CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Khả năng nhân chồi của đoạn chồi bên của cây ngoài tự nhiên
Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng đƣợc xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống Một trong những yếu tố quan trọng trong tạo giống sạch bệnh in vitro là mẫu cấy cần phải được vơ trùng, vì trong điều kiện ni cấy
Sau 3 ngày cấy có thể quan sát được tỷ lệ mẫu nhiễm. Cây ăn quả có múi thường bị rất nhiều loại sâu bệnh tấn cơng vì vậy khi mẫu được đưa từ trong vườn vào sẽ tồn trữ rất nhiều loại bào tử nấm, vi khuẩn.
Trong quá trình khử trùng, các mẫu cấy đƣợc xử lý bằng tác nhân khử trùng với thời gian thích hợp để tạo nguồn mẫu in vitro. Trong thí nghiệm này, mẫu chồi đƣợc tiến hành khử trùng với các công thức sau.
3.2.1. Ảnh hưởng của HgCl2 đến hiệu quả khử trùng của đoạn chồi bên của cây ngồi tự nhiên
Phƣơng thức vơ trùng mẫu cấy phổ biến nhất hiện nay thƣờng sử dụng các hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn nhƣ: calcium hypochlorite, sodium hypochlorite, nƣớc bromine, H2O2, HgCl2. Dung dịch HgCl2 đƣợc đánh giá là có hiệu quả diệt khuẩn khá và thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 0,1%.
Nghiên cứu này đề cập đến ảnh hƣởng của nồng độ HgCl2 khác nhau trong thời gian xử lý khác nhau khi khử trùng bề mặt mẫu. Khử trùng bề mặt mẫu đƣợc thực hiện với dung dịch HgCl2 0.1% trong khoảng thời gian khác nhau từ 10 đến 25 phút. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý đến sự khử trùng bề mặt mẫu đƣợc tổng hợp trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của HgCl2 đến hiệu quả khử trùng của đoạn chồi bên của cây ngoài tự nhiên
Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Đặc điểm mẫu
10 100 Mẫu xanh, khuẩn, nấm
15 100 Mẫu xanh, khuẩn, nấm
20 100 Mẫu hơi ngả vàng, khuẩn,nấm 25 100 Mẫu hơi ngả vàng, khuẩn,nấm Với nồng độ HgCl2 0,1% và xử lý trong thời gian ngắn không thể giết chết vi sinh vật trên bề mặt mẫu, tất cả mẫu nuôi cấy bị nhiễm sau 4-6 ngày nuôi cấy. Khi tăng thời gian sử dụng nồng độ HgCl2 thì sẽ gây chết mơ cấy và mẫu đoạn chồi bên cây bƣởi Trụ Lông vẫn nhiễm.
3.2.2. Ảnh hưởng của Javel đến hiệu quả khử trùng của đoạn chồi bên của cây ngoài tự nhiên
Chồi cây bƣởi Trụ Lông đƣợc khử trùng trong dung dịch Javel 0,5% trong thời gian 10, 15, 20, 25 phút, sau đó đƣợc cấy vào môi trƣờng MS. Kết quả theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm sau 4 ngày đƣợc trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của Javel đến hiệu quả khử trùng của đoạn chồi bên của cây ngoài
tự nhiên
Thời gian (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Đặc điểm mẫu
10 100 Mẫu xanh, nấm, khuẩn
15 100 Mẫu xanh , nấm , khuẩn 20 100 Mẫu hơi ngả vàng, khuẩn,
nấm
25 100 Mẫu ngả vàng, khuẩn, chết Kết quả sau 4 ngày cho thấy các mức thời gian từ 10 đến 25 đều cho tỷ lệ nhiễm 100%. Theo một số tác giả nhƣ Dƣơng Cơng Kiên (2006) và Nguyễn Bảo Tồn (2004), thời gian xử lý mẫu cấy bằng việc sử dụng Sodium hypochloride hay Javel cơng nghiệp có chứa thành phần hoạt tính Hypochloride khoảng 5.25% thích hợp là từ 5 – 30 phút.
3.2.3. Ảnh hưởng của các công thức khử trùng kết hợp đến hiệu quả khử trùng của đoạn chồi bên của cây ngoài tự nhiên
Nano bạc đã đƣợc chứng minh có tính kháng khuẩn cao, ảnh hƣởng tới sinh sản và hô hấp của thực vật (Abdi và cs., 2008; Lok và cs., 2007). Theo nghiên cứu của Mahna và đồng tác giả (2013), nano bạc có vai trị trong khử trùng mẫu cấy ban đầu nhƣ hạt giống hay chồi cây, kết quả cho thấy nano bạc có hiệu quả khử trùng lên tới 100% và có thể thay thế thủy ngân nhƣ là một chất khử trùng mẫu. Các công thức khử trùng phối trộn và cấy trên môi trƣờng MS + 4 mg/l nano bạc đƣợc quan sát trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của các công thức khử trùng kết hợp đến hiệu quả khử trùng của
đoạn chồi bên từ cây ngoài tự nhiên
CT Thời gian
(phút)
Tỷ lệ nhiễm
(%) Đặc điểm mẫu
Javel +HgCl2 0,1% 10+10 100 Mẫu xanh, khuẩn, nấm
Nano bạc 40 100 Mẫu hơi ngả vàng, khuẩn, nấm Nano bạc+ Tween 80 40 100 Mẫu hơi ngả vàng,
khuẩn, chết, nấm Nano bạc + Javel 50% 40 100 Mẫu ngả vàng, chết,
Kết quả ở bảng 3.6 khi sử dụng công thức khử trùng HgCl2 và Javel đối với chồi cho mẫu chồi xanh nhƣng sau 4 ngày quan sát nhiễm 100%. Các công thức khử trùng với nano bạc đều cho kết quả nhiễm 100%, mẫu hơi ngả vàng. Theo kết quả nghiên cứu Đồng Huy Giới và cs (2019) Nồng độ dung dịch nano bạc thích hợp nhất cho việc khử trùng mẫu phát hoa lan Hồ điệp vàng là 125 mg/l, thời gian xử lí 40 phút, bổ sung 4 mg/l nano bạc vào môi trƣờng tạo chồi lan Hồ điệp vàng từ PLB cho hiệu quả tạo chồi tốt nhất.
Theo Esmaeilnia, E., & Dehestani, A. (2015) đối với chồi con của cây Citrus
sinensis (L.) đƣợc tiến hành khử trùng với HgCl2 trong 5 phút tráng lại bằng nƣớc cất và
khử trùng lại bằng Javel trong 8 phút kết hợp với Tween 20. Sau 2 tuần mẫu cấy đều sƣng phồng bề mặt và từ đó phát triển bất ngờ.
3.2.4. Ảnh hưởng của chất kháng sinh đến hiệu quả khử trùng của đoạn chồi bên của cây ngoài tự nhiên
Kháng sinh (Anbibiotics) hay còn gọi là trụ sinh, kháng khuẩn đƣợc mua bán sử dụng phổ biến (Ampicillin, Amoxyllin, Carbenicillin, Ticarcillin, gentamycin, hygromycin B, Kanamycin, Neomycin, Streptomycin, Paromycin…) trong nuôi cấy mô thực vật nhằm để ngăn chặn sự phát hay tiêu diệt sự phát triển của khuẩn, nấm mốc.
Trong nuôi cấy mô thực vật ngƣời ta cũng dùng kháng sinh để hạn chế sự phát triển vi sinh vật hoặc dùng với mục đích chọn lọc trên môi trƣờng chứa kháng sinh. Các loại kháng sinh đƣợc sản xuất bởi các đối tƣợng sinh vật khác nhau hoặc sản xuất nhân tạo. Nếu nuôi cấy mơ bị nhiễm bệnh thì sau khử trùng bề mặt nên ngâm trong kháng sinh với nồng độ 40-50 mg/l trong 30-60 phút hoặc với nồng độ 50-100 mg/l trong thời gian 30 phút. Tetracyclin là kháng sinh tiêu biểu của nhóm kháng sinh Tetracyclin, đƣợc chiết xuất từ việc nuôi cấy nấm Strytomyces aureofocicus hay Streptomyces virilifacieus. Tetracyclin tự nhiên gốm 3 thuốc: Tetracyclin, Chlotetracyclin và Oxytetracyclin.
Zacchini, Agazio (2004) đã báo cáo rằng sử dụng thủy ngân clorua và sodium hypochloride trong bƣớc khử trùng và kháng sinh bổ sung trong mơi trƣờng ni cấy đã giúp khắc phục tình trạng ơ nhiễm nghiêm trọng trong nuôi cấy cây ô liu Nebbiar. Kết quả sau khi sử dụng Tetracylin để ngâm mẫu và bổ sung vào môi trƣờng cho tỷ lệ nhiễm 100% đối với mẫu chồi bên của cây bƣởi Trụ Lơng tại làng Đại Bình, 25% đối với chồi cây bƣởi đƣợc gieo hạt ngồi nhà lƣới.
Hình 3.4. Kết quả mẫu cấy đoạn chồi bên cây bƣởi Trụ Lông sử dụng kháng sinh. (A),
Mẫu cấy chồi bên của cây ngoài tự nhiên (sau 4 ngày); (B), Mẫu cấy chồi bên từ cây bƣởi Trụ Lông đƣợc trồng ở nhà lƣới (cây con) (sau 3 tuần)
Từ kết quả bảng 3.4, 3.5 và 3.6 và hình 3.3 cho thấy mơi trƣờng bên ngồi ln có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy…. của cây mẹ, đây là nơi cƣ ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc đƣợc chúng. Mẫu chồi bên cây bƣởi Trụ Lông được xử lí ở các cơng thức khử trùng khác nhau cho kết quả nhiễm 100% mặc dù đã xử lí thuốc diệt nấm từ trước. Kết quả cho thấy nguồn gốc và bộ phận mẫu cấy cũng đóng vai trị quan trọng trong quá trình khử trùng (B. Saurabh và cs, 2015). Hầu hết các công thức đều nhiễm khuẩn và nấm, nhiễm khuẩn trong trƣờng hợp này thƣờng gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dƣới đáy chai ni cấy.
Hình 3.5. Mẫu cấy đoạn chồi bên của cây ngồi tự nhiên ở các cơng thức khử trùng khác
nhau. (A), Javel; (B), Nano bạc+Tween; ( C), Chất kháng sinh; (D), HgCl2 + Javel; (E), HgCl2; ( F), Nano bạc+Javel 50%; (G), Nano bạc
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Kết luận dựa trên cơ sở các kết quả nghiên cứu cho thấy:
- Khử trùng mẫu bằng ethanol 70˚ trong 1 phút, Javel 0,5% trong 5 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất với hạt cây bƣởi Trụ Lông; với tỉ lệ mẫu vơ trùng và sống sót đạt 100%, sau 4 tuần nuôi cấy.
- Hạt bƣởi Trụ Lông ở các độ tuổi 4, 6, 8, 10 tuần khử trùng bằng cồn 70˚ trong 60 giây và dung dịch Javel trong 5 phút. Tỷ lệ nảy mầm của hạt bƣởi Trụ Lông đạt cao nhất ở độ tuổi 6, 8 tuần. Tỷ lệ nảy mầm cao, cây nảy mầm nhanh.
- Mơi trƣờng MS có 3% saccharose, 0,8% agar bổ sung 1.5 mg/l BAP là mơi trƣờng thích hợp để nhân chồi in vitro cây bƣởi Trụ Lông; chiều cao chồi 1,45 cm sau 8 tuần
nuôi cấy.
- Phƣơng pháp khử trùng mẫu chồi của cây trƣởng thành với Javel 0,5%; HgCl2 0,1%; Nano bạc 125 mg/l; Tetracyclin cho tỷ lệ nhiễm 100% với các nồng độ khác nhau
2. Kiến nghị
Cây bƣởi Trụ Lông là một loại cây ăn quả và là đối tƣợng mới đƣợc đƣa vào nghiên cứu in vitro. Trên đây là những kết quả bƣớc đầu, do hạn chế về thời gian nghiên cứu nên tôi đề nghị vấn đề sau:
- Tiếp tục xác định môi trƣờng tối ƣu nhất cho sự nhân chồi in vitro cây bƣởi Trụ
Lông.
- Khảo sát ảnh hƣởng của số lần cấy chuyển đến khả năng sinh trƣởng chồi in vitro - Tiến hành nghiên cứu các biện pháp khử trùng đối với chồi bên cây bƣởi Trụ Lông ngồi tự nhiên để cơng thức khử trùng phù hợp.
- Tiến hành khảo sát một số điều kiện môi trƣờng nuôi cấy để tạo rễ in vitro, tối ƣu hóa mơi trƣờng ni cấy.
- Tiến hành khảo sát một số điều kiện để đƣa cây bƣởi Trụ Lơng in vitro trồng ngồi tự nhiên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Abdi G, Salehi H, Khosh-khuri M (2008) Nano silver: Anovel nanomaterial for removal of bacterial contamination in Valerian (V. officinalis) tissue culture. Acta Physiol Planta J 30: 709-714
B. Saurabh, Plant tissue culture, Modern Applications of Plant Biotechnology in Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Bahadurgarh, Haryana, India, 31– 107, 2015.
Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn quả nhiệt đới, tập (1), Nxb Nông thôn.
Cervera, M., Juarez, J., Navarro, A., Pina, J.A., Duran-Vila, N., Navarro, L., Pena, L. (1998): Genetic transformation and regeneration of mature tissue of woody fruit plants bypassing the juvenile stage. Transgenic Research 7: 51- 59.
Chen Q., Xu C. J. (2005), "Effect of artificial pollination on fruit development and quality in storage of Yongjiazaoxiangyou pomelo, China", Journal of Fruit Science. Chilembwe, E.H.C., W.S. Castle, and D.J. Cantliffe. 1992. Grading, hydrating, and osmotically priming seed of four Citrus rootstocks to increase germination rate and seedling uniformity. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 117:368–372.
Cục Nông nghiệp thành phố Phúc Châu, Phúc Kiến (2009), Tình hình sản xuất và kỹ thuật trồng bƣởi tại tỉnh Phúc Kiến, Tài liệu hƣớng dẫn kỹ thuật.
Đào Thanh Vân, Ngơ Xn Bình (2003), Giáo trình cây ăn quả (dành cho cao học), NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Chi Mai, Đặng Hịa Hiếu, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi trực tiếp từ thân mầm cây cam sành (Citrus nobilis loureiro) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 363- 370.
Đồng Huy Giới, Bùi Thị Thu Hƣơng. (2019). Nghiên cứu sử dụng Nano bạc trong nhân giống In vitro Lan hồ điệp vàng (Phalaenopsis sp.).
Dƣơng Công Kiên. 2006. Nuôi cấy mô, tập 2. Nhà xuất bản ðại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. p: 41 – 43.
Đƣờng Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bƣởi và kỹ thuật trồng, NXB Lao động - xã hội.
Duran Villa N, Ortega V, Navarro L (1989) Hình thái học và ni cấy mơ của ba lồi
Citrus. Nuôi cấy mô cơ quan tế bào thực vật 16: 123-133
Ehsan E. and D. Ali (2015). In vitro plant regeneration from mature tissues of Thomson navel sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), Rumani.
Esmaeilnia, E., & Dehestani, A. (2015). In vitro plant regeneration from mature tissues of Thomson navel sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck.). Biharean Biologist, 9(1), 9-14.
Freeman T., Robbertse P. J. (2003), "Internal quality of Valencia ‟orange fruit as
influenced by tree fruit position and winter girdling".
Hà Minh Trung, Ngô Vĩnh Viễn, Lê Mai Nhất, Mai Thị Liên và Nguyễn Thị Bích Ngọc (2008). Hồn thiện và ứng dụng cơng nghệ sản xuất cây có múi đ c sản (cam, quýt, bưởi) sạch bệnh greening và các bệnh virus khác ở các tỉnh phía Bắc. Tuyển tập cơng trình nghiên cứu và chuyển giao khoa học công nghệ. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
Hà Thanh Võ (2005). Nghiên cứu kĩ thuật vi ghép Bưởi. Khóa luận tốt nghiệp. Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Hà Thị Thúy, Đỗ Năng Vịnh (2004), Nghiên cứu tạo mơ sẹo phơi hóa và phơi vơ tính từ ni cấy nỗn ở một số giống cây ăn quả có múi, Tạp chí Di truyền và Ứng dụng, trang 13-19.
Hoàng Minh (2005), Sổ tay kỹ thuật trồng và chăm sóc một số chủng loại cây ăn quả, Nxb Lao động – Xã hội, Hà Nội.
Hoàng Thị Sản, Phân loại thực vật, NXB Giáo dục.
Huetteman C, A, and J, E, Preece - Thidiazuron: a potent cytokinin for wood plant tissue culture, Plant Cell Tiss, Org, Cult, 33(1993) 05–119.
Kobayashi, A.K., Bespalhok, J.C., Pereira, L.F.P., Vieira, L.G.E. (2003): Plant regeneration of sweet orange (Citrus sinensis) from thin sections of mature stem segments. Plant Cell Tissue and Organ Culture 74: 99-102.
Komal G., Shanma R., P. K. singh and Govind singh (2013), In vitro propagation
produces seedless lime (Citrus limon L. cv. Kaghzi Kalan) and genetic evaluation of the plant, Plant physiology pp. 131-145.
Lok CN, Ho CM, Chen R, He QY, Yu WY, Sun H, Tam PKH, Chiu JF, Che CM (2007) Silver nanoparticles: Partial oxidation and activities. Biol Inor Chem 12: 527- 534.
Mahna N, Vahed SZ, Khani S (2013) Plant in vitro culture goes nano: Nanosilver-
Mediated decontamination of ex vitro Explants. J Nanomed Nanotechol 4: 2.
Marutani-Hert, M., Bowman, K.D., McCollum, G.T., Mirkov, T.E., Evens, T.J., Niedz, R.P. (2012): A dark incubation period is important for Agrobacterium-mediated transformation of mature internode explants of sweet orange, grapefruit, citron, and a citrange rootstock. PLoS ONE 7: e47426.
Ngơ Hồng Bình (2006), Kỹ thuật trồng một số cây ăn quả vùng duyên hải miền Trung, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
Ngo Xuan Binh (2001), Study of self-incompatibility in Citrus with special emphases on the pollen tube growth and allelic variation, Ph.D thesis. Kyushu University – Japan.
Nguyễn Bảo Tồn. 2004. Giáo trình ni cấy mơ và tế bào thực vật, Khoa Nông Nghiệp và SHƢD, Trƣờng ðại Học Cần Thơ. p: 16 – 18, 25 – 33, 43 – 51.
Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Sổ tay trồng cây ăn quả, NXB Nông nghiệp.
Nguyễn Quỳnh Hoa (2010), “Nghiên cứu đặc tính nơng sinh học của các cây bƣởi Diễn chọn lọc và ảnh hƣởng của một số biện pháp kỹ thuật đến năng suất và phẩm chất của cây bƣởi Diễn trồng tại xã Minh Khai - Từ Liêm - Hà Nội”, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Nguyễn Văn Kế (2001), Cây ăn quả nhiệt đới, Nxb Nông nghiệp, Tp. HCM.
Nguyễn, Văn Kết, Thị Cúc Nguyễn, and Trung Thành Nguyễn. "Khảo sát khả năng nhân giống cây Trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy) in vitro." (2014). Orbović, V., Dutt, M., & Grosser, JW (2013). Evaluation of the Germination Potential of
Citrus Seeds during the Harvesting Season. HortScience , 48 (9), 1197-1199.
Paudyal KP, Haq N (2000) Trong ống nghiệm nhân giống Pummelo (Citrus grandis L. Qsbeck). Trong ống nghiệm Nhà máy Cell Dev Biol 36: 511-516.
Phan Hữu Tơn, Tống Văn Hải, Đồn Văn Lƣ, Phạm Thị Dung, Nguyễn Xuân Viết “Nuôi cấy in vitro trên trụ lá mầm giống cam (Citrus sinensis), quýt (Citrus reticulata)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2014, tập 12, số 5: 641-649.
Quyết định số: 1127/QĐ-UBND Thành phố Hà Nội về việc phê duyệt “Đề án phát triển một số loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao Thành phố Hà Nội giai đoạn 2012 – 2016”.
Rezadost M., Hosein S. (2013), In vitro regeneration of sour orange (Citrus aurantium
L.) via direct organogenesis, 55 (3) pp.137-164.
Rosely P., Weliton A. B., Elma d. S., (2008), In vitro organogenesis from adult tissue of „Bahia‟ sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), Brasil, pp. 367-371.
Shahid A. K. et al (2011), Regeneration in vitro from non-pollinated flowers of sweet citrus (Citrus sinensis L. Osbeck), African Journal of Biotechnologyp. 15.130-
15.134.
Silva RP, Almeida WAB, Souza ES, Filho FAAM (2006) Trong ống nghiệm sinh cơ