Nghiên cứu tỷ lệ và mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn đường hô hấp tại bệnh viện hữu nghị việt tiệp hải phòng từ 2020 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG KIỀU MAI LOAN NGHIÊN CỨU TỶ LỆ VÀ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP DƯỚI TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ VIỆT TIỆP NĂM 2020 2021 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HẢI PHÒNG 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG KIỀU MAI LOAN NGHIÊN CỨU TỶ LỆ VÀ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP DƯỚI TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ VIỆT TIỆP NĂ.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG KIỀU MAI LOAN NGHIÊN CỨU TỶ LỆ VÀ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP DƯỚI TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ VIỆT TIỆP NĂM 2020-2021 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HẢI PHÒNG - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG KIỀU MAI LOAN NGHIÊN CỨU TỶ LỆ VÀ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP DƯỚI TẠI BỆNH VIỆN HỮU NGHỊ VIỆT TIỆP NĂM 2020-2021 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số:8720601 Người hướng dẫn khoa học: TS.BS Nguyễn Hùng Cường HẢI PHÒNG – 2021 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phịng Sau đại học, Bộ mơn Kỹ thuật y học Trường đại học Y Dược Hải Phòngđã giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu nhà trường Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, Khoa vi sinh, Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp Hải Phòng tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành cơng trình luận án Với lịng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.BS Nguyễn Hùng Cường người Thầy trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ em hồn thành cơng trình nghiên cứu hồn thiện luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Thầy Bộ môn Kỹ thuật Y học, Thầy Hội đồng đề cương đóng góp ý kiến quý báu cho em hoàn thiện luận văn Em xin chân thành cảm ơnđồng nghiệp, người thân,bạn bè, tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn tất người bệnh, người tình nguyện tin tưởng, hợp tác giúp tơi hồn thành nghiên cứu Hải Phịng, ngày … tháng … năm 2021 Tác giả Kiều Mai Loan LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu tỷ lệ mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn đường hô hấp tại Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp Hải Phòng từ 2020 - 2021” đề tài thực hướng dẫn khoa học TS.BS Nguyễn Hùng Cường Các số liệu nghiên cứu thu thập, sử dụng cho phép Ban Giám đốc Khoa Vi sinh, Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng Các số liệu hồn tồn trung thực chưa cơng bố nghiên cứu Hải Phòng, ngày … tháng … năm 2021 Tác giả Kiều Mai Loan DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt NKHH Tên tiếng Anh đầy đủ NKHHD LRTIs Lower respiratory tract infection WHO ESBL CS BV TKMX TCV World Health Organization Men beta-lactamase phổ rộng MRSA Cộng Bệnh viện Trực khuẩn mủ xanh Tụ cầu vàng MethicillinResistant Staphylococcus Aureus Nghiên cứu Người bệnh NC NB AST ATCC CDC CLSI E coli K pneumoniae A baumannii P aeruginosa S aureus Giải thích tiếng việt Nhiễm khuẩn hô hấp Nhiễm khuẩn hô hấp Nhiễm trùng đường hô hấp Tổ chức Y tế Thế giới Antimicrobial Susceptibility Testing American Type Culture Collection Centers for Disease Control and Prevention Clinical and Laboratory Standards Institute Kháng sinh đồ Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ Trung tâm kiểm soát ngăn ngừa bệnh tật Viện chuẩn thức xét nghiệm lâm sàng Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan nhiễm khuẩn hô hấp 1.1 Đặc điểm giải phẫu đường hô hấp 1.2 Nhiễm khuẩn đường hô hấp 1.2.3 Cơ chế bệnh sinh 1.2.4 Các loại bệnh NKHH tác nhân gây bệnh thường gặp Tình hình nghiên cứu NKHH thời gian gần 17 2.1 Tình hình nghiên cứu NKHH 17 2.2 Căn nguyên vi khuẩn gây NKHH thường gặp mức độ đề kháng kháng sinh 19 2.2.1 Họ vi khuẩn đường ruột 19 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy định danh vi khuẩn gây bệnh 26 2.3.2 Phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử (PCR) 28 Chương 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU29 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 29 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.1.2 Địa điểm 29 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang 29 2.2.2 Cỡ mẫu: 30 2.2.3 Sơ đồ nghiên cứu 30 2.2.4 Các biến số nghiên cứu 31 2.3 Hóa chất sinh phẩm, thiết bị qui trình kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 31 2.3.1.Hóa chất sinh phẩm 31 2.3.2 Thiết bị máy móc 31 2.3.3 Các qui trình kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 31 2.4 Thu thập xử lí số liệu 32 2.5 Sai số phương pháp khống chế sai số 32 2.5.1 Sai số 32 2.5.2 Phương pháp khống chế sai số 32 2.6 Đạo đức nghiên cứu 33 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 Tỷ lệ loại vi khuẩn gây NKHH phân lập từ Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp Hải Phòng 34 3.2 Đánh giá mức độ nhạy cảm kháng sinh số vi khuẩn phân lập 40 Chương 4: BÀN LUẬN 45 4.1 Tỷ lệ loại vi khuẩn gây nhiễm khuẩn đường hô hấp phân lập từ Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp Hải Phòng năm 2020 – 2021 45 4.2 Đánh giá mức độ nhạy cảm kháng sinh số vi khuẩn phân lập 53 KẾT LUẬN KHUYẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng Phân loại nhóm tuổi đối tượng nghiên cứu (n=2030) 34 Bảng Tỷ lệ chủng vi khuẩn phân lập theo năm 37 Bảng 3 Tỷ lệ chủng vi khuẩn phân lập gây nhiễm khuẩn đường hơ hấp theo nhóm tuổi 38 Bảng Tỷ lệ loại vi khuẩn phân lập theo khoa 39 Bảng Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Acinetobacter baumannii 40 Bảng Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 41 Bảng Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn E.coli 42 Bảng Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn S.aureus 43 Bảng Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 44 DANH MỤC HÌNH Hình 1 Giải phẫu quan hô hấp Hình Quy trình nghiên cứu…………………………………………… 30 Hình Phân loại đối tượng nghiên cứu theogiới tính (n=2030)……… 34 Hình Tỷ lệ loại bệnh phẩm nuôi cấy theo giới (n=2030) 35 Hình 3 Tỷ lệ bệnh phẩm ni cấy theo mùa(n=2030) 35 Hình Tỷ lệ mẫu dương tính theo năm 36 Hình Tỷ lệ phân lập vi khuẩn gây bệnh theo khoa (n=2030) 37 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Phân loại đối tượng nghiên cứu theogiới tính 34 Biểu đồ Tỷ lệ loại bệnh phẩm nuôi cấy theo mùa 35 Biểu đồ 3 Tỷ lệ mẫu dương tính theo năm 36 Biểu đồ Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Error! Bookmark not defined Biểu đồ 5.Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn S.aureus 43 Vihệ Một hai Định danh làm KSĐ loại Số lượng > Vihệ Pseudomonas aeruginosa Số lượng Định danh làm KSĐ Các vi khuẩn không lên men Số lượng ≤ Vi hệ khác (Bordetella bronchise Số lượng > Vi hệ Định danh làm KSĐ ptica, Stenotrophomonas maltophil ia, Acinetobacter spp.,Burkholderia cepacia…) Số lượng ≤ Vi hệ Không báo cáo kết Định danh có chọn lọc > loại trực khuẩn Gram âm, cho bệnh nhân ICU > loại hình thái khác Số lượng > Vi hệ suy giảm miễn dịch, lưu giữ chủng làm KSĐ bác sỹ yêu cầu Các trực khuẩn Gram dương Số lượng ≤ Vi hệ Không báo cáo kết Corynebacterium spp Số lượng > Vi hệ Định danh làm KSĐ Rhodococcus equi Số lượng Định danh làm KSĐ Actinomycetes hiếu khí Định danh làm KSĐ (Nocardia Số lượng spp.,Streptomyces) Nấm men Cryptococcus neoformans Số lượng Định danh Nấm sợi Các loài nấm sợi (Aspergillus spp., Số lượng Định danh Mucor spp., ) - Báo cáo Âm tính tất đĩa mơi trường khơng mọc khuẩn lạc(khóm): Báo cáo “Không mọc vi khuẩn/ vi nấm gây bệnh” Hoặc báo cáo “Vi hệ đường hô hấp trên” 10 Diễn giải kết quả Vi sinh vật mọc với số lượng coi gây bệnh khi: - Khuẩn lạc (khóm) vi khuẩn/vi nấm gây bệnh mọc tương đối nhiều nhiều vùng thứ 2, và/ vùng thứ 3, và/ vùng thứ - Khuẩn lạc (khóm) vi khuẩn/ vi nấm gây bệnh mọc vùng phù hợp với hình ảnh tiêu nhuộm Gram có bạch cầu đa nhân trung tính Hoặc tiêu nhuộm Gram có khơng có vi hệ đường hơ hấp có nhiều tế bào mủ 11 Hạn chế - Một số vi sinh vật gây viêm phổi không mọc mơi trường ni cấy thơng thường (ví dụ: Legionella, virus, vi nấm, Mycoplasma, Mycobacteria) - Âm tính giả lấy, bảo quản vận chuyển bệnh phẩm không qui định bệnh nhân điều trị kháng sinh từ trước - Dương tính giả bệnh phẩm bị vi hệ cư trú đường hô hấp mọc lấn át vi khuẩn gây bệnh bệnh phẩm bị nhiễm bẩn từ dụng cụ chứa bị nứt vỡ 12 Lưu ý (cảnh báo) - Quy trình áp dụng để ni cấy vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện dễ mọc, khơng áp dụng cho vi khuẩn kỵ khí bắt buộc Kết âm tính khơng có nghĩa khơng có vi khuẩn gây bệnh bệnh phẩm mà khơng tìm thấy nguyên vi khuẩn gây bệnh phân lập quy trình ni cấy - Nếu bác sỹ lâm sàng có u cầu tìm vi khuẩn gây bệnh gặp, vi nấm gây bệnh phải ghi cụ thể để tránh bỏ sót - Bệnh phẩm lấy, vận chuyển bảo quản khơng u cầu đưa đến kết âm tính dương tính giả 13 Lưu trữ hồ sơ Tất hồ sơ lưu trữ theo qui định phù hợp với Khoa/Phòng/Bộ phận vi sinh bệnh viện PHỤ LỤC KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ KHOANH GIẤY KHUẾCH TÁN (KIRBY-BAUER) Xét nghiệm kháng sinh đồ thực phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng nhằm xác định khả ức chế in vitro kháng sinh với vi khuẩn nhằm hai mụcđích: Địnhhướngchobácsĩlâmsànglựachọnkhángsinhphùhợpchotừngbệnhnhân - Cung cấp chứng dịch tễ học xu hướng đề kháng kháng sinh vi khuẩn giai đoạn, khu vực, sở để xây dựng hướng dẫn điều trị khángsinh Nguyên lý của kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếchtán Mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn thử nghiệm đánh giá dựa vào vùng ức chế tạo xung quanh khoanh giấy thấm kháng sinh Khi đặt khoanh giấy kháng sinh bề mặt thạch, kháng sinh khuếch tán vào thạch; xa khoanh giấy, nồng độ kháng sinh giảm Sự phát triển vi khuẩn bị ức chế kháng sinh đạt đến nồng độ định Dựa vào đường kính vùng ức chế điểm gãy tài liệu hướng dẫn phiên giải kết kháng sinh đồ, mức độ nhạy cảm phân chia thành phân loại S (susceptible - nhạy cảm), I (intermediate - trung gian), R (resistant - đề kháng) NS (non-susceptible - không nhạycảm) Phạm vi ápdụng QuytrìnhnàysửdụngđốivớicácchủngvikhuẩnthuộchọEnterobacteriaceae vi khuẩn dễ ni cấy khác - Quy trình áp dụng cho chủng vi khuẩn khó ni cấy, vi khuẩn kị khí tuyệt đối với chủng Mycobacteria, cần phải thay đổi môi trường, điều kiện nuôi cấy cho phù hợp theo hướng dẫn thứckhác Giải thích thuậtngữ - Kháng sinh: Là chất nồng độ thấp có khả ức chế tiêu diệt vi khuẩn cách đặc hiệu cách gây rối loạn phản ứng sinh học tầm phântử - Thử nghiệm nhạy cảm với kháng sinh: kỹ thuật xác định độ nhạy cảm vi khuẩn với khángsinh - Khuếch tán thạch: Kháng sinh từ khoanh giấy đặt mặt thạch khuếch tán môi trường thạch xung quanh khoanhgiấy - Khoanh giấy thấm kháng sinh: Khoanh giấy tròn thường có đường kính mm thấm lượng kháng sinh nhấtđịnh - Độ đục chuẩn McFarland sử dụng để hiệu chỉnh độ đục huyền dịch vi khuẩn cho huyền dịch vi khuẩn sau pha chứa số lượng vi khuẩn định tương đương với độ đục chuẩn sử dụng Độ đục chuẩn pha chế từ BaCl2 H2SO4 để BaSO4 kết tủa tạo nên độ đục dung dịch chuẩn Độ đục chuẩn McFarland 0,5 pha từ 0,05 ml BaCl2.2H2O 1,175% với 9,95 ml H2SO4 1% Huyền dịch vi khuẩn có độ đục tương đương với độ đục McFarland 0,5 chứa khoảng 1- x 108 CFU/ml E coli ATCC25922 - Vùng ức chế: Là vùng mà khơng nhìn thấy phát triển vikhuẩn - CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): Viện Chuẩn thức Lâm sàng Xétnghiệm - EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing): Uỷ ban châu Âu Thử nghiệm kháng sinhđồ - S (Susceptibility) - Nhạy cảm: Một vi khuẩn coi nhạy cảm với kháng sinh có nghĩa nhiễm trùng vi khuẩn gây đáp ứng với điều trị kháng sinh thử nghiệm với liều lượng khuyếncáo - I (Intermediate) - Trung gian: Khái niệm trung gian hiểu hai tình huốngsau: + Khi áp dụng cho chủng vi khuẩn coi nhạy cảm trung bình với kháng sinh có nghĩa kháng sinh sử dụng cho điều trị với liều lượng cao để kháng sinh tập trung nhiều đến ổ nhiễm trùng độc tính thấp kháng sinh nên tương đối an toàn sử dụng liều cao + Khi áp dụng cho chủng vi khuẩn có độ nhạy cảm trung bình với kháng sinh có độc tính cao có nghĩa khơng thể sử dụng kháng sinh liều cao cho điều trị Trong trượng hợp này, phân loại trung gian hiểu ranh giới nhạy cảm đềkháng + R (Resistant) - Đề kháng: Vi khuẩn không đáp ứng với kháng sinh điều trị cho dù liều lượng hay vị trí ổ nhiễm trùng đâu Trang thiết bị, sinhphẩm - Tủấm, Máy trộn,lắc - Đĩa thạchMueller-Hinton - Khoanh giấy khángsinh - Độ đục chuẩn McFarland0,5 - Nước muối 0,9% vơtrùng - Tăm bơng (que gịn) vơtrùng - Đèn cồn, que cấy, panh, ốngnghiệm Các bước tiếnhành a Chuẩn bị môitrường Môi trường sử dụng làm thử nghiệm kháng sinh đồ cho vi khuẩn hiếu khí dễ ni cấy mơi trường thạch đĩa Muller-Hinton có độ dày 0,5 mm b Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn - Chủng vi khuẩn cần thử nghiệm phải giai đoạn phát triển mạnh (nuôi cấy sau 18-24 giờ) nên từ môi trường khơng có chất chọn lọc cấy thạch thường, thạchmáu…) - Chuẩn bị huyền dịch trực tiếp từ khuẩn lạc (khóm): Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ 3-5 khuẩn lạc (khóm) có hình thái giống nghiền vào ống nước muối sinh lý, lắc máy lắc để có huyền dịch đồng So sánh độ đục huyền dịch vi khuẩn với độ đục ống McFarland 0,5 Điều chỉnh thêm vi khuẩn thêm nước muối vào ống canh khuẩn cho ống canh khuẩn có độ đục tương đương với độ đục ống McFarland 0,5 Có thể dùng bìa trắng có đường kẻ ngang màu đen làm để so sánh độ đục Huyền dịch vi khuẩn sau pha, phải sử dụng vòng 15phút - Chuẩn bị huyền dịch từ canh khuẩn ni cấy: Có thể sử dụng canh khuẩn nuôi cấy để chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn Trong số trường hợp khuẩn lạc (khóm) khó hồ tan để có huyền dịch đồng hay khơng có khuẩn lạc (khóm) cấy 24 phương pháp lựa chọn thực Nhặt - khuẩn lạc (khóm) chuyển vào - ml canh thang nuôi cấy, ủ 35ºC có huyền dịch có độ đục tương ứng với độ đục McFarland 0,5 (thường sau - ni cấy) Có thể dùng nước muối sinh lý để hiệu chỉnh độ đục canh khuẩn ni cấy để có huyền dịch cầnthiết c Dàn vi khuẩn mặtthạch Dùng tăm bơng (que gịn) vơ trùng nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn pha trên, ép nhẹ xoay trịn tăm bơng (que gịn) thành bên ống huyền dịch vi khuẩn để loại bớt phần huyền dịch vi khuẩn thấm vào đầu tăm (que gịn) Sau đó, ria que tăm bơng (que gịn) toàn mặt đĩa thạch Mueller-Hinton, xoay đĩa thạch theo góc 60º ria que tăm bơng (que gịn) Cứ tiếp tục xoay đĩa góc 60º ria que tăm bơng (que gịn) để cho vi khuẩn dàn lên toàn bề mặt đĩa thạch Cuối cùng, ria tăm bơng (que gịn) vịng quanh bờ mép mặt thạch Đóng nắp đĩa thạch để đĩa thạch sau ria cấy vài phút nhiệt độ phòng cho mặt thạch se lại.) d Đặt khoanh giấy khángsinh - Có thể dùng panh kẹp đầu kim vô trùng để đặt khoanh giấy kháng sinh lênmặtthạch.Cáckhoanhgiấysaukhiđặtcầnđượcấnxuốngvừaphảiđểđảmbảochún g tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch Tối đa nên đặt khoanh giấy đĩa thạch đường kính 9-10 cm, 12 khoanh cho đĩa đường kính 15 cm Thơng thường, nên đặt khoanh cách cách gờ đĩa thạch 15 mm Trong vòng 15 phút sau đặt khoanh giấy kháng sinh, đĩa thạch phải lật úp để tủ ấm 35 ± 2ºC vòng 16-18 điều kiện khí trường bìnhthường Trong trường hợp làm kháng sinh đồ cho vi khuẩn không mọc môi trường Mueller-Hinton, cần sử dụng môi trường phù hợp với lồi vi khuẩn Ví dụ, mơi trường Mueller-Hinton có bổ sung 5% máu cừu cho Streptococci, môi trường Haemophilus Test Medium (HTM) cho Haemophilus hay mơi trường GC có chất bổ sung dùng cho Neisseria… Mặc dù ni cấy điều kiện khí trường có CO2 cần thiết cho số vi khuẩn khó ni cấy, song điều kiện khí trường khơng thích hợp cho kỹ thuật kháng sinh đồ cho hầu hết vi khuẩn khác Nuôi cấy điều kiện có CO2 làm giảm pH gây ảnh hưởng đến hoạt tính số khángsinh f Đọc nhận định kết Sau nuôi cấy qua đêm (16-18 giờ), kiểm tra đĩa thạch đọc kết vi khuẩn thử nghiệm mọc đồng mặt thạch, khuẩn lạc (khóm) mọc dày sát cạnh không chồng lên thành thảm dày khơng q thưa có khe khuẩn lạc (khóm) Vùng ức chế tạo có hình trịn Dùng thước kẻ có chia vạch đến mm thước kẹp đặt lên mặt đáy đĩa thạch, không mở nắp đĩa thạch, đo đường kính vùng ức chế hồn tồn (bao gồm đường kính khoanh giấy kháng sinh) tính theo mm Khi đó, nên đặt đĩa cách đen khoảng vài cm ánh sáng rọi Trong số trường hợp đặc biệt, cần lưu ý đo đường kính vùng ức chế như; (i) Khi mơi trường thử nghiệm kháng sinh đồ có thêm máu, mở đĩa đo đường kính vùng ức chế; (ii) Khi thử nghiệm Staphylococcus spp với oxacillin vancomycin, Enterococcus với vancomycin, cần ủ ấm đủ 24 giơ cao đĩa đọc ánh sáng xuyên để kiểm tra vùng vi khuẩn mọc yếu bên vùng ức chế Nếu nhìn thấy có vi khuẩn mọc bên vùng ức chế có nghĩa chủng vi khuẩn thử nghiệm đề kháng với oxacillin vancomycin; (iii) Khi thử nghiệm Staphylococcus spp với linezolid, đọc đĩa ánh sángxuyên Bờ vùng ức chế vùng ranh giới nơi mà nhìn mắt thường khơng thấy có vi khuẩn mọc Bỏ qua khuẩn lạc (khóm) mọc bé mà phải cần kính lúp phát bờ vùng ức chế Những khuẩn lạc (khóm) nhỏ mọc sát rìa vùng ức chế sóng lan chủng Proteus có xu hướng mọc lan khơng cần quan tâm Đo vùng ức chế rõ ràng Những khuẩn lạc (khóm) mọc bên vùng ức chế không bỏ qua Các khuẩn lạc (khóm) bị tạp nhiễm từ ngồi vào vi khuẩn thử nghiệm không nhất, quần thể biến chủng đề kháng kháng sinh Khi có khuẩn lạc (khóm) mọc vùng ức chế mà xác định tạp nhiễm, cần làm lại thử nghiệm với biến chủng đề kháng để có kết kháng sinh đồ theo biến chủng đề kháng Những chủng vi khuẩn phải làm thử nghiệm kháng sinh đồ thạch máu, nên bỏ nắp đĩa thạch để đo trực tiếp đường kính vùng ức chế mặt thạch Chú ý đo đường kính vùng ức chế khơng phải đường kính vùng tan máu (tiêu huyết) Với khoanh giấy sulfonamide cotrimoxazole, có tăng sinh nhẹ vi khuẩn vùng ức chế, tăng sinh nhẹ không cần quan tâm đến Khi chủng Staphylococci có khả sinh β-lactamase thử nghiệm với benzyl penicillin, dù vùng vô khuẩn có rõ ràng, bờ rõ phải đọc kết đề kháng Một số lồi Proteus tạo sóng vào vùng ức chế quanh số khoanh giấy kháng sinh vùng ức chế nhận biết rõ ràng có sóng mỏng nhẹ khơng cần quan tâmđến Đường kính vùng ức chế tính mm so sánh với giá trị điểm gãy tài liệu CLSI EUCAST để nhận định nhạy cảm (S), đề kháng trung gian (I) hay đề kháng (R) Các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng đến đường kính vùng ứcchế a Mật độ canh khuẩn Nếu canh khuẩn loãng làm vùng ức chế bị mở rộng Vi khuẩn nhạy cảm nhạy cảm đường kính vùng ức chế bị mở rộng chủng vi khuẩn đề kháng đọc kết chủng nhạy cảm Ngược lại, canh khuẩn đặc, vùng ức chế bị thu hẹp chủng nhạy cảm đọc kết chủng đề kháng Kết thích hợp canh khuẩn có mật độ vi khuẩn làm cho khuẩn lạc (khóm) mọc sát liền không chồng chéo lênnhau b Thời gian đặt khoanhgiấy Sau dàn vi khuẩn lên mặt đĩa thạch, để đĩa thạch nhiệt độ phòng thời gian dài thời gian qui định, có nhân lên vi khuẩn trước đặt khoanh giấy kháng sinh Như vậy, làm giảm đường kính vùng ức chế làm cho chủng nhạy cảm đọc kết chủng đề kháng c Nhiệt độ nuôicấy Thử nghiệm kháng sinh đồ thường ủ ấm 35 2ºC phát triển tối ưu vi khuẩn Nếu nhiệt độ thấp hơn, thời gian phát triển tốt vi khuẩn đòi hỏi phải dài làm cho đường kính vùng ức chế bị rộng Khi chủng thử nghiệm S aureus đề kháng không đồng thử nghiệm với methicillin (oxacillin), quần thể đề kháng phát nuôi cấy 35ºC Nếu ni cấy nhiệt độ cao hơn, tồn quần thể vi khuẩn bao gồm vi khuẩn đề kháng cho kết nhạy cảm Ở 35ºC nhiệt độ thấp hơn, khuẩn lạc (khóm) chủng đề kháng mọc bên vùng ức chế Những khuẩn lạc (khóm) chủng đề kháng quan sát dễ dàng đĩa thạch để ngồi nhiệt độ phịng vài trước đọc kết Các khuẩn lạc (khóm) ln ln nên kiểm tra lại để loại trừ khả khuẩn lạc (khóm) bộinhiễm d Thời gian nicấy Đối với kỹ thuật kháng sinh đồ, kết nên đọc sau 16-24 tuỳ theo loài vi khuẩn theo hướng dẫn CLSI EUCAST e Đường kính đĩa, độ dày thạch khoảng cách khoanhgiấy - Vùng ức chế bị mở rộng đĩa thạch mỏng, ngược lại đĩa thạch dày, vùng ức chế bị thu hẹp Nếu độ dày đĩa thạch thay đổi chút so với tiêu chuẩn kết kháng sinh đồ bị ảnh hưởng không đáng kể Độ dày đĩa thạch tiêu chuẩn - 0,5mm - Khoảng cách khoanh giấy đặt hợp lý để tránh vùng ức chế bị chồng chéo lên bị biến dạng vùng gần gờ đĩathạch f Hàm lượng khángsinh Đường kính vùng ức chế liên quan đến hàm lượng kháng sinh thấm khoanh giấy Nếu hàm lượng kháng sinh bị giảm bị phá hủy trình bảo quản, vùng ức chế bị thu nhỏ lại tương ứng với lượng kháng sinh bị thiếu hụt g Thành phần mơitrường - Mơi trường có ảnh hưởng đến đường kính vùng ức chế mơi trường có ảnh hưởng lên khả phát triển vi khuẩn, khả khuếch tán kháng sinh hoạt tính kháng sinh Do vậy, việc sử dụng môi trường thích hợp cho phương pháp làm kháng sinh đồ cầnthiết - Thử nghiệm chủng vi khuẩn cho thấy có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết kháng sinh đồ nên phương pháp khoanh giấy khếch tán cần chuẩn hóa Những thay đổi có liên quan đến yếu tố ảnh hưởng đến kết đưa đến thơng báo khơng xác cho bác sĩ lâmsàng - Độ xác độ phương pháp cần kiểm sốt chươngtrình kiểmsốtchấtlượng.Nhữngsailệchcầnđượcpháthiệnkịpthờivàhiệuchỉnhngay PHỤC LỤC QUY TRÌNH LÀM KHÁNG SINH ĐỒ MIC BẰNG MÁY VITEK I MỤC ĐÍCH Mơ tả cho nhân viên khoa Vi sinh quy trình làm kháng sinh đồ MIC tự động hệ thống VITEK 2- COMPACT II PHẠM VI ÁP DỤNG Quy trình áp dụng cho nhân viên khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh III TÀI LIỆU VIỆN DẪN - Manual of Operation for VITEC Compact Automatic Machine (xem Quy trình làm xét nghiệm định danh Kháng sinh đồ máy Vitek compact) - Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-first Informational Supplement This document provides updated tables for the Clinical and Laboratory Standards Institute antimicrobial susceptibility testing standards M02-A10 and M07-A8 January 2011 IV TRÁCH NHIỆM - Nhân viên xét nghiệm khoa Vi Sinh- Bệnh viện Đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực theo quy trình - Người thực hiện: cán xét nghiệm đào tạo có chứng chứng nhận chuyên nghành Vi Sinh, làm việc khoa Vi Sinh- Bệnh viện Đa khoa tỉnh Quảng Ninh V ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT Giải thích thuật ngữ - Không áp dụng Từ viết tắt SOP = Quy trình chuẩn (Standard of Procedure) KXN = Khoa Xét nghiệm ATSH = An toàn sinh học MIC = Minimum Inhibitory Concentration = Nồng độ ức chế tối thiểu VI NGUYÊN LÝ Mỗi thẻ kháng sinh đồ gồm 64 giếng Một giếng chứng chứa mơi trường ni cấy có tất thẻ, giếng lại chứa kháng sinh khác với nồng độ khác xác định trước môi trường nuôi cấy Vi khuẩn pha loãng 3ml nước muối 0.45% với nồng độ phù hợp cho loại, sau máy hút vào thẻ xét nghiệm để hòa tan kháng sinh thẻ Máy giám sát phát triển bên giếng thẻ xét nghiệm Bộ phận quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để đánh giá trực tiếp phát triển vi sinh vật Bộ phận quang học dựa đọc ánh sáng ban đầu giếng trước bắt đầu có phát triển Máy đọc 15 phút/ lần để đo phát triển vi khuẩn giếng Phần mềm so sánh kết thu với sở liệu để đưa kết giá trị MIC cho kháng sinh có thẻ VII TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ Thiết bị Tủ an toàn sinh học Máy định danh VITEK2- COMPACT Biomerieux hệ thống máy tinh, máy in, lưu điện kèm Máy đo độ đục Vitek Tủ ấm Dụng cụ Dispencer (dụng cụ bơm dung dịch nước muối 0,45%) Ống tube định danh 5ml Cassette có dán mã Pipet Đèn cồn, que cấy Hóa chất, thuốc thử Mơi trường ni cấy Card làm kháng sinh đồ gồm: card AST GN 86 (vi khuẩn Gram âm) card AST GP 67 (vi khuẩn Gram dương) Dung dịch nước muối 0,45% VIII NỘI DUNG Nuôi cấy - Các bệnh phẩm nuôi cấy mơi trường thích hợp, ủ 37°C/ 18-24h 12-48h - Đọc bệnh phẩm, chọn vi khuẩn muốn định danh cấy sang đĩa môi trường khác theo loại card quy định, sau ủ 37°C/ 18-24h 12-48h (Nếu vi khuẩn mọc thuẩn bỏ qua bước này) Định danh - Nhuộm soi khuẩn lạc định danh vi sinh vật trước song song với xét nghiệm kháng sinh đồ MIC - Quy trình định danh chi tiết thực theo VS.QTKT.NC.21 Kháng sinh đồ - Chuẩn bị + Chủng vi sinh vật cần định danh theo yêu cầu môi trường điều kiện ủ + Chuẩn bị Worksheet cho cassette (Điền thông tin cần biết bệnh nhân tên, lab ID…): Vào “enter casette manager” – chọn “setup tests post entry” – chọn Print – chọn “Bank cassette worksheet” – nhấn “OK” để in; + Chuẩn bị Card: để card nhiệt độ phòng khoảng 30 phút; - Pha huyền dịch tube định danh: ▪ Lấy ống nghiệm vơ trùng kích thước 12 x 0.75 cm (chú ý: không chạm tay vào miệng ống nghiệm) đặt khay cassette ▪ Dùng dispenser hút 3ml nước muối 0.45% vào ống nghiệm ▪ Kiểm tra máy đo độ chuẩn máy theo hướng dẫn sử dụng máy DENSICHEK PLUS sau chuẩn nước muối ▪ Sử dụng ăng cấy vô trùng lấy khuẩn lạc phân lập, nghiền kỹ thành ống, trộn đưa vào máy đo đô độ đục DENSICHEK PLUS: đạt nồng độ 0.5 – 0.63 McF (card GN GP), nồng độ 2,70 – 3,30 McF (card NH ANC), nồng độ 1,80 – 2,20 McF (card YST) - Pha huyền dịch tube kháng sinh đồ: lấy ống tube thứ hút 3ml nước muối, chuyển 145µl huyền dịch tube định danh vào (kháng sinh đồ Gram âm) 280µl (kháng sinh đồ Gram dương, nấm) (AST-GP, AST-ST, AST-P) Đặt thẻ định danh vào ống tube kháng sinh đồ - Chạy máy: Nếu máy sẵn sàng (màn hình Start Fill OK): mở cửa buồng hút, cho cassette vào nhấn Start Fill Khi đèn báo nhấp nháy (sau khoảng phút), hình báo “Tranfer” mở cửa buồng hút lấy cassette mở buồng vận hành cho cassette vào Đóng hai cửa đợi Nhập thông tin cassette: Nếu bệnh phẩm bệnh nhân chọn tất hang vào Difine Isolate để nhập thông tin: ID lab, số vi khuẩn Vào Bench name để chọn tên người thực Nhấn Save cassette data để xác nhận Nếu làm riêng cạc kháng sinh đồ phải chọn tên vi khuẩn cho cạc kháng sinh đồ Nhập thơng tin bệnh nhân: Vào “View and Maintain Patient Information” (Biểu tượng hình người) Vào Add patient để thêm bệnh nhân Nhập thơng tin có dấu * đỏ (bắt buộc) Nhấn save để xác nhận IX DIỄN GIẢI KẾT QUẢ - Dữ liệu tự động ghi vào phần mềm máy tính Phần mềm phân tích kết quả, đưa giá trị MIC phiên giải kết quả: S (nhạy), I (trung gian), R (kháng) cho kháng sinh có thẻ - Phần mềm suy luận đưa kết S, I, R cho kháng sinh khơng có thẻ - Phần mềm phân tích đưa độ tin cậy kết kháng sinh đồ, hiển thị màu sắc: xanh, vàng, đỏ, tím + Màu xanh (Mức độ tin cậy chắn): phenotype đưa không làm thay đổi giá trị MIC, thay đổi phiên giải kết cho điều trị + Màu vàng (mức độ tin cậy chắn với hiệu chỉnh): Các phenotype đưa có thay đổi giá trị MIC thay đổi giá trị thử nghiệm (ví dụ: beta lactamase, ESBL, …) phân tích phần mềm Có thể thay đổi phiên giải kết cho điều trị + Màu đỏ (mức độ tin cậy không chắn): Các phenotype đưa Các kết kháng sinh không phù hợp với sở liệu phần mềm Không sử dụng kết kháng sinh đồ có màu đỏ + Màu tím (chưa có sở liệu, phần mềm khơng thực phân tích): Các phenotype đưa Các phenotype cho sinh vật xét nghiệm không mô tả sở liệu phần mềm X KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG - Kiểm tra QC chủng chuẩn E coli ATCC 25922 các kháng sinh đồ gram âm S aureus ATCC 29213 cạc kháng sinh đồ gram dương - So sánh với phương pháp khoanh giấy khuếch tán để tham chiếu Lưu ý: - Thiết bị sử dụng cho chẩn đoán in vitro - Không sử dụng thẻ xét nghiệm hết hạn sử dụng bao bì sản phẩm tráng nhôm chứa thẻ bị rách - Để thẻ xét nghiệm đóng gói cân nhiệt độ phịng trước xét nghiệm - Khơng sử dụng găng tay có bột bột gây ảnh hưởng đến đọc quang - Sử dụng môi trường nuôi cấy, điều kiện ủ, thời gian nuôi cấy khuẩn lạc theo khuyến cáo nhà sản xuất - Khuẩn lạc định danh phải - Thực nhuộm Gram trước xét nghiệm để xác định nhóm vi khuẩn hình thái trước lựa chọn thẻ định danh - Thời gian chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn trước cho vào máy tối đa 30 phút - Dispenser phân phối nước muối khử khuẩn định kỳ đảm bảo vơ khuẩn: tuần/lần có nghi ngờ để tránh nhiễm chai nước muối gây ảnh hưởng đến kết - Thời gian chuyển từ buồng hút sang buồng vận hành kỹ thuật: tối đa 10 phút Nếu khơng chuyển thời gian cho phép phải hủy thẻ xét nghiệm ảnh hưởng đến kết - Khơng mở cửa buồng vận hành chưa có tín hiệu cho phép Nếu tự ý mở cửa máy báo lỗi dừng hoạt động XI AN TOÀN - Thực bảo hộ cá nhân đầy đủ tiếp xúc với chủng vi khuẩn - Các bước phải tiến hành tủ ATSH - Phòng tránh lây nhiễm chéo XII HỒ SƠ LƯU - Sổ đọc bệnh phẩm - Sổ lưu kết nuôi cấy - Sổ nội kiểm vitek PHỤ LỤC TIÊU CHUẨN CHẨN ĐOÁN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG HÔ HẤP DƯỚI ➢ Tiêu chuẩn chẩn đoán P.aeruginosa: - Trực khuẩn Gram âm - Khuẩn lạc dạng S, R M, sinh sắc tố xanh môi trường nuôi cấy, mùi thơm đặc trưng, gây tan máu β cấy thạch máu - Oxy hóa đường glucose: OF(+); khơng lên men đường lactose - Oxidase (+) - Citrate Simon (+), Catalase (+), Urease (-), indol (-), H2S (-), Di động (+), RM (-), VP (-) ➢ Tiêu chuẩn chẩn đoán Trực khuẩn đường ruột (Enterobacteriace) − Trực khuẩn Gram âm − Vi khuẩn phát triển tốt loại thạch ni cấy thơng thường, khuẩn lạc đục có dạng S M − Oxidase (-) − Chạy tính chất sinh vật hóa học đọc kết theo phần mềm ➢ Tiêu chuẩn chẩn đoán S.aureus: − Cầu khuẩn Gram dương xếp đám; − Khuẩn lạc dạng S, tan máu β, sắc tố màu vàng − Catalase (+) − Coagulase (+) − Chapman (+) ➢ Tiêu chuẩn chẩn đốn Acinetobacter: − Cầu trực khuẩn Gram âm xếp đơi xếp hình mạng lưới; − Khuẩn lạc dạng S, M (ướt, bóng, nhày) − Oxi hóa đường glucose, lên men đường lactose − Oxidase (-) − Citrat Simon (+), Catalase (+), Urease (-), indol (-), Di động (-), RM (-), VP (-) ➢ Tiêu chuẩn chẩn đoán Phế cầu (Streptococus pneumoniae): − Cầu khuẩn Gram dương xếp đôi chuỗi ngắn; − Vi khuẩn phát triển tốt thạch máu: Tạo khuẩn lạc dạng S, có chóp, màu xám nhạt, xung quanh có vịng tan máu α; sau 24h khuẩn lạc trở nên dẹp, phần đỉnh bị lõm xuống (do tác dụng enzym autolysin); − Catalase (-) − Optochin (+), Bacitracin (-) − Thử nghiệm Neufleld (+) (Vi khuẩn bị ki giải bới muối mật) − Thử nghiệm Quellung (+) ... tiêu: Xác định tỷ lệ loại vi khuẩn gây nhiễm khuẩn đường hô hấp phân lập từ Bệnh vi? ??n Hữu Nghị Vi? ??t Tiệp Hải Phòng năm 2020 – 2021 Đánh giá mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập... cảm kháng sinh số vi khuẩn phân lập 40 Chương 4: BÀN LUẬN 45 4.1 Tỷ lệ loại vi khuẩn gây nhiễm khuẩn đường hô hấp phân lập từ Bệnh vi? ??n Hữu Nghị Vi? ??t Tiệp Hải Phòng năm 2020 – 2021. .. đường hô hấp 9.153 mẫu máu) từ bệnh nhân nhiễm khuẩn đường hơ hấp phân tích tỷ lệ mầm bệnh độ nhạy với kháng sinh P.aeruginosacủa bệnh nhân nhiễm khuẩn đường hô hấp nhạy cảm cao (> 70%) với kháng