CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Khử trùng mẫu hạt
Hạt bƣởi Trụ Lông đƣợc rửa sạch với nƣớc trong 30 phút, sau đó ngâm trong xà phịng pha lỗng 20 phút và rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Mẫu hạt được đưa vào trong tủ cấy vô trùng, khử trùng mẫu hạt bằng cồn 70° trong 60 giây và dung dịch Javel 0,5% trong các khoảng thời gian khác : 5; 10; 15; 20 phút. Hạt sau khi khử trùng
tiến hành bóc vỏ và thấm khô trên giấy thấm, tiến hành cấy 3 hạt/ chai. Theo dõi các chỉ tiêu nhƣ: tỷ lệ nhiễm (%), tỷ lệ chết (%), tỷ lệ nảy mầm (%) và đặc điểm chồi in vitro.
2.3.2. Ảnh hưởng của độ tuổi hạt đến khả năng nảy mầm
Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của độ tuổi hạt đến khả năng nảy mầm của hạt:
- Hạt có độ tuổi 4 tuần - Hạt có độ tuổi 6 tuần - Hạt có độ tuổi 8 tuần - Hạt có độ tuổi 10 tuần
Tuổi của hạt trong thí nghiệm này đƣợc tính từ khi hoa thụ phấn đến khi thu hái mẫu. Thí nghiệm đƣợc tiến hành tƣơng tự khử trùng mẫu hạt.
2.3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi của đoạn chồi bên của cây con từ hạt
Hạt sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS để hạt nảy mầm, tạo cây
in vitro. Cây in vitro nảy mầm từ hạt sau 3 tháng nuôi cấy được sử dùng làm nguyên liệu
nuôi cấy. Cây con cắt thành các đoạn 10 mm-15 mm mang 1 mắt lá.
Để thăm dò ảnh hƣởng riêng rẽ của chất điều hòa sinh trƣởng đến sự phát sinh đa chồi cây bƣởi Trụ Lông, tất cả các công thức môi trƣờng nuôi cấy đều sử dụng môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung đƣờng 30 g/l + agar 8,0 g/l + 1 g/l than hoạt tính và chất điều hịa sinh trƣởng bổ sung BAP với nồng độ 0,5 mg/l; 1 mg/l; 1,5 mg/l; 2 mg/l; 2,5 mg/l . Đối chứng sử dụng môi trƣờng MS cơ bản + đƣờng 30 g/l + agar 8,0 g/l + 1 g/l than hoạt tính khơng bổ sung các chất điều hịa sinh trƣởng.
Mơi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở pH = 5,8 trước khi khử trùng ở 121°C trong nồi áp suất 1atm. Các thí nghiệm ni cấy in vitro được duy trì ở nhiệt độ 25 ± 2°C, điều kiện chiếu sáng 2000 Lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày.
Tiến hành theo dõi và thu nhận số liệu sau 8 tuần nuôi cấy, qua các chỉ tiêu theo dõi sau: Số chồi/mẫu; Chiều cao chồi (cm); Chất lƣợng chồi.
2.3.4. Khử trùng mẫu chồi của cây bưởi Trụ Lông
Chồi cây bƣởi đƣợc thu tại làng Đại Bình, xã Quế Trung, huyện Nông Sơn, tỉnh Quảng Nam có chiều dài 20-25 cm với 5-7 mắt lá và mang đến phịng thí nghiệm xử lý thêm.
Các lá và cuống đƣợc loại bỏ sau đó đƣợc xả dƣới vịi nƣớc 1h, ngâm xà phịng pha lỗng 30 phút, xả lại dƣới vòi nƣớc. Tiếp theo các chồi đƣợc cắt thành các đoạn 1-2 cm
gồm 1 mắt lá ngâm trong dung dịch Amistar -Top 2h (Amistar Top là thuốc trừ bệnh nội hấp và lƣu dẫn mạnh, diệt tế bào nấm bệnh). Sau đó đƣợc rửa kỹ bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Mẫu chồi đƣợc đƣa vào trong tủ cấy vô trùng khử trùng bề mặt bằng ethanol 70˚ trong 1 phút, rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Lần lƣợt tiến hành khử trùng với các công thức sau:
Bảng 2.1: Công thức khử trùng chồi cây bƣởi Trụ Lông
Dung dịch Thời gian( phút) Lƣu ý
Javel 10 15 20 25 HgCl2 0,1% 10 15 20 25 Javel + HgCl2 10 + 10 Nano bạc 40
Khử trùng bên ngồi với 125 mg/l Nano bạc trong 1h. Mơi trƣờng MS
bổ sung 4 mg/l Nano bạc Nano bạc+ Tween 40
Nano bạc + Javel
50% 40
HgCl2 0,1% 15
Khử trùng bên ngoài với Tetracyclin 1h, môi trƣờng bổ sung 50 mg/ml
Tetracyclin Mẫu cấy:
- Chồi bên từ cây trƣởng thành
- Chồi đƣợc thu từ cây trồng ngoài nhà lƣới
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần.Số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel.
Các chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ nảy mầm của hạt (%) = (Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt đem gieo) x 100. Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Số mẫu bị nhiễm/ Tổng số mẫu đem cấy) x 100 Số chồi/mẫu = (Tổng số chồi) / (Tổng số mẫu bật chồi)