Hiệu giá kháng thể trung hoà của lợn ở nhóm tiêm 2 mũi vắc xin được thể hiện trong bảng 4.2 và hình 4.5.
Bảng 4.2. Đáp ứng miễn dịch của lợn sau tiêm 2 mũi vắc xin
Lượng vi rút/ liều vắc
xin
Hiệu giá kháng thể trung hoà (log10 VNT50) tại các ngày (D) sau gây miễn dịch
D0 D14 D21 D28 D35 D42 D49 D56 6 log10 (N2) <0,90 0,90 0,99 ± 0,13 1,44 ± 0,17 1,53 ± 0,13 1,83 ± 0,13 1,98 ± 0,12 2,02 ± 0,08 7 log10 (N4) <0,90 0,90 0,96 ± 0,08 1,20± 0,11 1,68 ± 0,13 2,10 ± 0,24 2,46 ± 0,27 2,49 ± 0,25 7,5 log10 (N6) <0,90 0,90 0,96 ± 0,08 1,23 ± 0,13 1,40 ± 0,23 1,89 ± 0,17 2,16 ± 0,09 2,26 ± 0,19 Đối chứng (N9) <0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 Có thể thấy nhóm lợn đối chứng không chuyển dương tính huyết thanh học trong suốt thời gian thí nghiệm. Ở lô thí nghiệm này, cũng quan sát được sự tăng hiệu giá kháng thể trung hòa ở cả 3 nhóm (liều gây miễn dịch 6 - 7 - 7,5 log10 TCID50/ml) ở thời điểm 21 ngày sau vắc xin mũi 1 (0,9 log10 tăng lên 0,96 - 0,99 log10). Đáng chú ý, hiệu giá kháng thể trung hòa sau tiêm mũi 2 tiếp tục tăng cho đến ngày D56 (thời điểm kết thúc theo dõi). Tại thời điểm 56 ngày, kháng thể trung hoà được xác định của 3 nhóm N2 (liều gây miễn dịch 6 log10 TCID50/ml), N4 (liều gây miễn dịch 7 log10 TCID50/ml) và N6 (liều gây miễn dịch 7,5 log10 TCID50/ml) lần lượt là 2,02 log10; 2,49 log10 và 2,26 log10.
Biến động hiệu giá kháng thể và tương quan với các tiêu chuẩn về ngưỡng bảo hộ sau tiêm 2 mũi được trình bày ở hình 4.5.
Chuyển dương tính huyết thanh học ở nhóm lợn gây miễn dịch bắt đầu xuất hiện ở ngày 21 sau tiêm mũi 1. Sau thời điểm tiêm nhắc lại (D28 sau tiêm mũi 1), kháng thể trung hòa tiếp tục tăng và vượt ngưỡng dương tính (theo tiêu chí OIE) tại thời điểm D42. Tại thời điểm D56, hiệu giá kháng thể trung hòa ở cả 3 nhóm gây miễn dịch (với liều 6 - 7 - 7,5 log10 TCID50/ml) đã đạt ngưỡng bảo hộ theo TCVN (hiệu giá trung hòa ≥ 2 log10). Trong lô thí nghiệm này, hiệu giá trung hòa trên ngưỡng bảo hộ tiếp tục được duy trì cho đến thời điểm dừng theo dõi.
Các kết quả trình bày ở bảng 4.1- 4.2 và hình 4.4- 4.5 cho thấy đáp ứng miễn dịch kích thích sản sinh bởi vắc xin LMLM sản xuất từ chủng vi rút O3 phụ thuộc chủ yếu vào quy trình gây miễn dịch, trong đó gây miễn dịch 1 lần không đủ tạo đáp ứng miễn dịch ở ngưỡng bảo hộ so với gây miễn dịch 2 lần. Hình 4.6 được tổng hợp để làm rõ khác biệt kể trên.
Hình 4.6. So sánh hiệu giá kháng thểở lợn tại thời điểm D28 và D56
Tại thời điểm 28 ngày sau tiêm vắc xin, kết quả gây miễn dịch cho lợn bằng 1 mũi hoặc 2 mũi vắc xin đều không có khác biệt về hiệu giá kháng thể trung hòa tại (p > 0,05). Tuy nhiên, tại thời điểm D56 sau tiêm vắc xin mũi 1, lợn ở nhóm được tiêm 2 mũi vắc xin có hiệu giá kháng thể sai khác rõ ràng so với lợn ở nhóm được tiêm 1 mũi vắc xin (p < 0,05). Hiệu giá kháng thể của các nhóm lợn tiêm 2 mũi vắc xin cao hơn hẳn so với các nhóm lợn được tiêm 1 mũi vắc xin cùng nồng độ.
Hàm lượng kháng thể trung hòa tăng cao rõ rệt sau mũi tiêm nhắc lại phù hợp với quy luật hình thành kháng thể đặc hiệu, đưa kháng nguyên vào đúng liều lượng và được tiêm nhắc lại, kháng thể xuất hiện sẽ nhanh và cao hơn do được tiếp xúc với các tế bào “nhớ”. Đáp ứng miễn dịch khi gia súc tiêm phòng lần đầu có thể chỉ sau 6 tuần khả năng bảo hộ không còn đảm bảo, vì vậy để duy trì đáp ứng miễn dịch và nâng cao khả năng miễn dịch của động vật cứ sau một khoảng thời gian nhất định cần tiêm nhắc lại. Có tác giả còn khuyến cáo, để đạt được hiệu quả tốt khi tiêm phòng vắc xin LMLM cho lợn, việc tiêm phòng lần đầu nên được thực hiện khi lợn từ 10- 12 tuần tuổi, tiêm nhắc lại sau 4 tuần (Chung & cs., 2002).
Trong nghiên cứu sản xuất vắc xin, một trong các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của cơ thể là liều lượng vi rút kháng nguyên trong một liều vắc xin. Theo một số kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng kháng thể đạt được sẽ tỷ lệ thuận với liều lượng kháng nguyên đưa vào ở một phạm vi nhất định. Nếu liều lượng kháng nguyên quá thấp sẽ không đủ kích thích cơ thể gây đáp ứng miễn dịch. Nếu liều lượng kháng nguyên quá cao sẽ dẫn đến gây độc cho cơ thể, hoặc tê liệt miễn dịch, có thể dung nạp đặc hiệu với lần gây miễn dịch tiếp theo, cuối cùng là ức chế khả năng sản sinh ra kháng thể. Ngày nay trên thế giới có nhiều phương pháp để xác định liều của vắc xin LMLM như: xác định hàm lượng 146S hoặc phương pháp lý tưởng là đánh giá đáp ứng miễn dịch của động vật (tính liều PD50) bằng cách công cường độc (Oie, 2018). Tuy nhiên phương pháp xác định hàm lượng 146S yêu cầu thiết bị đắt tiền. Hạn chế của phương pháp xác định PD50 là đòi hỏi phải có phòng an toàn sinh học cấp 3 cho cả phòng thí nghiệm và khu nuôi động vật thí nghiệm. Vì vậy, trong điều kiện cơ sở vật chất hiện tại và khuôn khổ của đề tài, dựa trên hàm lượng vi rút LMLM chuẩn độ trước khi vô hoạt chúng tôi xác định liều gây miễn dịch cho bản động vật. Tham chiếu TCVN 8685-10:2014 và tiêu chuẩn của OIE, hiệu giá kháng thể của lợn sau khi tiêm 2 mũi vắc xin của cả 3 nhóm liều kháng nguyên (6 - 7 - 7,5 log10 TCID50/ml) đều đạt chỉ tiêu hiệu lực của vắc xin LMLM. Mặt khác, yếu tố hàm lượng vi rút trước khi vô hoạt còn là yếu tố quyết định trong quy trình sản xuất và giá thành sản phẩm. Vì vậy, từ các kết quả thu được nêu trên, nồng độ vi rút sản xuất vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu kép được chọn là 7 log10 TCID50/ml.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra ưu điểm nổi trội của việc sử dụng liều cao kháng nguyên vi rút LMLM (≥ 6PD50) trong việc (i) tạo ra đáp ứng
miễn dịch sớm (sau khi sử dụng vắc xin vô hoạt 4- 7 ngày) (Salt & cs., 1998; Nagendrakumar & cs., 2015), (ii) mở rộng khả năng bảo hộ chéo chống lại công cường độc (Brehm & cs., 2008) và (iii) vẫn đạt hiệu giá bảo hộ chỉ với 1 lần tiêm (Liao & cs., 2003). Do vậy, song song với việc sản xuất vắc xin LMLM từ chủng O3, cần tiếp tục nghiên cứu để nâng cao chất lượng vắc xin LMLM týp O ở tiêu chí nâng cao liều kháng nguyên.
4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT BỔ TRỢ TỚI ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
Chất bổ trợ là những hợp chất thêm vào trong vắc xin nhằm làm tăng khả năng kích thích miễn dịch và hiệu lực của vắc xin. Chất bổ trợ có thể quyết định mức độ và độ dài quá trình đáp ứng miễn dịch của vắc xin. Đặc biệt đối với vắc xin vô hoạt, chất bổ trợ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của vắc xin. Sau khi đã xác định được nồng độ vi rút (7 log10 TCID50/ml) và số lần tiêm vắc xin cho lợn (tiêm 2 mũi vắc xin, mũi 2 cách mũi 1 là 28 ngày), chúng tôi tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của bổ trợ keo phèn đến tính sinh miễn dịch của vắc xin. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của vắc xin bổ trợ keo phèn được trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn
Nhóm
Hiệu giá kháng thể trung hoà (log10 VNT50) tại các ngày (D) sau gây miễn dịch
D0 D14 D21 D28 D35 D42 D49 D56 Thí nghiệm (K1) <0,90 0,90 1,05 ± 0,13 1,28 ±0,15 1,63 ± 0,11 1,75 ± 0,08 1,60 ± 0,08 1,37 ±0,17 Đối chứng (K2) <0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 Kết quả hiệu giá kháng thể trung hoà của lợn trong bảng 4.3 cho thấy, lợn có đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn. Kháng thể bắt đầu tăng tại thời điểm 14 ngày sau tiêm, đến 28 ngày sau tiêm vắc xin hiệu giá là 1,28 log10. Sau khi tiêm mũi 2 tại 28 ngày, kháng thể bắt đầu tăng dần, hiệu giá đạt cao nhất tại thời điểm 42 ngày sau tiêm là 1,75 log10. Nhưng sau đó, kháng thể có xu hướng giảm dần, đến thời điểm 56 ngày sau tiêm, kháng thể trung hoà chỉ được 1,37 log10. Như vậy, kết quả cho thấy sau khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn ở lợn, kháng thể tăng nhưng không ổn định và không kéo dài. Biến động hiệu giá kháng thể trung hòa được thể hiện ở hình 4.7.
Hình 4.7. Biến động hiệu giá kháng thểở lợn tiêm vắc xin vô hoạt keo phèn
Nhóm lợn tiêm vắc xin vô hoạt keo phèn có hiệu giá kháng thể trung hòa tăng dần sau khi tiêm vắc xin. Đối chiếu với ngưỡng dương tính theo tiêu chí của OIE, hiện tượng chuyển dương tính xảy ra tại thời điểm D35 (1 tuần sau khi tiêm vắc xin mũi 2). Mặc dù vậy, đáp ứng miễn dịch ở ngưỡng dương tính chỉ duy trì được 3 tuần (sau tiêm vắc xin mũi 2). Đối chiếu tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8685-10: 2014 dễ nhận thấy vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn không đạt chỉ tiêu hiệu lực (hiệu giá kháng thể trung hòa cao nhất không vượt được mức quy định ≥ 2 log10).
Hình 4.8. So sánh đáp ứng miễn dịch ở lợn tiêm vắc xin nhũ dầu và keo phèn bằng phản ứng trung hòa
Với cùng lượng kháng nguyên gây miễn dịch (7 log10 TCID50) và sử dụng quy trình gây miễn dịch 2 lần, nhưng đáp ứng miễn dịch ở lợn tại thời điểm 56
ngày của nhóm tiêm vắc xin bổ trợ nhũ dầu thực sự cao hơn hẳn so với nhóm tiêm vắc xin bổ trợ keo phèn. Trong khi vắc xin bổ trợ nhũ dầu kích thích lợn sản sinh miễn dịch vượt ngưỡng bảo hộ (VNT = 2,49 log10 > tiêu chuẩn 2 log10) thì vắc xin bổ trợ keo phèn vẫn thấp hơn ngưỡng bảo hộ (VNT = 1,37 log10).
Nhằm có thêm thông tin trước khi kết luận về loại chất bổ trợ tốt nhất dùng sản xuất vắc xin vô hoạt, nhóm nghiên cứu sử dụng phản ứng LPB-ELISA để so sánh hiệu giá kháng thể trung hòa giữa nhóm lợn tiêm vắc xin nhũ dầu và nhóm lợn tiêm vắc xin keo phèn (trình bày ở hình 4.7 nêu trên). Hình ảnh đĩa phản ứng LPB-ELISA và kết quả so sánh được trình bày tại hình 4.9.
Hình 4.9. Kết quả LPB-ELISA phát hiện kháng thể trung hòa ở lợn
Phản ứng LPB-ELISA là một dạng blocking ELISA, do đó, mẫu có kháng thể đặc hiệu sẽ khóa các vị trí kháng nguyên ở trên bề mặt vi rút LMLM và dẫn tới không hình thành được liên kết giữa kháng thể bắt - vi rút - kháng thể đặc hiệu 2 - kháng kháng thể. Vì vậy, phản ứng dương tính (có kháng thể trung hòa) sẽ không hiện màu. Cụ thể, ở hình 4.9, mẫu 1 có kháng thể trung hòa đến ngưỡng pha loãng huyết thanh 1/64, mẫu 2 có hiệu giá trung hòa ở mức 1/256.
Kết quả đối chiếu hiệu giá kháng thể trung hòa bằng phản ứng LPB-ELISA giữa 2 nhóm lợn sau gây miễn dịch được trình bày ở hình 4.10.
Nhìn chung, kết quả so sánh đáp ứng miễn dịch bằng phản ứng LPB-ELISA (hình 4.10) tương đương với kết quả thực hiện bằng phản ứng trung hòa vi rút (hình 4.8). Trong đó, chỉ xác định được kháng thể trung hòa trên ngưỡng bảo hộ (theo TCVN) ở nhóm lợn được miễn dịch bằng vắc xin nhũ dầu tại thời điểm 56 ngày sau vắc xin mũi 1 (4 tuần sau vắc xin mũi 2). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.10. So sánh đáp ứng miễn dịch ở lợn tiêm vắc xin nhũ dầu và keo phèn bằng phản ứng LPB-ELISA
Tổng hợp kết quả ở hình 4.8 và hình 4.10 cho thấy, đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt có cùng nồng độ kháng nguyên nhưng phối trộn với chất bổ trợ khác nhau đã có sự khác biệt. Lợn được tiêm vắc xin vô hoạt keo phèn cũng có biến động hiệu giá kháng thể nhưng hiệu giá kháng thể không ổn định và không kéo dài. Còn đối với lợn khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu thì đáp ứng miễn dịch tăng chậm và có miễn dịch kéo dài và ổn định hơn khi tiêm mũi thứ 2.
Theo các nghiên cứu trước, vắc xin có công thức bổ trợ nhôm hydroxit và/hoặc saponin tạo ra đáp ứng miễn dịch kém trên lợn. Vắc xin có bổ trợ dầu khoáng, được phát triển thành công để sử dụng trên lợn, có khả năng bảo vệ ở đa số các loài (Doel, 2003; Park & cs., 2014). Hơn nữa, việc sử dụng chất bổ trợ keo phèn để sản xuất vắc xin cho lợn, khi tiêm cho lợn sẽ gây ra u cục, sưng tại vị trí tiêm (Valtulini & cs., 2005). Từ những kết quả và lập luận trên đây, nghiên cứu này kết luận: (i) chất bổ trợ ảnh hưởng đến sự hình thành đáp ứng miễn dịch đạt ngưỡng bảo hộ của vắc xin LMLM chế từ chủng vi rút O3; (ii) nhũ dầu là chất bổ trợ phù hợp cho sản xuất vắc xin LMLM vô hoạt.
4.4. KHẢ NĂNG BẢO HỘ CHÉO ĐỐI VỚICHỦNG VI RÚT THỰC ĐỊA
biến đổi. Do tính đa dạng về các subtýp trong cùng một týp huyết thanh học, việc tiêm phòng với subtýp này có thể không bảo vệ chống lại subtýp khác hoặc không hoàn toàn bảo hộ với các phân nhóm (lineage) trong cùng một subtýp. Do đó, vắc xin LMLM lý tưởng là loại vắc xin phổ bảo hộ rộng, phòng được nhiều chủng. Đây là vấn đề lớn trong việc kiểm soát bệnh LMLM. Mức độ bảo hộ có đạt được hay không là tuỳ thuộc vào ba yếu tố là: hiệu giá kháng thể được kích thích tạo ra, mức tương đồng kháng nguyên giữa các chủng vắc xin và chủng thực địa và lịch tiêm phòng.
Theo khuyến cáo của OIE, việc sản xuất vắc xin phân lập từ chủng vi rút thực địa được nhiều nước trên thế giới quan tâm và áp dụng để đảm bảo tính tương đồng giữa vi rút vắc xin và vi rút thực địa (Paton & cs., 2005). Phương pháp tiếp cận đơn giản nhất là tính giá trị liên quan (“r1” value) giữa vi rút thực địa, vi rút vắc xin với huyết thanh của động vật được miễn dịch bằng chủng vi rút vắc xin. Trong nghiên cứu này, một số chủng phân lập (cùng nhóm và khác nhóm topotype với vi rút vắc xin O3) đã được chọn để làm phản ứng trung hoà chéo với huyết thanh thu được của lợn (tại thời điểm 56 ngày) sau khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu. Kết quả xác định hiệu giá trung hòa chéo và chỉ số r1 được trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4. Giá trị r1 của chủng vắc xin với chủng vi rút thuộc topotype ME-SA
Mẫu huyết
thanh
Chủng vi rút dùng trong phản ứng trung hòa
O3 O Manisa O/VN/HN1/2013 O/VN/HT1/2015
VNT1 (x log10) VNT2 (x log10) r1 VNT2 (x log10) r1 VNT2 (x log10) r1 V1 2,70 1,51 0,56 1,96 0,73 2,10 0,78 V2 2,70 1,66 0,61 2,10 0,78 2,10 0,78 V3 2,56 1,51 0,59 1,36 0,53 1,65 0,64 V4 2,10 1,51 0,72 1,50 0,71 1,50 0,71 V5 2,40 1,66 0,69 1,96 0,82 1,96 0,82
* Hiệu giá kháng thể trung hòa đồng chủng (VNT1): huyết thanh gây miễndịch bởi virus vắc xin cho
trung hòa vi rút vắc xin; hiệu giá kháng thể trung hòa dị chủng (VNT2): huyết thanh gây miễn dịch bởi
chủng vi rút vắc xin cho trung hòa với vi rút thực địa.Chỉ số r1 được tính bằng công thức:
Hiệu giá kháng thể trung hòa đồng chủng của 5 mẫu huyết thanh (V1- V5) dao động từ 2,10 log10 - 2,70 log10 (cột 2, bảng 4.4) đều vượt ngưỡng dương tính kháng thể trung hòa theo tiêu chuẩn của OIE (>1,65 log10) và đạt ngưỡng bảo hộ theo TCVN (≥ 2,0 log10). Hiệu giá kháng thể trung hòa dị chủng của 5 mẫu huyết thanh nói trên với 3 chủng vi rút thuộc cùng topotype ME-SA dao động từ 1,36 log10 - 2,10 log10. Sự giảm về hiệu giá trung hòa đó phản ánh mức độ không tương đồng kháng nguyên tính ở một mức độ nhất định giữa các chủng vi rút LMLM trong cùng topotype. Kết quả xác định giá trị tương quan r1 được trình bày ở hình 4.11.
Giá trị r1 từ vị trí số 1-5 là chỉ số tương đồng kháng nguyên với giữa chủng vi rút vắc xin O3 với chủng vi
rút O/Manisa; vị trí 6-10 là là chỉ số tương đồng kháng nguyên với giữa chủng vi rút vắc xin O3 với
chủng vi rút O/VN/HN1/2013 và vị trí 11- 15 là chỉ số tương đồng kháng nguyên với giữa chủng vi rút