần 31 3.4 Kết mẫu cấy đoạn chồi bên bƣởi Trụ Lông sử dụng kháng sinh 35 3.5 Mẫu cấy đoạn chồi bên tự nhiên cơng thức khử trùng khác 35 vii TĨM TẮT Để đánh giá tiềm kỹ thuật invitro với mong muốn bảo tồn di truyền có múi, phát triển bền vững cách tiếp cận sử dụng mẫu chồi bƣởi Trụ Lông (Citrus maxima (Burm.) Merr.) Bƣởi trụ Đại Bình (hay cịn gọi bƣởi Trụ Lơng) giống bƣởi q có từ lâu đời làng Đại Bình Đối với bƣởi Trụ Lơng Việt Nam, chƣa có nhà khoa học nghiên cứu khả nhân chồi in vitro Hạt bƣởi Trụ Lông độ tuổi khác thu thập huyện Nông Sơn, tỉnh Quảng Nam đƣợc khử trùng dung dịch Javel khoảng thời gian từ 5-20 phút, sau ni cấy mơi trƣờng MS, 30 g/l sucrose g/l than hoạt tính, kết cho thấy hạt độ tuổi tuần, tuần có tỷ lệ nảy mầm cao, chất lƣợng tốt Thời gian khử trùng Javel phút, cho tỉ lệ hạt sống cao, hạt không bị nhiễm Các đoạn chồi bên từ hạt bƣởi Trụ Lông đƣợc nuôi cấy môi trƣờng MS bổ sung BAP với nồng độ 02,5 mg/l Môi trƣờng MS có bổ sung 1,5 mg/l BAP mơi trƣờng thích hợp cho q trình hình thành chồi cho chất lƣợng chồi chiều dài tối ƣu Quy trình nhân chồi từ đoạn chồi bên ngồi tự nhiên đƣợc tiến hành đƣợc khảo sát dung dịch khử trùng khác nhau: Javel, HgCl2, Nano bạc, chất kháng sinh cho tỷ lệ nhiễm 100% Mặt khác, mẫu cấy chồi bƣởi đƣợc ƣơm hạt nhà lƣới cho tỉ lệ nhiễm 25% dùng chất kháng sinh Những kết cho thấy khả sống hạt tỷ lệ nảy mầm cao cho phép sử dụng hạt để thử nghiệm thời gian hái mùa thu hoạch, tìm đƣợc cơng thức tối ƣu cho khử trùng hạt Kết cho thấy nguồn gốc phận mẫu cấy đóng vai trị quan trọng q trình khử trùng Từ khóa: Ni cấy mơ, in vitro, Citrus maxima (Burm.) Merr 6-benzylaminopurine (BAP) viii CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khả nhân chồi đoạn chồi bên từ hạt 3.1.1 Ảnh hưởng Javel đến hiệu khử trùng hạt Vơ trùng mẫu cấy bƣớc đóng vai trị định thành cơng q trình nhân giống in vitro Vì vậy, cần lựa chọn phƣơng pháp khử trùng loại hóa chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu trƣớc đƣa vào mơi trƣờng ni cấy Có nhiều loại hóa chất đƣợc sử dụng để khử trùng Tuy nhiên, nồng độ khử trùng thích hợp cho đối tƣợng khác hoàn toàn khác Dựa vào kết nghiên cứu số tác giả công bố đối tƣợng cam quýt (Phan Hữu Tôn cs, 2014) Hạt bƣởi Trụ Lông đƣợc khử trùng cồn 70˚ phút, dung dịch Javel 0,5% khoảng thời gian khử trùng khác Kết đƣợc trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng điều kiện khử trùng đến khả nảy mầm hạt Hiệu khử trùng Thời gian khử trùng ( phút) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ nhiễm (%) 100 10 83,33 15 75 20 75 Sử dụng Javel 0,5% khử trùng hạt với thời gian tăng dần từ - 20 phút tỉ lệ hạt nhiễm 0% Khử trùng hạt Javel 0,5% thời gian phút, tỉ lệ sống cao, hạt không bị nhiễm Tỷ lệ hạt sống thấp thời gian khử trùng 15 phút 20 phút 75% Javen chất có hoạt tính khử trùng mạnh, có ảnh hƣởng đến mơ tế bào kéo dài thời gian khử trùng, javen xâm nhập vào phơi, hạt bị độc nên tái sinh đƣợc Kết nghiên cứu cho thấy, thời gian khử trùng có ảnh hƣởng lớn tới tỷ lệ sống hạt Javen có hiệu diệt nấm diệt khuẩn cao hạt bƣởi Trụ Lông Hạt bƣởi khử trùng phút javen vừa đủ, vừa có khả tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao kích thích mẫu tái sinh 27 Hình 3.1 Mẫu hạt bƣởi Trụ Lông sau tuần đƣợc khử trùng Javel (A), Javel phút; (B), Javel 10 phút; (C), Javel 15 phút; (D), Javel 20 phút 3.1.2 Ảnh hưởng độ tuổi hạt đến khả nảy mầm hạt Sự nảy mầm hạt phụ thuộc vào số yếu tố nhƣ độ ẩm, nhiệt độ bảo quản, độ ẩm tƣơng đối, áp suất…Tuy nhiên, ảnh hƣởng độ tuổi hạt khác tác động trực tiếp lên khả nảy mầm hạt sức sống từ hạt (Orbović cs, 2013) Tỷ lệ nảy mầm hạt bƣởi Trụ Lơng có độ tuổi từ tuần đến 10 tuần ngày tuổi đạt cao hạt 6, tuần tuổi, hạt tuần cho tỷ lệ nảy mầm thấp đạt 18,18% Điều giải thích hạt tuần măc dù xuất cấu trúc phôi nhƣng chƣa hồn chỉnh tích lũy hợp chất hữu nội nhũ chƣa đầy đủ cho nảy mầm Hạt 6, tuần tuổi cấu trúc phơi hồn chỉnh, tích lũy dinh dƣỡng dự trữ cần thiết nội nhũ đầy đủ cho hạt nảy mầm Ở hạt 10 tuần trƣởng thành tích lũy đầy đủ chất dinh dƣỡng cần thiết nhƣng chúng tích lũy số lƣợng lớn chất ức chế sinh trƣởng nhƣ ABA hợp chất phenol, giảm hàm lƣợng chất điều hòa 28 sinh trƣởng nhƣ auxin, GA3 cytokinin làm cho cân hormone (chủ yếu cân ABA/GA3) lệch phía tích lũy nhiều ABA Chính có mặt hàm lƣợng cao ABA ức chế tổng hợp enzyme thủy phân cần cho nảy mầm, trạng thái ngủ Do đó, hạt cần thời gian định để giảm hàm lƣợng ABA xuống mức tối thiểu.Vì vậy, hạt cần thời gian dài để giảm hàm lƣợng ABA nội sinh, tăng hàm lƣợng GA3 chúng chuyển từ trạng thái ngủ sang trạng thái hoạt động (Nguyễn Văn Kết cs, 2014) Bảng 3.2 Ảnh hƣởng độ tuổi đến khả nảy mầm hạt Khả nảy mầm hạt Độ tuổi hạt (tuần) Tỷ lệ nảy mầm (%) 18,18 100 Tỷ lệ nảy mầm cao, rễ dài , mập 100 Cây nảy mầm nhanh, rễ dài 10 - Hạt qua trạng thái nảy mầm Đặc điểm Lá mầm màu vàng, rễ ngắn, hoại tử Ghi chú: “-“: Không tượng Kết bảng 3.2 cho thấy khả sống hạt tỷ lệ nảy mầm cao phụ thuộc độ tuổi Tuổi hạt thí nghiệm đƣợc tính từ hoa thụ phấn đến thu hái mẫu Nghiên cứu khả nảy mầm hạt dựa độ tuổi để làm sở khoa học cho đƣờng nhân giống in vitro từ hạt sau Ảnh hƣởng tuổi đến chất lƣợng hạt tỷ lệ nảy mầm bƣởi 'Duncan', 'Flame' cam 'Hamlin' đƣợc nghiên cứu (Orbović cs, 2013) Hình 3.2 Mẫu hạt bƣởi độ tuổi khác sau tuần (A), Hạt bƣởi độ tuổi tuần; (B), Hạt bƣởi độ tuổi 10 tuần 29 3.1.3 Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi đoạn chồi bên từ hạt Cho đến nghiên cứu hệ thống tái sinh loài cam quýt đƣợc báo cáo cho thấy ảnh hƣởng quan trọng nồng độ cytokinin loại tỷ lệ cytokininauxin việc tái sinh từ loại mẫu cấy khác chúng (Paudyal KP cs, 2000; Duran Villa N cs, 1989; Silva RP cs, 2006) BAP thuộc nhóm điều hịa sinh trƣởng cytokinin sử dụng phổ biến để cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động mơ phân sinh, hạn chế già hóa tế bào đồng thời thúc đẩy phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển nhiều lồi thực vật khác (Huetteman cs, 1993) Theo nhiều nghiên cứu cho biết, BAP thường sử dụng với nồng độ thay đổi từ 1,0 - 3,0 mg/l thích hợp cho nhiều loại mô nuôi cấy Ở nồng độ cao thấp biểu hiệu kích thích Với nồng độ cao hoạt hóa hình thành chồi bất định Tác dụng chủ yếu BA kích thích phân chia mạnh mẽ tế bào, ảnh hưởng rõ rệt lên hình thành phân hóa chồi (Huetteman cs, 1993) Qua tìm hiểu số kết nghiên cứu nuôi cấy in vitro cam quýt cho thấy, tác giả Phan Hữu Tôn (2014) tác giả Rezadost (2013) sử dụng đoạn trụ mầm, tác giả Rosely (2006) sử dụng thân mầm mọc từ hạt khử trùng để làm vật liệu mẫu ban đầu tạo đa chồi số giống cam quýt Vì nghiên cứu này, tiến hành thử nghiệm ảnh hƣởng nồng độ BAP nồng độ 0; 0,5; 1; 1,5; 2,5 mg/l môi trƣờng MS nhằm đánh giá khả nhân chồi bƣởi Trụ Lông in vitro Bảng 3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân chồi đoạn chồi bên từ hạt Khả nhân chồi in vitro Nồng độ BAP (mg/l) Tỷ lệ nảy chồi (%) Số chồi/ mẫu Chiều dài chồi (cm) 48,51 0,40±0,14 - - 0,5 - - - - 1,5 73,87 1,45±0,07 69,11 0,95±0,07 2,5 59,93 0,95±0,21 Ghi chú: “-“: Khơng tượng 30 Kết trình bày bảng 3.3 cho thấy, môi trƣờng MS có bổ sung BAP (0,5 2,5 mg/l) kích thích tạo chồi in vitro Nồng độ BA khác khả sinh trưởng tái sinh chồi in vitro khác Ở nồng độ 1.5 mg/l BAP cho chiều dài chiều cao nhất, chồi mập , to xanh đậm Ngƣợc lại nồng độ 0.5-1 mg/l không cho kết sinh trƣởng chồi Theo nghiên cứu tác giả Ehsan E cs đối tượng có múi Ở cơng bố nhóm tác giả tái sinh in vitro từ mô trưởng thành cam Thomson, chồi phát triển tốt môi trường MS có bổ sung BAP 1mg/l thu 3,2 chồi/mẫu Tùy giống nuôi cấy, sử dụng nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng khác để thu hiệu tạo đa chồi tốt Để nghiên cứu khả nhân nhanh chồi bƣởi Trụ Lông cần tiến hành thêm nghiên cứu để xác định số lần cấy chuyển nhằm tăng hiệu nhân chồi, để tìm đƣợc nồng độ BAP tốt đến khả nhân nhanh chồi bƣởi Trụ Lơng cần phải tiến hành thêm thí nghiêm khác nồng độ khác Tuy nhiên, khn khổ đề tài này, thời gian có hạn chƣa tiến hành đƣợc thử nghiệm nồng độ khác số lần cấy chuyển Hình 3.3 Mẫu cấy đoạn chồi bên từ hạt sau tuần (A),0 mg/l BAP; (B), 0,5 mg/l BAP; (C), mg/l BAP; (D), 1,5 mg/l BAP; (E), mg/l BAP; (F), 2,5 mg/l BAP Thanh “ ": 0,5 cm 3.2 Khả nhân chồi đoạn chồi bên ngồi tự nhiên Trong giai đoạn vơ mẫu, mẫu cấy nguồn gây nhiễm đƣợc xem giai đoạn khó vi nhân giống Một yếu tố quan trọng tạo giống bệnh in vitro mẫu cấy cần phải vơ trùng, điều kiện ni cấy giàu dinh dưỡng nấm vi khuẩn phát triển nhanh chóng làm hỏng mẫu cấy 31 Sau ngày cấy quan sát tỷ lệ mẫu nhiễm Cây ăn có múi thường bị nhiều loại sâu bệnh cơng mẫu đưa từ vườn vào tồn trữ nhiều loại bào tử nấm, vi khuẩn Trong trình khử trùng, mẫu cấy đƣợc xử lý tác nhân khử trùng với thời gian thích hợp để tạo nguồn mẫu in vitro Trong thí nghiệm này, mẫu chồi đƣợc tiến hành khử trùng với công thức sau 3.2.1 Ảnh hưởng HgCl2 đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên tự nhiên Phƣơng thức vô trùng mẫu cấy phổ biến thƣờng sử dụng hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn nhƣ: calcium hypochlorite, sodium hypochlorite, nƣớc bromine, H2O2, HgCl2 Dung dịch HgCl2 đƣợc đánh giá có hiệu diệt khuẩn thƣờng đƣợc sử dụng nồng độ 0,1% Nghiên cứu đề cập đến ảnh hƣởng nồng độ HgCl2 khác thời gian xử lý khác khử trùng bề mặt mẫu Khử trùng bề mặt mẫu đƣợc thực với dung dịch HgCl2 0.1% khoảng thời gian khác từ 10 đến 25 phút Ảnh hƣởng thời gian xử lý đến khử trùng bề mặt mẫu đƣợc tổng hợp Bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng HgCl2 đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên tự nhiên Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Đặc điểm mẫu 10 100 Mẫu xanh, khuẩn, nấm 15 100 Mẫu xanh, khuẩn, nấm 20 100 Mẫu ngả vàng, khuẩn,nấm 25 100 Mẫu ngả vàng, khuẩn,nấm Với nồng độ HgCl2 0,1% xử lý thời gian ngắn giết chết vi sinh vật bề mặt mẫu, tất mẫu nuôi cấy bị nhiễm sau 4-6 ngày nuôi cấy Khi tăng thời gian sử dụng nồng độ HgCl2 gây chết mơ cấy mẫu đoạn chồi bên bƣởi Trụ Lông nhiễm 3.2.2 Ảnh hưởng Javel đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên tự nhiên Chồi bƣởi Trụ Lông đƣợc khử trùng dung dịch Javel 0,5% thời gian 10, 15, 20, 25 phút, sau đƣợc cấy vào mơi trƣờng MS Kết theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm sau ngày đƣợc trình bày bảng 3.5 32 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng Javel đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên tự nhiên Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Đặc điểm mẫu 10 100 Mẫu xanh, nấm, khuẩn 15 100 Mẫu xanh , nấm , khuẩn 20 100 Mẫu ngả vàng, khuẩn, nấm 25 100 Mẫu ngả vàng, khuẩn, chết Kết sau ngày cho thấy mức thời gian từ 10 đến 25 cho tỷ lệ nhiễm 100% Theo số tác giả nhƣ Dƣơng Công Kiên (2006) Nguyễn Bảo Toàn (2004), thời gian xử lý mẫu cấy việc sử dụng Sodium hypochloride hay Javel cơng nghiệp có chứa thành phần hoạt tính Hypochloride khoảng 5.25% thích hợp từ – 30 phút 3.2.3 Ảnh hưởng công thức khử trùng kết hợp đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên tự nhiên Nano bạc đƣợc chứng minh có tính kháng khuẩn cao, ảnh hƣởng tới sinh sản hô hấp thực vật (Abdi cs., 2008; Lok cs., 2007) Theo nghiên cứu Mahna đồng tác giả (2013), nano bạc có vai trị khử trùng mẫu cấy ban đầu nhƣ hạt giống hay chồi cây, kết cho thấy nano bạc có hiệu khử trùng lên tới 100% thay thủy ngân nhƣ chất khử trùng mẫu Các công thức khử trùng phối trộn cấy môi trƣờng MS + mg/l nano bạc đƣợc quan sát bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng công thức khử trùng kết hợp đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên từ tự nhiên CT Thời gian (phút) Tỷ lệ nhiễm (%) Đặc điểm mẫu Javel +HgCl2 0,1% 10+10 100 Mẫu xanh, khuẩn, nấm Nano bạc 40 100 Mẫu ngả vàng, khuẩn, nấm Nano bạc+ Tween 80 40 100 Mẫu ngả vàng, khuẩn, chết, nấm Nano bạc + Javel 50% 40 100 Mẫu ngả vàng, chết, khuẩn 33 Kết bảng 3.6 sử dụng công thức khử trùng HgCl2 Javel chồi cho mẫu chồi xanh nhƣng sau ngày quan sát nhiễm 100% Các công thức khử trùng với nano bạc cho kết nhiễm 100%, mẫu ngả vàng Theo kết nghiên cứu Đồng Huy Giới cs (2019) Nồng độ dung dịch nano bạc thích hợp cho việc khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng 125 mg/l, thời gian xử lí 40 phút, bổ sung mg/l nano bạc vào môi trƣờng tạo chồi lan Hồ điệp vàng từ PLB cho hiệu tạo chồi tốt Theo Esmaeilnia, E., & Dehestani, A (2015) chồi Citrus sinensis (L.) đƣợc tiến hành khử trùng với HgCl2 phút tráng lại nƣớc cất khử trùng lại Javel phút kết hợp với Tween 20 Sau tuần mẫu cấy sƣng phồng bề mặt từ phát triển bất ngờ 3.2.4 Ảnh hưởng chất kháng sinh đến hiệu khử trùng đoạn chồi bên tự nhiên Kháng sinh (Anbibiotics) hay gọi trụ sinh, kháng khuẩn đƣợc mua bán sử dụng phổ biến (Ampicillin, Amoxyllin, Carbenicillin, Ticarcillin, gentamycin, hygromycin B, Kanamycin, Neomycin, Streptomycin, Paromycin…) nuôi cấy mô thực vật nhằm để ngăn chặn phát hay tiêu diệt phát triển khuẩn, nấm mốc Trong nuôi cấy mô thực vật ngƣời ta dùng kháng sinh để hạn chế phát triển vi sinh vật dùng với mục đích chọn lọc mơi trƣờng chứa kháng sinh Các loại kháng sinh đƣợc sản xuất đối tƣợng sinh vật khác sản xuất nhân tạo Nếu ni cấy mơ bị nhiễm bệnh sau khử trùng bề mặt nên ngâm kháng sinh với nồng độ 40-50 mg/l 30-60 phút với nồng độ 50-100 mg/l thời gian 30 phút Tetracyclin kháng sinh tiêu biểu nhóm kháng sinh Tetracyclin, đƣợc chiết xuất từ việc nuôi cấy nấm Strytomyces aureofocicus hay Streptomyces virilifacieus Tetracyclin tự nhiên gốm thuốc: Tetracyclin, Chlotetracyclin Oxytetracyclin Zacchini, Agazio (2004) báo cáo sử dụng thủy ngân clorua sodium hypochloride bƣớc khử trùng kháng sinh bổ sung môi trƣờng ni cấy giúp khắc phục tình trạng nhiễm nghiêm trọng nuôi cấy ô liu Nebbiar Kết sau sử dụng Tetracylin để ngâm mẫu bổ sung vào môi trƣờng cho tỷ lệ nhiễm 100% mẫu chồi bên bƣởi Trụ Lông làng Đại Bình, 25% chồi bƣởi đƣợc gieo hạt ngồi nhà lƣới 34 Hình 3.4 Kết mẫu cấy đoạn chồi bên bƣởi Trụ Lông sử dụng kháng sinh (A), Mẫu cấy chồi bên tự nhiên (sau ngày); (B), Mẫu cấy chồi bên từ bƣởi Trụ Lông đƣợc trồng nhà lƣới (cây con) (sau tuần) Từ kết bảng 3.4, 3.5 3.6 hình 3.3 cho thấy mơi trƣờng bên ngồi ln có nhiều vi sinh vật bám bề mặt, rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy… mẹ, nơi cƣ ngụ vững mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc đƣợc chúng Mẫu chồi bên bƣởi Trụ Lông xử lí cơng thức khử trùng khác cho kết nhiễm 100% xử lí thuốc diệt nấm từ trước Kết cho thấy nguồn gốc phận mẫu cấy đóng vai trị quan trọng q trình khử trùng (B Saurabh cs, 2015) Hầu hết công thức nhiễm khuẩn nấm, nhiễm khuẩn trƣờng hợp thƣờng gây vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy quan sát rõ xem từ dƣới đáy chai ni cấy Hình 3.5 Mẫu cấy đoạn chồi bên ngồi tự nhiên cơng thức khử trùng khác (A), Javel; (B), Nano bạc+Tween; ( C), Chất kháng sinh; (D), HgCl2 + Javel; (E), HgCl2; ( F), Nano bạc+Javel 50%; (G), Nano bạc 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết luận dựa sở kết nghiên cứu cho thấy: - Khử trùng mẫu ethanol 70˚ phút, Javel 0,5% phút cho hiệu khử trùng tốt với hạt bƣởi Trụ Lông; với tỉ lệ mẫu vơ trùng sống sót đạt 100%, sau tuần nuôi cấy - Hạt bƣởi Trụ Lông độ tuổi 4, 6, 8, 10 tuần khử trùng cồn 70˚ 60 giây dung dịch Javel phút Tỷ lệ nảy mầm hạt bƣởi Trụ Lông đạt cao độ tuổi 6, tuần Tỷ lệ nảy mầm cao, nảy mầm nhanh - Mơi trƣờng MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 1.5 mg/l BAP mơi trƣờng thích hợp để nhân chồi in vitro bƣởi Trụ Lông; chiều cao chồi 1,45 cm sau tuần nuôi cấy - Phƣơng pháp khử trùng mẫu chồi trƣởng thành với Javel 0,5%; HgCl2 0,1%; Nano bạc 125 mg/l; Tetracyclin cho tỷ lệ nhiễm 100% với nồng độ khác Kiến nghị Cây bƣởi Trụ Lông loại ăn đối tƣợng đƣợc đƣa vào nghiên cứu in vitro Trên kết bƣớc đầu, hạn chế thời gian nghiên cứu nên đề nghị vấn đề sau: - Tiếp tục xác định môi trƣờng tối ƣu cho nhân chồi in vitro bƣởi Trụ Lông - Khảo sát ảnh hƣởng số lần cấy chuyển đến khả sinh trƣởng chồi in vitro - Tiến hành nghiên cứu biện pháp khử trùng chồi bên bƣởi Trụ Lơng ngồi tự nhiên để cơng thức khử trùng phù hợp - Tiến hành khảo sát số điều kiện môi trƣờng nuôi cấy để tạo rễ in vitro, tối ƣu hóa mơi trƣờng ni cấy - Tiến hành khảo sát số điều kiện để đƣa bƣởi Trụ Lơng in vitro trồng ngồi tự nhiên - Xây dựng kỹ thuật ghép in vitro tạo bƣởi Trụ Lông 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdi G, Salehi H, Khosh-khuri M (2008) Nano silver: Anovel nanomaterial for removal of bacterial contamination in Valerian (V officinalis) tissue culture Acta Physiol Planta J 30: 709-714 B Saurabh, Plant tissue culture, Modern Applications of Plant Biotechnology in Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Bahadurgarh, Haryana, India, 31– 107, 2015 Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn nhiệt đới, tập (1), Nxb Nông thôn Cervera, M., Juarez, J., Navarro, A., Pina, J.A., Duran-Vila, N., Navarro, L., Pena, L (1998): Genetic transformation and regeneration of mature tissue of woody fruit plants bypassing the juvenile stage Transgenic Research 7: 51- 59 Chen Q., Xu C J (2005), "Effect of artificial pollination on fruit development and quality in storage of Yongjiazaoxiangyou pomelo, China", Journal of Fruit Science Chilembwe, E.H.C., W.S Castle, and D.J Cantliffe 1992 Grading, hydrating, and osmotically priming seed of four Citrus rootstocks to increase germination rate and seedling uniformity J Amer Soc Hort Sci 117:368–372 Cục Nông nghiệp thành phố Phúc Châu, Phúc Kiến (2009), Tình hình sản xuất kỹ thuật trồng bƣởi tỉnh Phúc Kiến, Tài liệu hƣớng dẫn kỹ thuật Đào Thanh Vân, Ngơ Xn Bình (2003), Giáo trình ăn (dành cho cao học), NXB Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Chi Mai, Đặng Hòa Hiếu, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi trực tiếp từ thân mầm cam sành (Citrus nobilis loureiro) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 363- 370 Đồng Huy Giới, Bùi Thị Thu Hƣơng (2019) Nghiên cứu sử dụng Nano bạc nhân giống In vitro Lan hồ điệp vàng (Phalaenopsis sp.) Dƣơng Công Kiên 2006 Nuôi cấy mô, tập Nhà xuất ðại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh p: 41 – 43 Đƣờng Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bƣởi kỹ thuật trồng, NXB Lao động - xã hội 37 Duran Villa N, Ortega V, Navarro L (1989) Hình thái học ni cấy mơ ba lồi Citrus Nuôi cấy mô quan tế bào thực vật 16: 123-133 Ehsan E and D Ali (2015) In vitro plant regeneration from mature tissues of Thomson navel sweet orange (Citrus sinensis L Osbeck), Rumani Esmaeilnia, E., & Dehestani, A (2015) In vitro plant regeneration from mature tissues of Thomson navel sweet orange (Citrus sinensis L Osbeck.) Biharean Biologist, 9(1), 9-14 Freeman T., Robbertse P J (2003), "Internal quality of Valencia ‟orange fruit as influenced by tree fruit position and winter girdling" Hà Minh Trung, Ngô Vĩnh Viễn, Lê Mai Nhất, Mai Thị Liên Nguyễn Thị Bích Ngọc (2008) Hồn thiện ứng dụng cơng nghệ sản xuất có múi đ c sản (cam, quýt, bưởi) bệnh greening bệnh virus khác tỉnh phía Bắc Tuyển tập cơng trình nghiên cứu chuyển giao khoa học công nghệ Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Hà Thanh Võ (2005) Nghiên cứu kĩ thuật vi ghép Bưởi Khóa luận tốt nghiệp Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Hà Thị Thúy, Đỗ Năng Vịnh (2004), Nghiên cứu tạo mơ sẹo phơi hóa phơi vơ tính từ ni cấy nỗn số giống ăn có múi, Tạp chí Di truyền Ứng dụng, trang 13-19 Hoàng Minh (2005), Sổ tay kỹ thuật trồng chăm sóc số chủng loại ăn quả, Nxb Lao động – Xã hội, Hà Nội Hoàng Thị Sản, Phân loại thực vật, NXB Giáo dục Huetteman C, A, and J, E, Preece - Thidiazuron: a potent cytokinin for wood plant tissue culture, Plant Cell Tiss, Org, Cult, 33(1993) 05–119 Kobayashi, A.K., Bespalhok, J.C., Pereira, L.F.P., Vieira, L.G.E (2003): Plant regeneration of sweet orange (Citrus sinensis) from thin sections of mature stem segments Plant Cell Tissue and Organ Culture 74: 99-102 Komal G., Shanma R., P K singh and Govind singh (2013), In vitro propagation produces seedless lime (Citrus limon L cv Kaghzi Kalan) and genetic evaluation of the plant, Plant physiology pp 131-145 Lok CN, Ho CM, Chen R, He QY, Yu WY, Sun H, Tam PKH, Chiu JF, Che CM (2007) Silver nanoparticles: Partial oxidation and activities Biol Inor Chem 12: 527- 534 38 Mahna N, Vahed SZ, Khani S (2013) Plant in vitro culture goes nano: NanosilverMediated decontamination of ex vitro Explants J Nanomed Nanotechol 4: Marutani-Hert, M., Bowman, K.D., McCollum, G.T., Mirkov, T.E., Evens, T.J., Niedz, R.P (2012): A dark incubation period is important for Agrobacterium-mediated transformation of mature internode explants of sweet orange, grapefruit, citron, and a citrange rootstock PLoS ONE 7: e47426 Ngơ Hồng Bình (2006), Kỹ thuật trồng số ăn vùng duyên hải miền Trung, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Ngo Xuan Binh (2001), Study of self-incompatibility in Citrus with special emphases on the pollen tube growth and allelic variation, Ph.D thesis Kyushu University – Japan Nguyễn Bảo Tồn 2004 Giáo trình ni cấy mơ tế bào thực vật, Khoa Nông Nghiệp SHƢD, Trƣờng ðại Học Cần Thơ p: 16 – 18, 25 – 33, 43 – 51 Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Sổ tay trồng ăn quả, NXB Nông nghiệp Nguyễn Quỳnh Hoa (2010), “Nghiên cứu đặc tính nơng sinh học bƣởi Diễn chọn lọc ảnh hƣởng số biện pháp kỹ thuật đến suất phẩm chất bƣởi Diễn trồng xã Minh Khai - Từ Liêm - Hà Nội”, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Văn Kế (2001), Cây ăn nhiệt đới, Nxb Nông nghiệp, Tp HCM Nguyễn, Văn Kết, Thị Cúc Nguyễn, and Trung Thành Nguyễn "Khảo sát khả nhân giống Trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy) in vitro." (2014) Orbović, V., Dutt, M., & Grosser, JW (2013) Evaluation of the Germination Potential of Citrus Seeds during the Harvesting Season HortScience , 48 (9), 1197-1199 Paudyal KP, Haq N (2000) Trong ống nghiệm nhân giống Pummelo (Citrus grandis L Qsbeck) Trong ống nghiệm Nhà máy Cell Dev Biol 36: 511-516 Phan Hữu Tôn, Tống Văn Hải, Đoàn Văn Lƣ, Phạm Thị Dung, Nguyễn Xuân Viết “Nuôi cấy in vitro trụ mầm giống cam (Citrus sinensis), quýt (Citrus reticulata)”, Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, tập 12, số 5: 641-649 Plant Physiology online, http://www.biology-online.org 39 Quyết định số: 1127/QĐ-UBND Thành phố Hà Nội việc phê duyệt “Đề án phát triển số loại ăn có giá trị kinh tế cao Thành phố Hà Nội giai đoạn 2012 – 2016” Rezadost M., Hosein S (2013), In vitro regeneration of sour orange (Citrus aurantium L.) via direct organogenesis, 55 (3) pp.137-164 Rosely P., Weliton A B., Elma d S., (2008), In vitro organogenesis from adult tissue of „Bahia‟ sweet orange (Citrus sinensis L Osbeck), Brasil, pp 367-371 Shahid A K et al (2011), Regeneration in vitro from non-pollinated flowers of sweet citrus (Citrus sinensis L Osbeck), African Journal of Biotechnologyp 15.13015.134 Silva RP, Almeida WAB, Souza ES, Filho FAAM (2006) Trong ống nghiệm sinh quan từ mô trƣởng thành cam 'Bahia' (Citrus sinensis) Trái 61: 367371 Sunette L (2004), South African Journal of Plant and Soil, pp 199-202 Tallon, C.I., Porras, I., Perez-Tornero, O (2013): High efficiency in vitro organogenesis from mature tissue explants of Citrus macrophylla and C aurantium In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 49: 145-155 Tổng cục thống kê (2011), Niên giám thống kê 2010, Nxb Thống kê, Hà Nội Trần Nhƣ Ý, Đào Thanh Vân, Nguyễn Thế Huấn (2000), Giáo trình ăn quả, Đại học Nông lâm Thái Nguyên, NXB Nơng nghiệp Trần Thế Tục, Vũ Mạnh Hải, Đỗ Đình Ca (1996), “Các vùng trồng cam quýt Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp Cơng nghiệp thực phẩm, 408, trang 106 – 137 Trần Văn Hâu (2009), Giáo trình xử lý hoa ăn trái, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Trần Văn Minh (1994), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Phân viện Cơng nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Walter Reuther et al (1989), The citrus industry Vol (2), Puplication of University of California, USA Zacchini M, Agazio M (2004) Micropropagation of a local olive cultivar for germplasm preservation Biol Plant 48: 589-592 40 PHỤ LỤC Bảng thành phần môi trƣờng Murashige - Skoog (MS, 1962) Stock MS1 MS2 MS3 Hóa chất Thành phần (mg/l) Dung tích dùng cho lít mơi trƣờng 20 ml KNO3 1900 KH2PO4 170 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 10 ml H3BO3 6,2 10 ml MnSO4.4H2O 22,3 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 ZnSO4.4H2O 8,6 Na2MoO4.2H20 0,25 KI 0,83 FeSO4.7H20 27,8 Na2-EDTA 37,3 Glycine Myo-Inositol 100 Thiamine HCL 0,5 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCL 0,5 10 ml MS4 MS5 41 10 ml ... SƢ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG  ĐẶNG THỊ HỒNG LINH NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI IN VITRO CỦA CÂY BƢỞI TRỤ LÔNG (Citrus maxima (Burm.) Merr.) Chuyên ngành:... giá khả nhân chồi bƣởi Trụ Lông in vitro Bảng 3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân chồi đoạn chồi bên từ hạt Khả nhân chồi in vitro Nồng độ BAP (mg/l) Tỷ lệ nảy chồi (%) Số chồi/ mẫu Chiều dài chồi. .. lí trên, tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả nhân chồi in vitro bưởi Trụ Lông (Citrus maxima (Burm.) Merr.)? ?? nhằm tạo giống tốt, bệnh phục vụ sản xuất mở rộng diện