(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch của chủng vi rút o FMD AVAC3 để sản xuất vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THUÝ QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA CHỦNG VI RÚT O/FMD/AVAC3 ĐỂ SẢN XUẤT VẮC XIN VƠ HOẠT PHỊNG BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG Ngành: Mã số: Thú Y 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Giáp NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2020 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Đây phần kết nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu, chế tạo vắc xin vô hoạt nhũ dầu, keo phèn phịng bệnh lở mồm long móng đa týp O A cho gia súc” mã số SPQG.05b.01 thuộc dự án Khoa Học Công Nghệ: “Công nghệ sản xuất vắc xin phịng bệnh lở mồm long móng cho gia súc” Các số liệu công bố luận văn đồng ý tổ chức chủ trì nhiệm vụ cơng ty Cổ phần Phát triển Công nghệ Nông thôn, kết thu trung thực, khách quan thành phối hợp với đồng nghiệp suốt thời gian qua Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày …… tháng … năm 2020 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thuý Quỳnh i TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Giáp hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám Đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán công nhân viên công ty Trách nhiệm hữu hạn Một thành viên Avac Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày …… tháng … năm 2020 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thuý Quỳnh ii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình, biểu đồ viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết để tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lịch sử bệnh lở mồm long móng 2.1.1 Tình hình bệnh lở mồm long móng giới 2.1.2 Tình hình bệnh lở mồm long móng Việt Nam 2.2 Vi rút LMLM 2.2.1 Hình thái, cấu trúc vi rút LMLM 2.2.2 Sức đề kháng vi rút 10 2.2.3 Độc lực loài vật cảm thụ 10 2.3 Một số đặc tính vi rút LMLM 11 2.3.1 Tính đa dạng kháng nguyên 11 2.3.2 Đặc tính biến dị tiến hóa 11 2.3.2 Nuôi cấy vi rút LMLM gây nhiễm vi rút động vật 14 2.3.3 Đặc tính sinh miễn dịch 14 2.4 Hiểu biết chung vắc xin 16 2.4.1 Khái quát vắc xin 16 2.4.2 Thành phần vắc xin 17 2.4.3 Độ ổn định kháng nguyên LMLM 18 iii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 2.4.4 Các phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch động vật tiêm vắc xin LMLM 19 2.5 Tình hình phát triển vắc xin lmlm giới 21 2.5.1 Vắc xin LMLM vô hoạt 21 2.5.2 Một số thử nghiệm vắc xin 22 2.5.3 Các vắc xin LMLM hành 23 Phần Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 24 3.1 Thời gian nghiên cứu 24 3.2 Địa điểm nghiên cứu 24 3.3 Nguyên vật liệu, đối tượng sử dụng nghiên cứu 24 3.3.1 Chủng giống vi sinh, động vật thử nghiệm 24 3.3.2 Hóa chất 25 3.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ 25 3.4 Nội dung nghiên cứu 25 3.4.1 Giám định đặc tính di truyền vi rút vắc xin 25 3.4.2 Khả sản sinh đáp ứng miễn dịch vắc xin LMLM chủng O3 25 3.4.3 Ảnh hưởng chất bổ trợ tới đáp ứng miễn dịch 26 3.4.4 Khả bảo hộ chéo chủng vi rút thực địa 26 3.4.5 Độ dài miễn dịch tạo vắc xin LMLM chủng O3 26 3.5 Phương pháp nghiên cứu 26 3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào gây nhiễm vi rút 26 3.5.2 Phương pháp chuẩn độ vi rút trung hòa vi rút tế bào 26 3.5.3 Phương pháp cô đặc, vô hoạt, phối trộn với chất bổ trợ kiểm tra vắc xin phối trộn 28 3.5.4 Phương pháp lựa chọn động vật thí nghiệm 30 3.5.5 Phương pháp xác định liều gây nhiễm số lần tiêm vắc xin cho lợn 31 3.5.6 Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể lợn tiêm vắc xin keo phèn 32 3.5.7 Phương pháp định lượng kháng thể phương pháp LPB – ELISA (Liquid phase blocking ELISA) 33 3.5.8 Phương pháp giải trình tự gen VP1 36 3.5.9 Xử lý số liệu 36 iv TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Phần Kết thảo luận 37 4.1 Đặc tính di truyền chủng giống 37 4.2 Khả sản sinh đáp ứng miễn dịch 39 4.2.1 Đáp ứng miễn dịch lợn tiêm mũi vắc xin 39 4.2.2 Đáp ứng miễn dịch lợn sau tiêm hai mũi vắc xin 42 4.3 Ảnh hưởng chất bổ trợ tới đáp ứng miễn dịch 46 4.4 Khả bảo hộ chéo chủng vi rút thực địa 49 4.5 Độ dài miễn dịch tạo vắc xin lmlm chủng O3 53 Phần Kết luận đề nghị 58 5.1 Kết luận 58 5.2 Kiến nghị 58 Phần Tài liệu tham khảo 59 Phụ lục 64 v TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Mô tả đầy đủ BEI Binary ethylenimine BHK Baby hamster kidney CPE Cytopathic effect DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal bovine serum FMDV Foot and Mouth disease virus FTM Fruid thioglycolate LMLM Lở mồm long móng LPB – ELISA Liquid phase blocking ELISA MOI Multiplicity of Infection OIE Office International des Epizooties OPD o-Phenylenediamine PBS Phosphate Buffered Saline RNA Ribonucleic acid RTD Công ty Cổ phần Phát triển Công nghệ Nông thôn SD Sabouraud dextrose agar TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TMB Tetramethyl benzidine TSA Trypticase soy agar TSB Trypticase Soybean TV Trypsin versene VNT Virus Neutralization test XLD Xylose Lysine Deoxycholate vi TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tình hình bệnh LMLM giai đoạn 2001 - 2005 Bảng 2.2 Tình hình dịch LMLM từ năm 2015 – 2017 Bảng 2.3 Chỉ số tin cậy đánh giá hiệu vắc xin 21 Bảng 3.1 Nguồn gốc vi rút chọn để đánh giá chọn giống 24 Bảng 4.1 Đáp ứng miễn dịch lợn sau tiêm mũi vắc xin 40 Bảng 4.2 Đáp ứng miễn dịch lợn sau tiêm mũi vắc xin 43 Bảng 4.3 Đáp ứng miễn dịch lợn tiêm vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn 46 Bảng 4.4 Giá trị r1 chủng vắc xin với chủng vi rút thuộc topotype ME-SA 50 Bảng 4.5 Giá trị r1 chủng vắc xin với topotype O lưu hành Việt Nam 52 Bảng 4.6 Độ dài miễn dịch lợn sau tiêm vắc xin LMLM phương pháp trung hoà vi rút 54 Bảng 4.7 Độ dài miễn dịch lợn sau tiêm vắc xin LMLM phương pháp LPB- ELSIA 55 vii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1 Bản đồ phân bố dịch LMLM nước thành viên OIE Hình 2.2 Tổ chức gen cấu trúc vi rút LMLM Hình 2.3 Cây phả hệ gen VP1 chủng LMLM týp O lưu hành Việt Nam 12 Hình 4.1 So sánh khoảng cách di truyền chủng O3 37 Hình 4.2 Mối liên hệ di truyền dựa vào gen VP1 vi rút LMLM týp O 38 Hình 4.3 Kết phát kháng thể trung hoà vi rút LMLM 39 Hình 4.4 Biến động hiệu giá kháng thể lợn sau tiêm mũi vắc xin 41 Hình 4.5 Biến động hiệu giá kháng thể lợn sau tiêm mũi vắc xin 43 Hình 4.6 So sánh hiệu giá kháng thể lợn thời điểm D28 D56 44 Hình 4.7 Biến động hiệu giá kháng thể lợn tiêm vắc xin vô hoạt keo phèn 47 Hình 4.8 So sánh đáp ứng miễn dịch lợn tiêm vắc xin nhũ dầu keo phèn phản ứng trung hòa 47 Hình 4.9 Kết LPB-ELISA phát kháng thể trung hòa lợn 48 Hình 4.10 So sánh đáp ứng miễn dịch lợn tiêm vắc xin nhũ dầu keo phèn phản ứng LPB-ELISA 49 Hình 4.11 Chỉ số tương đồng kháng nguyên chủng vi rút vắc xin với chủng vi rút topotype ME-SA 51 Hình 4.12 So sánh độ dài miễn dịch lợn sau tiêm vắc xin phương pháp trung hòa vi rút LPB-ELISA 56 viii TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Thuý Quỳnh Tên luận văn: Nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch chủng vi rút O/FMD/Avac3 để sản xuất vắc xin vơ hoạt phịng bệnh lở mồm long móng Ngành: Thú y Mã số: 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Giám định đặc tính di truyền chủng O/FMD/Avac3, đánh giá đáp ứng miễn dịch lợn tiêm vắc xin LMLM chủng O3 ảnh hưởng chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch Ngồi cịn đánh giá mức tương đồng kháng nguyên chủng vi rút O3 với chủng vi rút thuộc topotype ME-SA topotype O lưu hành Việt Nam Phương pháp nghiên cứu: - Phương pháp nuôi cấy tế bào gây nhiễm vi rút - Phương pháp chuẩn độ vi rút trung hòa vi rút tế bào - Phương pháp cô đặc, vô hoạt, phối trộn với chất bổ trợ kiểm tra vắc xin phối trộn - Phương pháp lựa chọn động vật thí nghiệm - Phương pháp xác định liều gây nhiễm số lần tiêm vắc xin LMLM cho lợn - Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể lợn tiêm vắc xin LMLM vô hoạt với chất bổ trợ keo phèn - Phương pháp định lượng kháng thể phương pháp LPB – ELISA (Liquid phase blocking ELISA) - Phương pháp giải trình tự gen VP1 - Xử lý số liệu Kết kết luận: - Về đặc tính di truyền: chủng vi rút O3 thuộc topotype ME-SA khác biệt trình tự gen mức 0,036 đến 0,179 so với chủng vi rút týp O lưu hành Việt Nam - Hàm lượng vi rút liều vắc xin khoảng - - 7,5 log10 TCID 50 /ml ảnh hưởng tới đáp ứng miễn dịch Đáp ứng miễn dịch kích thích sản sinh vắc xin LMLM sản xuất từ chủng vi rút O3 phụ thuộc chủ yếu vào quy trình miễn ix TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Dễ nhận thấy toàn giá trị r1 thu > 0,3 (giới hạn đường nét đứt màu đỏ, hình 4.11) Kết phản ánh mức tương đồng kháng nguyên chủng vi rút vắc xin O3 với chủng vi rút thuộc topotype Ở Việt Nam, nghiên cứu công bố năm 2016, số r1 dùng để đánh giá tương đồng kháng nguyên chủng vi rút LMLM týp O thu thập miền Bắc- Trung- Nam (Ngô Thanh Long & cs., 2016) Ở nghiên cứu đó, 29/ 29 chủng vi rút đại diện từ thực địa cho giá trị r1 > 0,3, với 79,31% vi rút thực địa có r1 ≥ 0,5 Như vậy, cần mở rộng phạm vi đánh giá mức tương đồng kháng nguyên chủng vi rút vắc xin O3 với chủng vi rút LMLM thực địa khác thuộc týp O Bên cạnh việc sử dụng chủng vi rút phân lập thuộc topotype MESA, thí nghiệm tiếp tục thực với chủng vi rút O thuộc phân nhánh MESA/Ind2001, O/SEA - Mya98 Cathay Kết trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Giá trị r1 chủng vắc xin với topotype O lưu hành Việt Nam Chủng Topotype VNT* Giá trị Khả vi rút / lineage (log 10) r1 bảo hộ** O/FMD/Avac3 ME-SA/PanAsia 2,49 ± 0,25 1,00 O/pig/Daklak/15 ME-SA/ Ind2001 1,77 ± 0,41 0,71 O/VIT/9/2008 Cathay 1,17 ± 0,15 0,47 O/VIT/5/2010 SEA/ Mya98 2,37 ± 0,15 0,95 TT Có khả bảo hộ cao Có khả bảo hộ cao Khó dự đốn Có khả bảo hộ cao * Hiệu giá kháng thể trung hòa (VNT) ** Khả bảo hộ đánh giá dựa vào kết hợp tham số hiệu giá kháng thể trung hòa mức tương đồng kháng nguyên r1 Theo vắc xin đánh giá là: (i) “có khả bảo hộ cao” giá trị r1 ≥ 0,3 & VNT ≥ 1,42; (ii) “khó dự đốn” Giá trị r1 ≥ 0,3 & VNT < 1,42 Kết bảng 4.5 cho thấy, giá trị r1 chủng vi rút thuộc nhóm khác Trong đó, giá trị r1 cao 0,95 vi rút thuộc topotype O/SEA –Mya98, sau đến vi rút thuộc topotype O/ME-SA/Ind2001 52 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com với r1 = 0,71; thấp r1= 0,47 vi rút thuộc topotype O/Cathay so với vi rút vắc xin Mặc dù vậy, kết r1 > 0,3 Theo khuyến cáo OIE, điều cho thấy vi rút vắc xin O3 (O/FMD/Avac3) có mức tương đồng cao vi rút thực địa thuộc topotype diện Việt Nam Sau tiêm vắc xin, hiệu giá kháng thể cao chứng minh vi rút có đặc tính sinh miễn dịch cao ngược lại Hiệu giá kháng thể cao, động vật không bảo hộ chủng vi rút thực địa khơng có tính tương đồng với chủng vi rút gây bệnh ngồi thực địa Mục đích cuối vắc xin bảo vệ động vật cảm thụ chống lại vi rút thực địa Cho nên việc xác định mức tương đồng kháng nguyên vi rút sản xuất vắc xin vi rút thực địa điều cần thiết Kháng thể đặc hiệu vi rút chủng O3 tạo lợn có khả trung hoà chéo với chủng chọn đại diện từ ổ dịch năm khác Điều cho thấy, vi rút O3 tương đồng kháng nguyên có khả kích thích sản sinh miễn dịch bảo hộ vi rút týp O lưu hành Việt Nam Ở công bố đây, tác giả Trần Xuân Hạnh cho biết đánh giá hiệu phòng bệnh vắc xin LMLM dựa vào giá trị tương đồng kháng nguyên chưa thật xác (Trần Xuân Hạnh, 2020) Nên kết hợp giá trị r1 hiệu giá kháng thể trung hòa để đánh giá khả bảo hộ vắc xin LMLM Dựa vào đó, kết luận khả bảo hộ tốt vắc xin LMLM chủng O3 không chủng thực địa topotype (bảng 4.4) mà cịn có khả bảo hộ chéo với topotype khác SEA/ Mya98 Đối với topotype Cathay (chủng vi rút thích nghi gây bệnh lợn) khả bảo hộ vắc xin LMLM vô hoạt chủng O3 cần tiếp tục nghiên cứu 4.5 ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH TẠO RA BỞI VẮC XIN LMLM CHỦNG O3 Từ kết nội dung trước, xác định nồng độ vi rút LMLM trước vô hoạt tối thiểu đạt log TCID 50 /ml Từ đó, xác định thời gian tiêm nhắc lại mũi vắc xin Để có đánh giá tồn diện đáp ứng miễn dịch lợn tiêm vắc xin LMLM nhũ dầu nồng độ chọn, nghiên cứu theo dõi độ dài miễn dịch thời gian khoảng tháng sau tiêm mũi (196 ngày sau tiêm mũi 1) Kết hiệu giá kháng thể trung hoà lợn thể bảng 4.6 53 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng 4.6 Độ dài miễn dịch lợn sau tiêm vắc xin LMLM phương pháp trung hoà vi rút Ngày Hiệu giá kháng thể trung hoà (log10 VNT50) sau tiêm Thí nghiệm Đối chứng 56 2,49 ± 0,25 < 0,90 70 2,49 ± 0,25 < 0,90 84 2,46 ± 0,13 < 0,90 98 2,43 ± 0,27 < 0,90 112 2,37 ± 0,22 < 0,90 126 2,34 ± 0,27 < 0,90 140 2,32 ± 0,08 < 0,90 154 2,22 ± 0,25 < 0,90 168 2,16 ± 0,25 < 0,90 182 2,07 ± 0,25 < 0,90 196 2,01 ± 0,23 < 0,90 Hiệu giá kháng thể trung hoà lợn đạt cực đại 2,49 log10 thời điểm 56 ngày sau tiêm, kháng thể tiếp tục trì đến thời điểm 70 ngày sau tiêm Từ ngày 70 sau tiêm trở đi, kháng thể bắt đầu có xu hướng giảm dần tuần tiếp theo, hiệu giá đạt 2,46 log10 Các tuần tiếp theo, hiệu giá kháng thể trì ngưỡng bảo hộ (> 2, theo TCVN) Đến 196 ngày sau tiêm (khoảng gần tháng sau tiêm mũi 2), hiệu giá kháng thể đạt xấp xỉ ngưỡng bảo hộ 2,01 log10 Lợn nhóm đối chứng khơng chuyển dương tính suốt thời gian theo dõi Kết theo dõi độ dài miễn dịch phương pháp LPB-ELISA thể bảng 4.7 54 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng 4.7 Độ dài miễn dịch lợn sau tiêm vắc xin LMLM phương pháp LPB- ELSIA Ngày Hiệu giá kháng thể ELISA (log10) sau tiêm Thí nghiệm Đối chứng 56 2,52 ± 0,16 < 0,90 70 2,61 ± 0,13 < 0,90 84 2,61 ± 0,13 < 0,90 98 2,58 ± 0,12 < 0,90 112 2,52 ± 0,16 < 0,90 126 2,49 ± 0,20 < 0,90 140 2,44 ± 0,13 < 0,90 154 2,35 ± 0,20 < 0,90 168 2,28 ± 0,12 < 0,90 182 2,20 ± 0,08 < 0,90 196 2,10 ± 0,11 < 0,90 Kết bảng 4.7 cho thấy, hiệu giá kháng thể lợn xác định phương pháp ELISA tăng ổn định tỉ lệ thuận với kết hiệu giá kháng thể trung hoà VNT Kháng thể thời điểm 56 ngày sau tiêm mũi 1, hiệu giá đạt 2,52 log10 Kháng thể tiếp tục tăng hai lần lấy máu 70 84 ngày sau tiêm, kháng thể đạt cực đại 2,61 log10 Sau đó, kháng thể có xu hướng giảm dần trì ngưỡng bảo hộ (>2) Đến thời điểm 196 ngày sau tiêm (khoảng tháng sau tiêm mũi 2), hiệu giá kháng thể 2,10 log10 Nhóm đối chứng khơng xác định hiệu giá kháng thể thời gian theo dõi Biểu đồ kháng thể trung hoà kháng thể ELISA lợn thời gian theo dõi trình bày hình 4.12 55 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hình 4.12 So sánh độ dài miễn dịch lợn sau tiêm vắc xin phương pháp trung hòa vi rút LPB-ELISA Bên cạnh biện pháp an toàn sinh học, tiêm vắc xin đóng vai trị quan trọng kiểm sốt bùng phát bệnh LMLM cách giảm triệu chứng lâm sàng mức độ lây truyền vi rút quần thể động vật nhạy cảm Theo OIE, vắc xin LMLM vô hoạt thông thường sử dụng để phịng bệnh có độ dài miễn dịch khoảng tháng, vật nuôi tiêm vắc xin thường tiêm lại 1-3 lần năm, tùy thuộc vào loài, tuổi thọ giá trị kinh tế nó; loại, chất lượng vắc xin tình hình dịch tễ học Có vài báo cáo độ dài miễn dịch động vật nhai lại kéo dài năm nhiều Trong nghiên cứu, gia súc tiêm chủng ba lần với vắc xin nhũ dầu khoảng thời gian tháng, có khả bảo hộ, khơng có triệu chứng lâm sàng thử thách công cường độc sau 13 tháng kể từ ngày liều cuối Khơng có báo cáo độ dài miễn dịch lợn; nhiên, với hai liều vắc xin dự phòng, cách tháng, ước tính có khả bảo hộ khoảng tháng dựa phản ứng huyết học (Doel, 2003) Mặc dù phương pháp công cường độc coi phương pháp tiêu chuẩn việc đánh giá khả bảo hộ động vật, nhiên, điều kiện sở vật chất hạn chế liên quan đến yếu tố kinh tế, dịch tễ nên nghiên cứu này, sử dụng phương pháp huyết học Theo Lê Trần Tiến (2017) cho rằng, lợn tiêm vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu đơn giá nhị giá týp O 56 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com có độ dài miễn dịch kéo dài khoảng tháng hiệu giá kháng thể đánh giá hai phương pháp trung hòa vi rút phương pháp LPB- ELISA, kết tương đồng với nghiên cứu Vậy với kết thu cho thấy, lợn sau tiêm vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu sản xuất từ chủng O3 có độ dài miễn dịch khoảng tháng Đối với nhóm lợn giống (hậu bị, nái đực giống) thời gian nuôi dài nên đến thời điểm cần tiêm nhắc lại để trì đáp ứng miễn dịch ngưỡng bảo hộ 57 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Về đặc tính di truyền: chủng vi rút O3 thuộc topotype ME-SA khác biệt trình tự gen mức 0,036 đến 0,179 so với chủng vi rút týp O lưu hành Việt Nam 2) Về đặc tính sinh miễn dịch: - Hàm lượng vi rút liều vắc xin khoảng - - 7,5 log10 TCID 50 /ml ảnh hưởng tới đáp ứng miễn dịch - Đáp ứng miễn dịch kích thích sản sinh vắc xin LMLM sản xuất từ chủng vi rút O3 phụ thuộc chủ yếu vào quy trình miễn dịch Chỉ gây miễn dịch lần tạo đáp ứng miễn dịch ngưỡng bảo hộ 3) Về ảnh hưởng chất bổ trợ tới đáp ứng miễn dịch: - Chất bổ trợ ảnh hưởng đến hình thành đáp ứng miễn dịch đạt ngưỡng bảo hộ vắc xin LMLM chế từ chủng vi rút O3 - Nhũ dầu chất bổ trợ phù hợp cho sản xuất vắc xin LMLM vô hoạt 4) Về khả bảo hộ chéo: - Chủng vi rút O3 có mức tương đồng cao vi rút týp O thuộc topotype diện Việt Nam, với số r1 dao động từ 0,53 - 0,95 - Vắc xin LMLM chủng O3 có khả bảo hộ tốt không chủng thực địa topotype ME-SA mà cịn có khả bảo hộ chéo với topotype khác SEA/ Mya98 5) Về độ dài miễn dịch: - Với quy trình gây miễn dịch nhắc lại, chủng vi rút O3 tạo đáp ứng miễn dịch ngưỡng bảo hộ (≥ 2,0 log10) trì đến ngày 196 sau tiêm vắc xin mũi 5.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục mở rộng phạm vi đánh giá mức tương đồng kháng nguyên chủng vi rút vắc xin O3 với chủng vi rút LMLM thực địa khác thuộc týp O - Đối với topotype Cathay khả bảo hộ vắc xin LMLM vô hoạt chủng O3 cần tiếp tục nghiên cứu nồng độ vi rút đưa vào số lần gây miễn dịch 58 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Beard C W & Mason, P W (2000) Genetic determinants of altered virulence of Taiwanese foot-and-mouth disease virus, Journal of virology, 74(2): 987-991 Becker Y (1994) Need for cellular and humoral immune responses in bovines to ensure protection from foot-and-mouth disease virus (FMDV)—a point of view, Virus genes, 8(2): 199-214 Blacksell S D., Siengsanan-Lamont, J., Kamolsiripichaiporn, S., Gleeson, L J & Windsor, P A (2019) A history of FMD research and control programmes in Southeast Asia: lessons from the past informing the future, Epidemiology & Infection, 147 Brehm K E., Kumar, N., Thulke, H H & Haas, B (2008) High potency vaccines induce protection against heterologous challenge with foot-and-mouth disease virus, Vaccine, 26(13): 1681-7 Carrillo C., Tulman, E., Delhon, G., Lu, Z., Carreno, A., Vagnozzi, A., Kutish, G & Rock, D L (2005) Comparative genomics of foot-and-mouth disease virus, Journal of virology, 79(10): 6487-6504 Cedillo-Barron L., Foster-Cuevas, M., Belsham, G J., Lefevre, F & Parkhouse, R M E (2001) Induction of a protective response in swine vaccinated with DNA encoding foot-and-mouth disease virus empty capsid proteins and the 3D RNA polymerase, Journal of General Virology, 82(7): 1713-1724 Chung W., Liao, P., Chen, S., Yang, P., Lin, Y., Jong, M & Sheu, T (2002) Optimization of foot-and-mouth disease vaccination protocols by surveillance of neutralization antibodies, Vaccine, 20(21-22): 2665-2670 Cokcaliskan, Can, Turkoglu, T., Sareyyupoglu, B., Uzunlu, E., Babak, A., Ozbilge, B B & Gulyaz, V (2016) QS-21 enhances the early antibody response to oil adjuvant foot-and-mouth disease vaccine in cattle, Clinical and experimental vaccine research, 5(2): 138-147 Cục Thú Y (2000) Báo cáo tổng kết công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 1999 Cục Thú y Hà Nội Cục Thú y (2010) Tiêu chuẩn Việt Nam 8400 -1: 2010 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đốn - Phần 1: Bệnh Lở mồm long móng Cục Thú Y (2018) Tổng kết cơng tác Thú y năm 2017 kế hoạch năm 2018 Daoud H M., Ibrahim, E E.-S., El-Din, W M G & Hassanin, A I H (2013) Preparation of Foot and Mouth Disease trivalent vaccine type A, O, SAT2 with determination of the Guinea pig protective dose 50 (GPPD50), Veterinary World, 6(11): 844 59 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Doel T (2003) FMD vaccines, Virus research, 91(1): 81 Dr Donald King D a D N., And Dr Mark Henstock & The Pirbright Institute, U 2017 Annual Report 2017 OIE/FAO Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory Network Golde W T., Pacheco, J M., Duque, H., Doel, T., Penfold, B., Ferman, G S., Gregg, D R & Rodriguez, L L (2005) Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in days and partial protection in days: use in emergency outbreak response, Vaccine, 23(50): 5775-5782 Grubman M J., Moraes, M P., Schutta, C., Barrera, J., Neilan, J., Ettyreddy, D., Butman, B T., Brough, D E & Brake, D A (2010) Adenovirus serotype 5vectored foot-and-mouth disease subunit vaccines: the first decade, Future Virology, 5(1): 51-64 Harmsen M., Fijten, H., Westra, D & Dekker, A (2015) Stabilizing effects of excipients on dissociation of intact (146S) foot-and-mouth disease virions into 12S particles during storage as oil-emulsion vaccine, Vaccine, 33(21): 2477-2484 J.F.Valarcher N J K., N.P.Ferris, D.J.Paton, V.Zakharov, A.Shebakov, Shang You-Jun, Liu Zai- Xin, Liu Xiang Tao, a Sanyal, D Hemadri, C Tosh and T.J.Rasool (2005) Recent spread of FMD virus serotype Asia 1, BMJ Jamal S M & Belsham, G J (2013) Foot-and-mouth disease: past, present and future, Vet Res, 44: 116 Kasambula L., Belsham, G., Siegismund, H R., Muwanika, V., Ademun‐Okurut, A & Masembe, C (2012) Serotype identification and VP1 coding sequence analysis of foot‐and‐mouth disease viruses from outbreaks in eastern and northern Uganda in 2008/9, Transboundary and emerging diseases 59(4): 323-330 Kesy A (2002) Global situation of foot-and-mouth disease (FMD) a short review, Polish journal of veterinary sciences, 5(4): 283-287 Kiều Mạnh Hùng (2012) Nghiên cứu chế tạo kit RT-PCR để chuẩn đoán virus lở mồm long móng (LMLM) đại diện lưu hành Việt Nam, Đại học Quốc gia Hà Nội, 18 tr Knowles N & Samuel, A (2003) Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus, Virus research, 91(1): 65-80 Knowles N J., He, J., Shang, Y., Wadsworth, J., Valdazo-González, B., Onosato, H., Fukai, K., Morioka, K., Yoshida, K & Cho, I.-S (2012) Southeast Asian foot-andmouth disease viruses in Eastern Asia, Emerging infectious diseases 18(3): 499 Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K (2018) MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549 60 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Lê Văn Phan, Vũ Thị Thu Hằng, Trương Thị Kha, Dương Hồng Quân, Lê Huỳnh Thanh Phương & Nguyễn Bá Hiên (2016) Giải mã phân tích trình tự gen VP1 số chủng virus lở mồm long móng type A, phân lập Hà Nội Hà Tĩnh năm 2013, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 24(1): 21 Lea S., Hernéndez, J., Blakemore, W., Brocchi, E., Curry, S., Domingo, E., Fry, E., Abu-Ghazaleh, R., King, A & Newman, J (1994) The structure and antigenicity of a type C foot-and-mouth disease virus, Structure, 2(2): 123-139 Leforban Y & Gerbier, G (2002) Review of the status of foot and mouth disease and approach to control/eradication in Europe and Central Asia, Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties, 21(3): 477-489 Liao P C., Lin, Y L., Jong, M H & Chung, W B (2003) Efficacy of foot-and-mouth disease vaccine in pigs with single dose immunization, Vaccine, 21(17): 18071810 Mahdy S., Liu, S., Su, L., Zhang, X., Chen, H., Pei, X & Wang, C (2019) Expression of the VP1 protein of FMDV integrated chromosomally with mutant Listeria monocytogenes strain induced both humoral and cellular immune responses, Applied microbiology and biotechnology, 103(4): 1919-1929 Maradei E., La Torre, J., Robiolo, B., Esteves, J., Seki, C., Pedemonte, A., Iglesias, M., D’aloia, R & Mattion, N (2008) Updating of the correlation between lpELISA titers and protection from virus challenge for the assessment of the potency of polyvalent aphtovirus vaccines in Argentina, Vaccine, 26(51): 6577-6586 Mason P W., Grubman, M J & Baxt, B (2003) Molecular basis of pathogenesis of FMDV, Virus research, 91(1): 9-32 Moonen P & Schrijver, R (2000) Carriers of foot‐and‐mouth disease virus: A review, Veterinary Quarterly, 22(4): 193-197 Nagendrakumar S B., Hong, N T T., Geoffrey, F T., Jacqueline, M M., Andrew, D., Michelle, G., Van Phuc, K., Ngon, Q V., Phuong, L T T., Phuc, N N H., Hanh, T X., Van Hung, V., Quynhanh, L T., Tan, T M., Long, N T & Wilna, V (2015) A Malaysia 97 monovalent foot-and-mouth disease vaccine (>6PD50/dose) protects pigs against challenge with a variant FMDV A SEA-97 lineage virus, and days post vaccination, Vaccine, 33(36): 4513-4519 Naranjo J & Cosivi, O (2013) Elimination of foot-and-mouth disease in South America: lessons and challenges, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 368(1623): 20120381 Ngô Thanh Long, Nguyễn Thanh Phương, Võ Văn Hùng, Bạch Đức Lữu, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Thu Thủy & Phạm Văn Đơng (2016) Chọn chủng virus lở mồm long móng týp O từ thực địa để nghiên cứu sản xuất vacxin Việt Nam, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 23(7): 5-14 61 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Nguyễn Bá Hiên (2010) Công nghệ chế tạo sử dụng vắc xin thú y Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 5-80 Nguyễn Thu Thủy, Nguyễn Văn Long, Phan Quang Minh, Trần Thị Thu Phương, Nguyễn Quang Anh, Nguyễn Ngọc Tiến, Nguyễn Đăng Thọ, Ngô Thanh Long & Nguyễn Bá Hiên (2014) Mức độ lưu hành virus lở mồm long móng yếu tố nguy số tỉnh trọng điểm từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2012, Tạp chí Khoa học Phát triển, 12(3): 345-353 Oie (2018) Foot and mouth disease, chapter 3.01.08 Park M.-E., Lee, S.-Y., Kim, R.-H., Ko, M.-K., Lee, K.-N., Kim, S.-M., Kim, B.-K., Lee, J.-S., Kim, B & Park, J.-H (2014) Enhanced immune responses of footand-mouth disease vaccine using new oil/gel adjuvant mixtures in pigs and goats, Vaccine, 32(40): 5221-5227 Paton D., Valarcher, J., Bergmann, I., Matlho, O., Zakharov, V., Palma, E & Thomson, G (2005) Selection of foot and mouth disease vaccine strains-a review, Revue Scientifique Et Technique-Office International Des Epizooties, 24(3): 981 Rodriguez L L & Gay, C G (2011) Development of vaccines toward the global control and eradication of foot-and-mouth disease, Expert review of vaccines, 10(3): 377-387 Salt J S., Barnett, P V., Dani, P & Williams, L (1998) Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission, Vaccine, 16(7): 746-54 Samuel A & Knowles, N (2001) Foot-and-mouth disease type O viruses exhibit genetically and geographically distinct evolutionary lineages (topotypes), Journal of General Virology, 82(3): 609-621 Tạ Hoàng Long, Nguyễn Văn Hưng, Trịnh Quang Đại, Trương Anh Đức, Nguyễn Thị Hồng Thắm & Nguyễn Viết Không (2011) Giám sát phân tử nguyên nhân diễn biến phức tạp dịch Lở mồm long móng, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 5: 18 Tiêu Chuẩn Quốc Gia 8685 (2014) Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - phần 10: Vắc xin vơ hoạt phịng bệnh Lở mồm long móng (FMD) Trần Xuân Hạnh (2020) Giá trị r1 hiệu phịng bệnh vacxin Lở mồm long móng Boehringer Ingelheim (BI) sản xuất, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 27(5): 84-89 Valarcher J., Ferris, N & Knowles, N (2005) Annual OIE/FAO FMD reference laboratory network report In: January-November 32 tr Valdazo-González B., Timina, A., Scherbakov, A., Abdul-Hamid, N F., Knowles, N J & King, D P (2013) Multiple introductions of serotype O foot-and-mouth disease viruses into East Asia in 2010–2011, Veterinary research, 44(1): 76 62 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Valtulini S., Macchi, C., Ballanti, P., Cherel, Y., Laval, A., Theaker, J., Bak, M., Ferretti, E & Morvan, H (2005) Aluminium hydroxide-induced granulomas in pigs, Vaccine, 23(30): 3999-4004 Văn Đăng Kỳ (2011) Bệnh lở mồm long móng biện pháp phịng, chống NXB Nông nghiệp Van Maanen C & Terpstra, C (1990) Quantification of intact 146S foot-and-mouth disease antigen for vaccine production by a double antibody sandwich ELISA using monoclonal antibodies, Biologicals, 18(4): 315-319 Van Phan L., Thi Thu Hang, V., Hong-Quan, D., Van Thai, T & Song, D (2016) Evolutionary phylodynamics of foot-and-mouth disease virus serotypes O and A circulating in Vietnam, BMC veterinary research, 12(1): 269 Zhang L., Zhang, J., Chen, H T., Zhou, J H., Ma, L N., Ding, Y Z & Liu, Y S (2011) Research in advance for FMD novel vaccines, Virol J, 8(1): 268 Zhao N., Chen, G.-H., Fang, Y.-X., Li, W.-S., Jia, H.-J & Jing, Z.-Z (2010) Enhanced Immunity to Killed FMDV Antigen by Dual Factors Recombinant Plasmid of Porcine Interferon-gamma and CpG Motifs, Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 10 63 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com PHỤ LỤC PHỤ LỤC HÌNH ẢNH MINH HOẠ Hình Hình ảnh lợn trước tiêm vắc xin LMLM vơ hoạt nhũ dầu Hình Vắc xin LMLM vơ hoạt nhũ dầu Chú thích: Mẫu 1: vắc xin LMLM vô hoạt với nồng độ log TCID50/ml ; Mẫu 2: vắc xin LMLM vô hoạt với nồng độ log TCID50/ml, Mẫu 3: vắc xin LMLM vô hoạt với nồng độ 7,5 log TCID50/ml 64 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hình Hình ảnh lấy máu lợn tiêm vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu thời gian theo dõi Hình Vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn 65 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hình Lợn tiêm vắc xin LMLM vơ hoạt keo phèn Hình Kit ELISA phát kháng thể kháng protein phi cấu trúc Hình Hệ thống máy đọc kết ELISA 66 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ... thiện đặc tính giống phân lập để sản xuất vắc xin thông qua vi? ??c thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch chủng vi rút O/ FMD/ Avac3 để sản xuất vắc xin vơ hoạt phịng bệnh lở mồm long móng? ??... luận văn: Nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch chủng vi rút O/ FMD/ Avac3 để sản xuất vắc xin vô hoạt phịng bệnh lở mồm long móng Ngành: Thú y Mã số: 64 01 01 Tên sở đ? ?o t? ?o: Học vi? ??n Nơng Nghiệp Vi? ??t... vơ hoạt phịng bệnh lở mồm long móng: chủng vi rút O/ FMD/ Avac3 sản phẩm đề tài nghiên cứu chọn chủng vi rút LMLM (b? ?o c? ?o công ty RTD kèm theo Công văn số 30.10/2016/BC-RTD) - Chủng giống vi rút