- Động vật thí nghiệm: lựa chọn lợn khoẻ mạnh, từ 4 -5 tuần tuổi, chưa được tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM.
- Để xác định động vật chưa tiêm vắc xin LMLM hoặc có bị nhiễm tự nhiên hay không sử dụng phương pháp ELISA: Kit ELISA phát hiện kháng thể kháng protein phi cấu trúc từ hãng IDEXX: Foot and mouth disease (FMD) multispecies Antibody Test Kit code 06-41379-00.
- Các bước thực hiện:
Bước 1: Huyết thanh
Lấy lượng giếng phủ kháng nguyên tương đương với lượng mẫu cần kiểm tra ghi lại vị trí mẫu . Các giếng còn lại chưa sử dụng được bảo quản trong túi có zip chống ẩm bảo quản 2-80C.
Ủ mẫu trong thời gian ngắn:
Cho 90µl dung dịch pha loãng mẫu vào mỗi giếng. Cho10µl đối chứng dương (PC) vào hai giếng Cho10µl đối chứng âm (NC) vào hai giếng
Cho 10 µl vào các giếng chứa dung dịch pha loãng mẫu Sử dụng pipet đa kênh trộn đều 10 lần ở tất cả các giếng
Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18-260C trong 60 phút (cho phép dao động 5 phút)
Bước 2: Conjugate
Đĩa sau khi ủ 18 - 260C trong 60 phút với cách ủ thời gian ngắn và 18-260C trong 30 phút với cách ủ thời gian dài.
Gỡ tấm dán mặt đĩa loại bỏ dung dịch trong đĩa ủ.
Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa 1X 300 µl/giếng/lần. Tránh để quá khô giữa các lần rửa và các đĩa rửa. Lần cuối cùng của lần rửa đập nhẹ đĩa vào giấy thấm để loại bỏ hết dung dịch rửa trong giếng.
Cho 100µl conjugate vào mỗi giếng
Với quy trình ủ trong thời gian ngắn: Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18-260C trong 60 phút (dao động 5 phút).
Với quy trình ủ trong thời gian qua đêm: Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18- 260C trong 30 phút (dao động 5 phút).
Bước 3: Cơ chất
Đĩa sau khi ủ conjugate gỡ tấm dán mặt đĩa loại bỏ dung dịch trong đĩa Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa 1X 300 µl/giếng/lần. Tránh để quá khô giữa các lần rửa và các đĩa rửa. Lần cuối cùng của lần rửa đập nhẹ đĩa vào giấy thấm để loại bỏ hết dung dịch rửa trong giếng.
Cho 100µl TMB vào mỗi giếng
Ủ ở 18-260C trong 10 phút (dao động 1 phút)
Bước 4: Dừng phản ứng và đọc kết quả
Cho 100µl stop solution vào mỗi giếng
Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA bước sóng 450nm (Chú ý nên đọc kết quả trong vòng 2 giờ sau khi dừng phản ứng)
Bước 5: Tính kết quả
Đối chứng: Đối chứng âm (Negative control: NC) Đối chứng dương (Positive Control: PC)
NCx= PCx =
Giá trị hợp lệ khi:
NCx ≤0.3 PCx ≤2.0 PCx-NCx≥0.3
Trong trường hợp kết quả giá trị đối chứng âm và đối chứng dương không hợp lệ thì cần phải làm lại thí nghiệm.
Mẫu:
S/P % = 100 x Sample A(450)-NCx) (PCx-NCx) Kết luận: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đối với trâu bò, dê, cừu: S/P % < 35 là âm tính, S/P % ≥ 35 là dương tính Đối với lợn: S/P % < 55 là âm tính, S/P % ≥ 55 là dương tính
3.5.5. Phương pháp xác định liều gây nhiễm và số lần tiêm vắc xin cho lợn
Bước 1: Xây dựng khung liều vi rút O/FMD/Avac3 trước khi vô hoạt: 106 , 107, 107,5 TCID50/ml
Bước 2: Tiến hành vô hoạt từng nồng độ vi rút. Phối trộn với chất bổ trợ nhũ dầu.
Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 35 con lợn 4 -5 tuần tuổi, chưa được tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM
Bố trí thí nghiệm như sau:
Nhóm Kí hiệu nhóm (2ml/con/lần)Số lần tiêm Số con
106 (TCID50/ml) N1 1 5 N2 2 5 107 (TCID50/ml) N3 1 5 N4 2 5 107,5 (TCID50/ml) N5 1 5 N6 2 5
Đối chứng N7 Không tiêm 5
Lợn được tiêm 2 mũi, mũi 2 cách mũi 1 là 28 ngày
Lấy máu thu hoạch huyết thanh vào các thời điểm 0, 14, 21, 28, 35, 42, 49 và 56 ngày sau mũi 1.
Xác định hiệu giá kháng thể của lợn sau tiêm của từng nồng độ vi rút. So sánh, lựa chọn liều gây nhiễm phù hợp.
Theo dõi độ dài miễn dịch của vắc xin trên lợn. Tiến hành lấy máu, cách nhau 2 tuần, đến hết 6 tháng sau khi tiêm mũi 2. Xác định hiệu giá kháng thể của lợn bằng phương pháp trung hoà và phương pháp ELISA.
3.5.6. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể của lợn tiêm vắc xin keo
phèn
Chuẩn bị: 15 lợn 4 -5 tuần tuổi chưa tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM
Vắc xin LMLM vô hoạt được phối trộn với chất bổ trợ keo phèn Bố trí thí nghiệm:
+ Nhóm thí nghiệm (K1): 10 con, Lợn được tiêm 2 mũi, mũi 2 cách mũi 1 là 28 ngày
+ Nhóm đối chứng (K2): 5 con, không tiêm vắc xin Lấy máu lợn tại các thời điểm 0, 28, 56 ngày.
Xác định hiệu giá kháng thể của lợn sau khi tiêm bằng phương pháp VNT và phương pháp LPB- ELISA.
3.5.7. Phương pháp định lượng kháng thể bằng phương pháp LPB – ELISA (Liquid phase blocking ELISA) (Liquid phase blocking ELISA)
Theo hướng dẫn của TCVN 8400 -1 -2010 (Tcvn 8400 -1: 2010, 2010) phương pháp LPB – ELISA được tiến hành theo bộ kít Liquid Phase Blocking ELISA (LPBE) for Detection FMDV Antibody Test Kit, Pirbright, UK như sau:
Xử lý mẫu:
- Lấy mẫu máu lợn: Tất cả mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải được bao gói cẩn thận, bảo quản ở 4°C đến 8°C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm sớm nhất có thể
- Xử lý mẫu: Mẫu máu khi lấy xong để ở nhiệt độ phòng 2-3 giờ. Sau đó, cho mẫu vào tủ 4°C để ra huyết thanh.
- Chuyển mẫu sang ống eppendorf 1.5ml
- Ly tâm mẫu ở 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C
- Thu huyết thanh vào ống eppendorf 1.5ml (ghi ngày tháng năm lấy mẫu, nơi lấy mẫu, số thứ tự của phòng thí nghiệm).
- Mẫu huyết thanh được xử lý nhiệt 560C trong 30 phút. - Mẫu huyết thanh để lưu mẫu được quản ở tủ -20°C. Tiến hành phản ứng:
Bước 1: Phủ đĩa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho 50 µl rabbit antisera 1/1000 vào các giếng tương ứng của đĩa ELISA Vỗ nhẹ thành đĩa đảm bảo dung dịch phủ kín đáy đĩa, dán tấm dán đĩa Bước 2: Ủ huyết thanh chẩn đoán với kháng nguyên
Pha loãng mẫu theo cơ số 2 trong đĩa 96 giếng chữ U và cho 50 µl huyết thanh đã pha loãng theo sơ đồ bố trí thí nghiệm (từ 1-5 mẫu) sau:
Pha kháng nguyên chuẩn trong dung dịch ELISA buffer. Thêm 50µl vào mỗi giếng đã có huyết thanh pha loãng (riêng đối chứng kháng nguyên chỉ cho dung dịch ELISA buffer)
Lắc nhẹ đĩa đảm bảo trộn đều kháng nguyên và huyết thanh Ủ ở 2-80C qua đêm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1/8 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 C++ C++ B 1/16 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 C+ C+ C 1/32 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 C+ C+ D 1/64 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 C- C- E 1/128 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 Ca Ca F 1/256 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 G 1/512 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 H
Bước 3: Chuyển hỗn hợp phản ứng kháng nguyên/huyết thanh vào đĩa ELISA
Rửa đĩa ELISA đã phủ Rabbit antiserum 5 lần 200µl cho một giếng/lần bằng PBS pH 7.4. Đập nhẹ trên giấy thấm để thấm khô dung dịch trong đĩa.
Hút 50µl hỗn hợp kháng nguyên và huyết thanh từ đĩa chữ U sang đĩa ELISA theo đúng sơ đồ thí nghiệm trên.
Ủ lắc 370C trong 1 giờ
Bước 4: Cho kháng thể nhận biết (Guinea Pig antisera)
- Pha loãng kháng thể nhận biết Guinea Pig Antisera serotype O ở hiệu giá 1/1000 trong dung dịch ELISA buffer
- Loại bỏ dung dịch trong đĩa ELISA sau khi ủ. Rửa đĩa ELISA lần 200µl cho một giếng/lần bằng PBS pH 7.4. Đập nhẹ trên giấy thấm để thấm khô dung dịch trong đĩa.
- Cho 50µl guinea pig antisera 1/1000 vào tất cả các giếng - Ủ 370C trong 1 giờ
Bước 5: Cho Rabbit anti guinea pig HRP
- Pha loãng rabbit anti-guinea pig-HRP 1/1000 trong dung dịch ELISA buffer
- Loại bỏ dung dịch trong đĩa ELISA sau khi ủ. Rửa đĩa ELISA lần 200µl cho một giếng/lần bằng PBS pH 7.4. Đập nhẹ trên giấy thấm để thấm khô dung dịch trong đĩa.
- Cho 50µl Rabbit anti guinea pig HRP 1/1000 vào tất cả các giếng - Ủ 370C trong 1 giờ
Bước 6: Cho dung dịch cơ chất
- Loại bỏ dung dịch trong đĩa ELISA sau khi ủ. Rửa đĩa ELISA lần 200µl cho một giếng/lần bằng PBS pH 7.4. Đập nhẹ trên giấy thấm để thấm khô dung dịch trong đĩa.
- Cho 50µl cơ chất vào tất cả các giếng - Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng/10 phút
Bước 7: Dừng phản ứng và đọc kết quả
- Cho 50µl dung dịch Stop solution vào mỗi giếng. Gãi nhẹ đáy giếng cho dung dịch tan đều trong mỗi giếng
Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA bước sóng 492 nm. Bước 8: Phân tích kết quả
Các điều kiện chấp nhận đĩa phản ứng
Các giá trị PI của đối chứng được tính như sau: PI = 100 - (OD đối chứng *100)
OD trung bình của Ca
Các đối chứng phải thỏa mãn các điều kiện sau: Khoảng OD và giá trị PI của đối chứng được nhà sản xuất đưa ra
Đối chứng UCL LCL Ca (OD) 1.9 0.8 Ca (PI) 25 -25 C++ (PI) 100 85 C+ (PI) 85 50 C- (PI) 40 0
Chú thích: UCL (Upper Control Limits): giới hạn trên của đối chứng LCL (Low Control Limits): Giới hạn dưới của đối chứng
Phân tích kết quả của mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giá trị PI của mẫu được tính như sau: PI = 100 - (OD mẫu *100)
OD trung bình của Ca
3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen VP1 và xây dựng cây phả hệ
Gen VP1 của vi rút lở mồm long móng là gen mã hóa cho protein vỏ của vi rút- là protein quan trọng của vi rút quyết định đến độc lực gây bệnh của vi rút. Sự biến đổi di truyền của vi rút LMLM tập trung vào gen VP1. Để có thể giải mã toàn bộ trình tự gen này, nghiên cứu sử dụng cặp mồi đặc hiệu dùng trong phản ứng RT-PCR để khuếch đại gen VP1 phục vụ cho việc giải mã trình tự gen. VN- VP1F: 5’- AGYGCYGGYAARGAYTTTGA -3’; VN-VP1R: 5’- CATGTCYTCYTGCATCT GGTT-3’ (Lê Văn Phan & cs., 2016). Sản phẩm PCR có kích thước 821 bp được giải trình tự gen VP1 bởi công ty 1st BASE.
Phương pháp xây dựng cây phả hệ được thực hiện theo phần mềm MEGA X (Kumar & cs., 2018).
3.5.9. Xử lý số liệu
- Tính toán cơ bản được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel.
- So sánh các giá trị trung bình bằng phân tích sâu ANOVA một yếu tố (post- hoc One way ANOVA) với phép thử Tukey’s.
+ Giá trị P> 0,05: Sự sai khác không có ý nghĩa thống kê. + Giá trị P< 0,05: Sự sai khác có ý nghĩa thống kê.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Dự án khoa học & công nghệ (KHCN) bắt đầu thực hiện từ năm 2013 về danh mục các nhiệm vụ của sản phẩm quốc gia “Sản xuất vắc xin phòng bệnh cho vật nuôi của Việt Nam”; trong đó có nội dung giao cho Công ty RTD tổ chức thực hiện dự án “Công nghệ sản xuất vắc xin phòng bệnh lở mồm long móng cho gia súc” trong giai đoạn 2014 – 2018.Trong giai đoạn này, công ty đã có kết quả bước đầu trong công tác chọn giống phân lập từ các địa phương và hoàn thành hồ sơ giống các týp O, A và Asia1 để sử dụng sản xuất vắc xin. Bước sang giai đoạn 2018-2020, với mục tiêu sản xuất vắc xin đơn giá và đa giá týp O, A từ các chủng đã phân lập, đạt các chỉ tiêu vô trùng, an toàn và hiệu lực, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính sinh miễn dịch của chủng vi rút O/FMD/Avac3 (sau đây gọi là chủng O3) với các chất bổ trợ khác nhau và tính tương đồng kháng nguyên với các chủng thực địa khác.
4.1. ĐẶC TÍNHDI TRUYỀN CỦA CHỦNG GIỐNG
Kết quả phân tích - so sánh trình tự gen mã hóa protein VP1 của chủng vi rút O3 với 20 chủng vi rút týp O phát hiện được ở Việt Nam từ 2006- 2019 được trình bày ở hình 4.1.
So với các chủng vi rút cùng týp huyết thanh, chủng vi rút O3 khác biệt về khoảng cách di truyền tương đối rộng (0,036 đến 0,179). Kết quả đó là do có sự hiện diện nhiều topotype vi rút LMLM týp O ở Việt Nam, trình bày ở hình 4.2.
Hình 4.2. Mối liên hệ di truyền dựa vào gen VP1 của vi rút LMLM týp O
Dựa vào trình tự gen công bố ở GenBank, đến năm 2019 ở Việt Nam có ít nhất 3 topotype vi rút LMLM týp O là Cathay, SEA và ME-SA. Trong đó chủng vi rút O3 thuộc topotype ME-SA. Các chủng vi rút LMLM thuộc topotype ME-
SA vẫn hiện diện ở Việt Nam cho tới những năm gần đây. Như vậy, chủng vi rút dùng nghiên cứu sản xuất vắc xin LMLM là một trong những đại diện của 3 topotype vi rút lưu hành ở Việt Nam. Các phần dưới đây trình bày kết quả xác định chỉ tiêu về đáp ứng miễn dịch của vắc xin chế tạo từ chủng O3.
4.2. KHẢ NĂNG SẢN SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
4.2.1. Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm một mũi vắc xin
Theo khuyến cáo của OIE, lượng vi rút LMLM đưa vào sản xuất vắc xin cần thiết là ≥ 6,5 log10 TCID50/ml. Trong nghiên cứu khả năng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch, chúng tôi đưa ra các khung nồng độ vi rút trước vô hoạt là: 6 log10, 7 log10, 7,5 log10 TCID50/ml. Đáp ứng miễn dịch của lợn được đánh giá bằng phương pháp trung hòa, với kết quả minh họa ở hình 4.3.
Ghi chú: giá trị 1/x là độ pha loãng huyết thanh xét nghiệm.Đóng khung màu xanh/ màu đỏ tương ứng là
độ pha loãng tại đó trung hòa hoàn toàn/ không trung hòa vi rút
Kết quả trên cho biết ở nhóm đối chứng có sự khác biệt rõ giữa đối chứng vi rút (phá hủy hoàn toàn thảm tế bào) và đối chứng âm không có vi rút (thảm tế bào còn nguyên vẹn). Ở nhóm xét nghiệm, theo độ pha loãng tăng dần (hàm lượng kháng thể trung hòa vi rút LMLM giảm dần), thảm tế bào bị phá hủy càng rõ. Trong hình 4.3, ngưỡng mà tại đó trung hòa hoàn toàn vi rút được xác định là 1/32. Biến động hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút LMLM ở nhóm lợn sau tiêm một mũi vắc xin được tổng hợp ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi tiêm 1 mũi vắc xin
Lượng vi rút/ liều
vắc xin
Hiệu giá kháng thể trung hoà (log10 VNT50) tại các ngày (D) sau gây miễn dịch
D0 D14 D21 D28 D35 D42 D49 D56 6 log10 (N1) <0,90 0,90 0,99 ± 0,13 1,26 ± 0,09 1,29± 0,18 1,11± 0,18 0,98 ± 0,08 0,96 ± 0,08 7 log10 (N3) <0,90 0,90 0,99 ± 0,1 1,35 ± 0,15 1,29 ± 0,17 1,14 ± 0,21 1,05 ± 0,19 0,93 ± 0,06 7,5 log10 (N5) <0,90 0,90 0,99 ± 0,13 1,17 ± 0,07 1,20 ± 0,16 1,11 ± 0,18 1,02 ± 0,12 0,90 ± 0 Đối chứng (N7) <0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 Lợn thuộc nhóm đối chứng tại tất cả các thời điểm lấy mẫu đều không chuyển dương tính với kháng thể kháng vi rút LMLM (hàng thứ 6, bảng 4.1). Ở nhóm gây miễn dịch quan sát được hiện tượng chuyển dương tính tại các thời điểm sau tiêm. Cụ thể như sau:
Nhóm N1 (liều gây miễn dịch 6 log10 TCID50/ml), hiệu giá kháng thể của lợn có chiều hướng tăng sau tiêm cho đến thời điểm D35. Cụ thể hiệu giá kháng thể tăng từ 0,9 log10 đến cao nhất là 1,29 log10 (tại thời điểm 35 ngày sau tiêm). Tuy nhiên, sau đó đáp ứng miễn dịch của lợn giảm dần tại các thời điểm lấy máu: D42 đến D56. Đến thời điểm 56 ngày, xác định hiệu giá kháng thể của lợn chỉ đạt 0,96 log10.
Ở nhóm N3 (liều gây miễn dịch 7 log10 TCID50/ml), kháng thể tăng từ ngày thứ 21 sau tiêm và đạt cao nhất tại thời điểm 28 ngày sau tiêm là 1,35 log10. Các thời điểm 35, 42, 49 và 56 ngày hiệu giá giảm dần và kết quả tại 56 ngày. Kết quả cho thấy, mặc dù lượng vi rút gây miễn dịch tăng gấp 10 lần so với nhóm N1, nhưng đáp ứng miễn dịch không được tăng cường một cách tuyến tính. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});