CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khả năng nhân chồi của đoạn chồi bên của cây con từ hạt
3.1.1 Ảnh hưởng của Javel đến hiệu quả khử trùng hạt
Vơ trùng mẫu cấy là bƣớc đầu tiên đóng vai trị quyết định sự thành cơng của q trình nhân giống in vitro. Vì vậy, cần lựa chọn phƣơng pháp khử trùng và loại hóa chất
thích hợp để loại bỏ hoàn toàn các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu trƣớc khi đƣa vào mơi trƣờng ni cấy. Có rất nhiều loại hóa chất đƣợc sử dụng để khử trùng. Tuy nhiên, nồng độ khử trùng thích hợp cho các đối tƣợng khác nhau là hoàn toàn khác nhau. Dựa vào kết quả nghiên cứu của một số tác giả đã công bố trên đối tƣợng cam quýt (Phan Hữu Tôn và cs, 2014). Hạt bƣởi Trụ Lông đƣợc khử trùng bằng cồn 70˚ trong 1 phút, dung dịch Javel 0,5% các khoảng thời gian khử trùng khác nhau. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của các điều kiện khử trùng đến khả năng nảy mầm của hạt.
Thời gian khử trùng ( phút) Hiệu quả khử trùng Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ nhiễm (%) 5 100 0 10 83,33 0 15 75 0 20 75 0
Sử dụng Javel 0,5% khử trùng hạt với thời gian tăng dần từ 5 - 20 phút thì tỉ lệ hạt nhiễm 0%. Khử trùng hạt bằng Javel 0,5% trong thời gian 5 phút, tỉ lệ sống cao, hạt không bị nhiễm. Tỷ lệ hạt sống thấp khi thời gian khử trùng là 15 phút và 20 phút là 75%. Javen là chất có hoạt tính khử trùng mạnh, có ảnh hƣởng đến mơ tế bào do đó nếu kéo dài thời gian khử trùng, javen có thể xâm nhập vào phôi, hạt bị độc nên không thể tái sinh đƣợc.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian khử trùng có ảnh hƣởng khá lớn tới tỷ lệ sống của hạt. Javen có hiệu quả diệt nấm và diệt khuẩn cao đối với hạt của cây bƣởi Trụ Lông. Hạt bƣởi khử trùng 5 phút trong javen là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu tái sinh.
Hình 3.1. Mẫu hạt bƣởi Trụ Lông sau 4 tuần đƣợc khử trùng bằng Javel.
(A), Javel 5 phút; (B), Javel 10 phút; (C), Javel 15 phút; (D), Javel 20 phút.
3.1.2. Ảnh hưởng của độ tuổi hạt đến khả năng nảy mầm của hạt
Sự nảy mầm của hạt phụ thuộc vào một số yếu tố nhƣ độ ẩm, nhiệt độ bảo quản, độ ẩm tƣơng đối, áp suất…Tuy nhiên, ảnh hƣởng của độ tuổi hạt khác nhau tác động trực tiếp lên khả năng nảy mầm của hạt và sức sống của cây con từ hạt đó (Orbović và cs, 2013).
Tỷ lệ nảy mầm hạt bƣởi Trụ Lơng có độ tuổi từ 4 tuần đến 10 tuần ngày tuổi và đạt cao nhất ở hạt 6, 8 tuần tuổi, ở hạt 4 tuần cho tỷ lệ nảy mầm thấp đạt 18,18%. Điều này có thể giải thích ở những hạt 4 tuần măc dù đã xuất hiện cấu trúc phôi nhƣng chƣa hồn chỉnh và sự tích lũy các hợp chất hữu cơ trong nội nhũ chƣa đầy đủ cho sự nảy mầm. Hạt 6, 8 tuần tuổi cấu trúc phôi đã hồn chỉnh, sự tích lũy dinh dƣỡng dự trữ cần thiết trong nội nhũ đầy đủ cho hạt nảy mầm. Ở hạt 10 tuần tuy đã trƣởng thành và tích lũy đầy đủ chất dinh dƣỡng cần thiết nhƣng do chúng tích lũy một số lƣợng lớn các chất ức chế sinh trƣởng nhƣ ABA và các hợp chất phenol, trong khi đó giảm hàm lƣợng các chất điều hịa
sinh trƣởng nhƣ auxin, GA3 và cytokinin làm cho sự cân bằng hormone (chủ yếu là sự cân bằng ABA/GA3) lệch về phía tích lũy nhiều ABA. Chính sự có mặt ở hàm lƣợng cao của ABA đã ức chế tổng hợp enzyme thủy phân cần cho sự nảy mầm, cây ở trạng thái ngủ. Do đó, hạt cần một thời gian nhất định để giảm hàm lƣợng ABA xuống mức tối thiểu.Vì vậy, hạt cần một thời gian dài để giảm hàm lƣợng ABA nội sinh, tăng hàm lƣợng GA3 trong chúng và chuyển từ trạng thái ngủ sang trạng thái hoạt động (Nguyễn Văn Kết và cs, 2014).
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của độ tuổi quả đến khả năng nảy mầm của hạt
Độ tuổi hạt (tuần)
Khả năng nảy mầm của hạt
Tỷ lệ nảy mầm (%) Đặc điểm
4 18,18 Lá mầm màu vàng, rễ ngắn, hoại tử
6 100 Tỷ lệ nảy mầm cao, rễ dài , mập
8 100 Cây nảy mầm nhanh, rễ dài 10 - Hạt đã qua trạng thái nảy mầm
Ghi chú: “-“: Không hiện tượng
Kết quả bảng 3.2 cho thấy khả năng sống của hạt và tỷ lệ nảy mầm cao phụ thuộc của độ tuổi quả. Tuổi của hạt trong thí nghiệm này đƣợc tính từ khi hoa thụ phấn đến khi thu hái mẫu. Nghiên cứu khả năng nảy mầm của hạt dựa trên độ tuổi để làm cơ sở khoa học cho các con đƣờng nhân giống in vitro từ hạt sau này. Ảnh hƣởng của tuổi quả đến
chất lƣợng hạt và tỷ lệ nảy mầm của bƣởi 'Duncan', 'Flame' và cam ngọt 'Hamlin' đã đƣợc nghiên cứu (Orbović và cs, 2013).
Hình 3.2. Mẫu hạt bƣởi ở các độ tuổi khác nhau sau 4 tuần. (A), Hạt bƣởi ở độ tuổi 6
3.1.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi của đoạn chồi bên của cây con từ hạt
Cho đến nay các nghiên cứu về hệ thống tái sinh của các loài cam quýt đƣợc báo cáo đã cho thấy ảnh hƣởng quan trọng của nồng độ cytokinin và loại hoặc tỷ lệ cytokinin- auxin trong việc tái sinh từ các loại mẫu cấy khác nhau chúng (Paudyal KP và cs, 2000; Duran Villa N và cs, 1989; Silva RP và cs, 2006).
BAP thuộc nhóm điều hòa sinh trƣởng cytokinin được sử dụng phổ biến để cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự già hóa của tế bào đồng thời thúc đẩy sự phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển ở nhiều lồi thực vật khác nhau (Huetteman và cs, 1993). Theo nhiều nghiên cứu cho biết, BAP thường được sử dụng với nồng độ thay đổi từ 1,0 - 3,0 mg/l là thích hợp cho nhiều loại mơ ni cấy. Ở các nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém. Với nồng độ cao sẽ hoạt hóa hình thành chồi bất định.
Tác dụng chủ yếu của BA là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào, ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa chồi (Huetteman và cs, 1993)
Qua tìm hiểu một số kết quả nghiên cứu trong ni cấy in vitro ở cam quýt cho thấy, tác giả Phan Hữu Tôn (2014) và tác giả Rezadost (2013) đã sử dụng đoạn trụ trên lá mầm, tác giả Rosely (2006) sử dụng thân mầm mọc từ hạt đã khử trùng để làm vật liệu mẫu ban đầu trong tạo đa chồi ở một số giống cam quýt. Vì vậy trong nghiên cứu này, đã tiến hành thử nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ BAP ở các nồng độ 0; 0,5; 1; 1,5; 2 và 2,5 mg/l trong môi trƣờng cơ bản MS nhằm đánh giá khả năng nhân chồi cây bƣởi Trụ Lông in vitro.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân chồi của đoạn chồi bên của cây
con từ hạt.
Nồng độ BAP (mg/l)
Khả năng nhân chồi in vitro Tỷ lệ nảy chồi
(%) Số chồi/ mẫu Chiều dài chồi (cm) 0 48,51 1 0,40±0,14 0,5 - - - 1 - - - 1,5 73,87 1 1,45±0,07 2 69,11 1 0,95±0,07 2,5 59,93 1 0,95±0,21
Kết quả trình bày bảng 3.3 cho thấy, mơi trƣờng cơ bản MS có bổ sung BAP (0,5 - 2,5 mg/l) đã kích thích tạo chồi in vitro. Nồng độ BA khác nhau thì khả năng sinh trưởng và tái sinh chồi in vitro khác nhau. Ở nồng độ 1.5 mg/l BAP cho chiều dài chiều cao nhất, chồi mập , lá to xanh đậm. Ngƣợc lại ở nồng độ 0.5-1 mg/l không cho kết quả sinh trƣởng chồi. Theo nghiên cứu của tác giả Ehsan E. và cs trên đối tượng cây có múi. Ở cơng bố của nhóm tác giả này khi tái sinh in vitro từ mô trưởng thành của cây cam ngọt
Thomson, chồi phát triển tốt nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 1mg/l thu được 3,2 chồi/mẫu. Tùy từng giống nuôi cấy, sử dụng nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau để thu được hiệu quả tạo đa chồi tốt nhất.
Để nghiên cứu về khả năng nhân nhanh chồi cây bƣởi Trụ Lông cần tiến hành thêm các nghiên cứu để xác định số lần cấy chuyển nhằm tăng hiệu quả nhân chồi, để tìm ra đƣợc nồng độ BAP tốt nhất đến khả năng nhân nhanh của chồi cây bƣởi Trụ Lông cần phải tiến hành thêm thí nghiêm khác ở các nồng độ khác nhau. Tuy nhiên, trong khuôn khổ đề tài này, thời gian có hạn chúng tơi chƣa tiến hành đƣợc thử nghiệm ở các nồng độ khác và về số lần cấy chuyển.
Hình 3.3. Mẫu cấy đoạn chồi bên của cây con từ hạt sau 8 tuần. (A),0 mg/l BAP; (B), 0,5
mg/l BAP; (C), 1 mg/l BAP; (D), 1,5 mg/l BAP; (E), 2 mg/l BAP; (F), 2,5 mg/l BAP. Thanh “ ": 0,5 cm.