3.5.3.1. Phương pháp vô hoạt vi rút bằng BEI
- Vi rút LMLM thu hoạch từ môi trường sau gây nhiễm trên tế bào BHK21 được lọc, cô đặc và vô hoạt bằng BEI (Binary ethylenimine) theo khuyến cáo của OIE như sau (Oie, 2018):
+ Vô hoạt vi rút tại nồng độ 1mM BEI /ml kháng nguyên trong 24 giờ tại 37 0C.
+ Sau 24 giờ vô hoạt, trung hòa lượng BEI tồn dư bằng dung dịch Na- thiosulphate (Na2S2O3) trong 2 giờ tại 370C.
+ Thu hoạch vi rút và kiểm tra vi rút sau vô hoạt bằng phương pháp nuôi cấy lại huyễn dịch vi rút sau vô hoạt trên môi trường tế bào BHK21.
Kiểm tra vô hoạt vi rút: nuôi cấy và cấy chuyển 3 lần liên tiếp huyễn dịch vi rút đã vô hoạt trên môi trường tế bào BHK21. Vi rút được đánh giá là vô hoạt đạt yêu cầu nếu sau 3 lần cấy chuyển liên tiếp, không thấy bệnh tích trên chai nuôi cấy tế bào BHK21 sau 3 ngày theo dõi. Quá trình thực hiện trên chai tế bào T25, lượng huyễn dịch vi rút gây nhiễm là 1ml.
3.5.3.2. Phương pháp phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ
Phương pháp nhũ hóa bằng nhũ dầu khoáng kép Montanide ISA 201VG (nhũ nước trong dầu trong nước) của hãng Seppic (Pháp)
- Kháng nguyên và nhũ dầu được trộn theo tỷ lệ 1 : 1
- Quá trình nhũ hóa được thực hiện trên máy nhũ hóa vắc xin chuyên dụng với quy trình như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị pha dầu khoáng ISA 201VG đã tiệt trùng: khuấy nhẹ nhàng từ 50 - 100 vòng/phút trong khoảng 10 - 20 phút.
+ Bước 2: Chuẩn bị pha nước (kháng nguyên), chuyển từ từ kháng nguyên vào tank chứa pha dầu (theo tỷ lệ 1:1). Vừa chuyển kháng nguyên vừa tiếp tục khuấy trộn đến khi chuyển hết lượng kháng nguyên cần.
+ Bước 3. Tạo nhũ bằng máy khuấy chuyên dụng tại tốc độ 300 - 400 vòng/phút trong 20 - 30 phút. Quan sát thấy huyễn dịch đồng nhất hoàn toàn thì tắt máy khuấy.
Phương pháp phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ keo phèn nhôm Al(OH)3
- Kháng nguyên và chất bổ trợ được trộn theo tỷ lệ 1:1.
- Quá trình phối trộn được thực hiện trên tank phối trộn vắc xin chuyên dụng với quy trình như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị keo phèn phèn nhôm Al(OH)3 đã tiệt trùng: khuấy nhẹ nhàng từ 100 – 200 vòng/phút trong khoảng 20 - 30 phút.
+ Bước 2: Chuẩn bị kháng nguyên đã làm mát 2 - 8oC. Khuấy trộn 100 – 200 vòng/phút cho hỗn dịch đồng nhất.
+ Bước 3: Chuyển từ từ lượng keo phèn nhôm vào tank chứa kháng nguyên (theo tỷ lệ 1:1). Vừa chuyển keo phèn vừa tiếp tục khuấy trộn đến khi chuyển hết lượng keo phèn cần.
+ Bước 4: Tiếp tục khuấy trộn với tốc độ 100 - 200 vòng/phút trong 60 - 120 phút. Quan sát thấy huyễn dịch đồng nhất hoàn toàn thì tắt máy khuấy. Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC.
3.5.3.3. Phương pháp kiểm tra sau khi nhũ hóa vắc xin
- Kiểm tra tính chất nhũ đơn, nhũ kép bằng phương pháp Drop test: Nhỏ 2 ml vắc xin vào cốc nước cất, lặp lại 3 lần. Quan sát sự khuyếch tán giọt dầu trong nước. Dầu khoáng kép: Một phần nổi lên trên bề mặt thành lớp màu trắng, phần khác phân tán trong nước.
- Kiểm tra độ ổn định của nhũ theo hướng dẫn của nhà sản xuất: Ly tâm 10ml vắc xin tại 3500 vòng/30 phút kiểm tra mức độ phân pha của mẫu vắc xin nhũ dầu theo chỉ tiêu yêu cầu của nhà cung cấp. Nếu phần dầu tách ra ở phía trên trong giới hạn 5-10% cho phép và có thể phục hồi bằng tay khi đó vắc xin được chấp nhận.
- Kiểm tra hạt nhũ: Làm tiêu bản vắc xin và soi dưới kính hiển vi độ phóng đại tối thiểu 400 lần, yêu cầu hạt nhũ có kích thước nhỏ và đều.