2. Tình hình nghiên cứu về NKHH dưới trong thời gian gần đây
2.2.1. Họ vikhuẩn đường ruột
❖ Enterobacter sp
Trong số các loài thuộc giống Enterobacter đã biết, 2 loài E.cloacae và
E.aerogenes được biết đến nhiều nhất, trong đó E.cloacae được chọn là đại
biểu điển hình của giống này. Enterobacter sp bình thường sống ở đường tiêu hóa, ngoài da và ngoại cảnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi chúng có thể gây nên NKHH, nhiễm khuẩn huyết hay nhiễm khuẩn tiết niệu. Hiện nay
Enterobactersp kháng khá cao với các KS thông thường như các KS thuộc
nhóm β-lactam, Aminoglycosid và Fluoroquinolon. Theo tác giả Lê Thị Kim Nhung nghiên cứu tại Bệnh viện Thống Nhất (năm 2011)cho thấy:
Enterobacter sp kháng mạnh các Cephalosporin thế hệ 3, tuy nhiên còn tương
đối nhạy cảm với Imipenem, Meropenem, Piperacillin-tazobactam và Netromicin. Chúng cũng là 2 VK sinh men ESBLs, nếu gia tăng sử dụng các Cephalosporin cũng sẽ làm gia tăng đề kháng cảm ứng [55].
❖ Klebsiella sp
Klebsiella là trực khuẩn Gram âm gây bệnh cơ hội, đại diện điển hình
của giống Klebsiellalà loài K.pneumoniae.K.pneumoniae là căn nguyên
thường gặp trong các nhiễm trùng đường hô hấp dưới như viêm phổi, viêm phế quản phổi thứ phát sau cúm, sau sởi, sau ho gà hoặc ở các bệnh nhân đang hồi sức hô hấp. Khi nghiên cứu về tình trạng viêm phổi bệnh viện tại khoa hồi sức tích cực chống độc Bệnh viện nhân dân Gia Định (năm 2012) tác giả Huỳnh Văn Ân cho thấy các tác nhân gây viêm phổi Bệnh viện chính là
K.pneumoniae (36%), sau đó là Acinetobacter sp (32%) và Pseudomonas
(10%) [56]. Cũng như những VK khác trong họ đường ruột, Klebsiella sp đề kháng khá cao với ngoại cảnh và các KS thông thường như: KS thuộc nhóm β-lactam, Aminoglycosid và Quinolon. Tình trạng xuất hiện nhiều chủng
Klebsiella sp sinh ESBL đang là vấn đề rất được quan tâm hiện nay.
Đánh giá tình hình đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện tại Bệnh viện Nhi đồng 1 trên 158 ca bệnh ở 2 khoa hồi sức và hô hấp tác giả Nguyễn Thị Mỹ Linh năm 2011 cho thấy vi khuẩn phân lập được chủ yếu vi khuẩn gram âm (84%), trong đó có Klebsiella (27,5%).
Nhóm vi khuẩn gram dương đề kháng với nhiều kháng sinh, chỉ còn nhạy cảm với Rifamycin và Vancomycin. Nhóm vi khuẩn gram âm đề kháng cao
hầu hết nhóm kháng sinh β-lactam, ngoại trừ Ceftazidim, Timentine, Imipenem và Polymycin B[57].
❖ Kluyvera sp
Kluyvera là một VK mới trong họ VK đường ruột. Chúng là những VK
gây bệnh cơ hội thường gặp ở người, được tìm thấy trong nước, chất thải trong môi trường, bồn rửa bệnh viện và thực phẩm nguồn gốc động vật hay cũng có thể được phân lập từ nhiều mẫu bệnh phẩm khác nhau như đờm, nước tiểu, phân, dịch họng và máu. Có bốn loài Kluyvera đã được xác định
cho đến thời điểm hiện tại nhưng chỉ có 3 loại (K.ascorbata, K.cryocrescens,
K.georgiana) gây bệnh nhiễm trùng ở người và phổ biến nhất trong số này là K.ascorbata[58], [59]. Hầu hết các bệnh nhiễm trùng liên quan đến đường
tiêu hóa hoặc đường tiết niệu và các mô mềm.Các KS sử dụng được cho hầu hết các chủng Kluyvera sp bao gồm Cephalosporin thế hệ thứ ba, Fluoroquinolon, Aminoglycosid và Cabapenems. Tuy được phát hiện muộn hơn so với các VK đường ruột khác, nhưng đã bắt đầu xuất hiện những chủng
Kluyvera sp kháng lại KS thế hệ đầu như Ampicillin, Penicillin phổ rộng, Cephalosporin thế hệ thứ nhất và thế hệ thứ hai. Nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệKluyvera sp kháng Ampicillin và các Cephalosporin thế hệ đầu tiên và thứ hai là khoảng 50% [60].
❖ Ecoli
Vi khuẩn e coli (Escherichia coli) thuộc dòng vi khuẩn gram âm và thường sinh sôi phát triển trong đường ruột của con người và động vật. Phần lớn các loại vi khuẩn e coli thường gây hiện tượng tiêu chảy thoáng qua và tạm thời, tuy nhiên cũng có những loài đặc biệt có thể khiến người bệnh bị các biến chứng khác như nhiễm trùng đường ruột, sốt và đau bụng, hoặc viêm màng não, nhiễm khuẩn đường tiểu.Hiện này, vi khuẩn E.coli có rất nhiều dòng, nhưng dòng kháng kháng sinh là H30-Rx. Theo như nghiên cứu gần
đây của các nhà khoa học cho thấy, dòng vi khuẩn E.coli kháng kháng sinh này có khả năng lan từ nhiễm khuẩn đường niệu sang máu và gây ra nhiễm khuẩn huyết- một biến chứng cực kỳ nghiêm trọng đe dọa đến tính mạng của người mắc.
Vi khuẩn E.coli bình thường kháng kháng sinh thế hệ thứ 3 như: ceftriaxone, cefuroxime…đôi khi cũng có trường hợp kháng cả nhóm kháng sinh carbapenem - loại kháng sinh mạnh nhất hiện nay. Đối với siêu vi khuẩn E.coli H30- Rx được cho là kháng hầu hết tất cả các loại kháng sinh thông dụng vẫn thường được sử dụng để điều trị các ca nhiễm khuẩn thông thường.
Nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Điền nhằm khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Nguyễn Đình Chiểu, tỉnh Bến Tre cho thấy: có 214 chủng được phân lập và trong đó có Escherichia coli. 95 chủng được xác định là vi khuẩn sinh ESBL chiếm 44,4%, trong đó chủng Escherichia coli chiếm 56,8%. Các chủng vi khuẩn sinh ESBL này có tỉ lệ đề kháng cao ở nhiều loại kháng sinh, đạt ngưỡng cao nhất là kháng 100% với các loại kháng sinh như Ampicillin, Piperacillin, Cefuroxime, Cefuroxime Axetil, Cefpodoxime, Cefotaxime, Ceftazidime. Trong khi đó Tygecycline và các khoáng sinh nhóm Carbapenem như Ertapenem, Imipenem và Meropenem vẫn còn nhạy đối với các chủng này [61].
1.2.2.2. Pseudomonas aeruginosa
P.aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh) là loại VK gây bệnh có điều kiện,
là trực khuẩn Gram âm hiếu khí, thuộc giống vi khuẩn P.seudomonas, có
dạng hình que nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc có khi xếp thành chuỗi và có khả năng di động bằng một hoặc nhiều lông ở một đầu[62].
Khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch (tự nhiên hoặc mắc phải), bị nhiễm các bệnh ác tính hoặc mạn tính, dùng lâu dài corticoid, KS hoặc các chất
chống ung thư thì dễ mắc các bệnh nhiễm trùng nội sinh hoặc ngoại sinh do
P.aeruginosa[63].
P.aeruginosathường tồn tại nhiều trong môi trường bệnh viện, chúng
có thể được tìm thấy trong các dụng cụ y tế, sàn nhà, tường, giường bệnh và có thể có trên tay của các cán bộ y tế. Từ đó, vi khuẩn dễ lây lan, xâm nhập vào bệnh nhân và gây bệnh, đặc biệt là những bệnh nhân bệnh nhân mắc các bệnh lý ác tính, giảm bạch cầu, bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch, bị bỏng hoặc dùng các loại thuốc ức chế miễn dịch kéo dài [62].
Trong cơ thể người, P.aeruginosatạo ra một lớp chất nhờn chống lại
thực bào và hầu hết các loại thuốc kháng sinh.Nhiều nghiên cứu trong nước và nước ngoài đều đi đến thống nhất trực khuẩn Gram âm là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm trùng cơ hội và loài thường gặp nhất là P.aeruginosa. Nghiên cứu cắt ngang của tác giả Bùi Quang Hiền năm 2020 trên 196 kết quả kháng sinh đồ tìm thấy tác nhân gây bệnh là P. aeruginosa, và trên 35 người bệnh được chẩn đoán VPBV do P. aeruginosa, cho thấy P. aeruginosa gây chủ yếu các nhiễm khuẩn hô hấp (43,9%). Tỷ lệ nhạy cảm của P. aeruginos có sự
khác biệt đối với các kháng sinh: 70,7% đối với Piperacillin-Tazobactam, 66,8% - Ceftazidim, 67,3% - Imipenem, 67,0% - Meropenem, 77,7% - Amikacin, 62% - Ciprofloxacin, 60,5% - Levofloxacin, 100% - Colistin[64].
Tác giả Nguyễn Ngọc Lân khảo sát sự phân bố của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp và sự đề kháng sinh của chúng trong bệnh phẩm đàm và dịch rửa phế quản tại BV. Đại Học Y Dược TP. HCM năm 2018 cho thấy
P.seudomonasspp. (trong đó P.aeruginosachiếm đến 95,4%): có tỷ lệ đề
kháng cao với Imipenem(64,3%), Levofloxacin (63,3%), Netilmicin (50,2%); đề kháng dưới 50% với Doripenem (43,0%), Ceftazidime (39,3%), Cefepime (35,0%), Cefoperazone/Sulbactam (30,1%),Amikacin (23.83%); và
sinh chọn lựa kết hợp trong trường hợp nhiễm P. aeruginosa trong bệnh
viện[65].
Trong nghiên cứu cắt ngang của tác giả Nan Duan và Jialin Du năm 2020 trên 4.161 mẫu nuôi cấy dương tính trong số 18.798 mẫu bệnh phẩm khác nhau (9.645 mẫu đường hô hấp và 9.153 mẫu máu) từ bệnh nhân nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới được phân tích tỷ lệ mầm bệnh và độ nhạy với kháng sinh. P.aeruginosacủa bệnh nhân nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới vẫn nhạy cảm cao (> 70%) với kháng sinh thường quy tại khoa nhi. Tuy nhiên, nó chỉ có tính nhạy cảm cao với Amikacin, Tobramycin, Gentamicin ở cả khoa hô hấp người lớn và khoa hồi sứu và độ nhạy với kháng sinh của nó với Meropenem và Imipenem ở mức trung bình ở khoa hô hấp người lớn và nhẹ (<30%) trong RICU[66].
1.2.2.3. Acinetobacter sp
Acinetobacter sp là những cầu trực khuẩn Gram âm, rất dễ nhầm lẫn
với các VK thuộc giống Neisseria. Chúng có thể được tìm thấy ở đất, nước,
môi trường ẩm ướt trong Bệnh viện, trên dụng cụ y tế đã qua sử dụng... Hiện nay Acinetobacter sp được xem là VK hàng đầu gây viêm phổi Bệnh viện tại các Bệnh viện lớn trong nước.Tình trạng Acinetobacter sp đa kháng thuốc
đang là vấn đề đáng được quan tâm hiện nay. Các nghiên cứu cho thấy các kháng sinh như Ceftazidime, Ciprofloxacine, Piperacillin-Tazobactam, Ticarcillin-Clavulanic đều bị kháng từ 36% đến 86% [9]. Chính sự lạm dụng bừa bãi KS trong thời gian gần đây đã làm tăng tỷ lệ các chủng Acinetobacter
sp đa kháng, khiến cho việc điều trị gặp rất nhiều khó khăn.
1.2.2.4. Staphylococcus aureus
Tụ cầu vàng có tên khoa học là Staphylococcus aureus (MRSA) kháng Methicillin là do một loại vi khuẩn tụ cầu kháng với nhiều loại kháng sinh được sử dụng để điều trị nhiễm trùng tụ cầu khuẩn thông thường.
Hầu hết các trường hợp nhiễm khuẩn do tụ cầu vàngthường xảy ra với những người ở bệnh viện dài ngày hoặc ở các cơ sở chăm sóc sức khỏe khác như viện dưỡng lão, trung tâm lọc máu,... Ngoài ra nhiễm khuẩn tụ cầu vàng còn xảy ra do liên quan đến các thủ thuật hoặc các thiết bị xâm lấn như phẫu thuật, ống tiêm tĩnh mạch hoặc khớp nhân tạo.
Sự đề KKS của S.aureus cũng là một vấn đề rất đáng lưu ý, trong đó S.aureus kháng lại Methicillin đã và đang là vấn đề rất được quan tâm hiện
nay.Tỉ lệ kháng kháng sinh của S. aureus khác nhau giữa các bệnh viện và giữa các kháng sinh xét nghiệm.Có tới 68,8% các chủng phân lập tại bệnh viện Chợ Rẫy kháng với Gentamicin. Tỉ lệ kháng Oxacillin cao nhất tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế với 63,8%. Theo báo cáo của Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2008, có 8% sốchủng S. aureus phân lập được đề kháng với Vancomycin.Tuy nhiên, đến năm 2009, phần lớn các bệnh viện kể cả Chợ Rẫy không có chủng S. aureus nào đề kháng với Vancomycin trừ một số bệnh viện tỉnh và bệnh viện trực thuộc Sở y tế cho kết quả đáng nghi ngờ về tỉ lệ khángVancomycincủatụcầuvàng ví dụ như 60,9% S. aureus kháng Vancomycin tại Bệnh viện Việt Nam Thụy Điển, Uông Bí, 24,1% tại Bệnh viện Bình Định và 15,6% tại Bệnh viện Xanh Pôn. Các kết quả này cho thấy cần nâng cao công tác kiểm soát chất lượng xét nghiệm, bao gồm các xét nghiệm khẳng định với các chủng kháng quan trọng này bằng các phương pháp khác[67].
Tác giả Nan Duan năm 2020 cũng cho thấy S. aureus được phân lập từ bệnh nhân nhiễm khuẩn hô hấp dưới rất nhạy cảm với Linezolid, Daptomycin, Teicoplanin, Vancomycin, Tigecycline, Rifampicin và Trimethoprim/Sulfamethoxazole ở cả ba khu vực, nhạy cảm vừa phải với Gentamicin ở cả khoa hô hấp người lớn và khoa hồi sức và chỉ với Clindamycin, Oxacillin, Moxif khoa hô hấp của người lớn[66].
2.3. Các Phương pháp chẩn đoán vi khuẩn gây NKHH dưới 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy định danh vi khuẩn gây bệnh
❖ Cấy phân vùng
- Dán nhãn thông tin bệnh phẩm, ngày nuôi cấy.
- Đốt que cấy: Cầm que cấy thẳng đứng, đốt đầu que cấy ở nửa trên ngọn lửa đèn cồn, khi đầu que cấy đỏ, cầm ngang để khử trùng phần thân kim loại, để nguội que cấy.
- Lấy vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy: Dùng que cấy vô trùng lấy bệnh phẩm hoặc dùng pipet Pasteur nhỏ một giọt bệnh phẩm vào phần rìa của đĩa môi trường nuôi cấy dàn tạo vùng có diện tích khoảng 1 cm2 . Nếu lấy bệnh phẩm bằng tăm bông (que gòn), lăn đầu tăm bông (que gòn) lên môi trường tạo vùng nguyên ủy diện tích khoảng 1cm2 .
- Tạo vùng thứ nhất: dùng que cấy đã tiệt trùng ria qua vùng nguyên ủy, tạo thành vùng có diện tích khoảng ¼ diện tích đĩa thạch.
- Tạo vùng thứ 2: Đốt que cấy để tiệt trùng, xoay đĩa 90 ria để tạo vùng thứ 2. Đường ria đầu tiên cắt vào một đầu của đường ria cuối của vùng ria thứ nhất. Diện tích vùng ria thứ 2 chiếm khoảng 1/4 diện tích đĩa thạch, các đường ria sau không được phép chạm vào vùng ria thứ nhất nữa.
- Tạo vùng ria thứ 3: Đốt que cấy để tiệt trùng, xoay đĩa 90 ria tạo vùng thứ 3, cách làm tương tự như tạo vùng thứ 2. Diện tích vùng thứ 3 bằng khoảng 1/4 diện tích đĩa thạch.
- Tạo vùng ria thứ 4: Không cần đốt que cấy, xoay đĩa 90 ria tạo vùng thứ 4, cách làm tương tự như tạo vùng thứ 2 và thứ 3. Diện tích vùng thứ 4 bằng khoảng 1/4 diện tích đĩa thạch.
- Đốt khử trùng que cấy.
- Cho vào tủ ấm, ủ qua đêm. Kỹ thuật cấy phân vùng trên đĩa môi trường Các đường cấy sát vào nhau càng tận dụng được diện tích thạch để tạo thuận lợi cho các vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc (khóm) riêng rẽ.
❖ Cấy đếm
- Pha huyền dịch hoặc bệnh phẩm thành các nồng độ khác nhau 10-1 , 10-2 , … trộn đều.
+ Dùng que cấy.
+ Dùng que cấy 1 µl hoặc 10 µl đã tiệt trùng lấy bệnh phẩm: để que cấy thẳng đứng, chỉ nhúng đầu que cấy xuống canh khuẩn, lấy 1 ăng bệnh phẩm ria một đường thẳng ở giữa đĩa thạch tạo đường nguyên ủy.
+ Không đốt que cấy, tiếp tục dàn đều vi khuẩn ra toàn bộ đĩa thạch, các đường ria đi qua đường nguyên ủy.
+ Để tủ ấm ở điều kiện thích hợp.
- Cấy đếm bằng thanh gạt và bàn xoay.
+ Nhúng thanh gạt trong dung dịch ethanol 95%: ngập phần cong và phía dưới của phần đứng. Hơ qua ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. 36
+ Đặt đĩa thạch lên bàn xoay.
+ Dùng pipet chỉnh thể tích, hút một lượng bệnh phẩm hoặc canh khuẩn nhỏ vào trung tâm của đĩa thạch.
+ Bật nút bàn xoay. Dùng thanh gạt chạm nhẹ vào đĩa thạch, dàn đều. + Khử trung thanh gạt bằng cách nhúng vào cồn 95% và hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
+ Cho vào tủ ấm, ủ qua đêm.
+ Đếm số lượng khuẩn lạc (khóm) mọc trên đĩa thạch, tính số lượng vi khuẩn có trong bệnh phẩm (canh khuẩn).
❖ Cấy chuyển
- Lấy khuẩn lạc (khóm):
+ Với khuẩn lạc (khóm) trên đĩa thạch: Dùng tay trái mở đĩa nuôi cấy một khoảng đủ để thao tác, dùng que cấy chạm vào chóp 1 khuẩn lạc (khóm) mọc riêng rẽ, rút que cấy ra, đậy nắp đĩa lại, giữ que cấy bằng tay phải.
+ Với khuẩn lạc (khóm) trên ống thạch nghiêng: Mở nắp ống, hơ miệng ống gần ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy lấy vi khuẩn mọc trên bề mặt thạch nghiêng, đậy nắp ống, giữ que cấy bằng tay phải.
- Cấy chuyển từ đĩa thạch hoặc ống thạch nghiêng sang đĩa thạch mới (dùng kỹ thuật cấy phân vùng).
- Lấy đĩa môi trường mới (đĩa cấy chuyển), mở một khoảng vừa đủ để thao tác, giữ que cấy song song với mặt thạch, ria vùng 1 (3-5 đường). Đốt que cấy và để nguội tự nhiên (Xem hình minh họa).
- Mở đĩa cấy chuyển, ria vùng 2 từ vùng 1, ria khoảng 3-5 đường. Đốt que cấy và để nguội tự nhiên.
- Mở đĩa cấy chuyển, ria vùng 3 từ vùng 2, ria khoảng 3-5 đường. - Đốt que cấy và để nguội tự nhiên.
- Mở đĩa cấy chuyển, ria vùng 4 từ vùng 3, ria khoảng 3-5 đường, tránh chạm vào vùng 1.
- Đậy đĩa cấy chuyển, đốt que cấy và để đĩa vào tủ ấm trong điều kiện phù hợp.
2.3.2. Phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử (PCR)
Xét nghiệm sinh học phân tử giúp phát hiện các tác nhân khó hoặc không thể nuôi cấy thường quy: như các VK (Chlamydia, Legionella,
Mycoplasma, Treponema pallidum). Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại
vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm hoặc đã bị điều trị kháng sinh trước đó. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các bệnh nhân được chẩn đoán NKHH dưới (Viêm phế quản, Viêm phế quản phổi, Viêm phổi, …) tại Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp Hải Phòng có kết quả nuôi cấy vi khuẩn và làm KSĐ tại Khoa xét nghiệm Vi sinh trong thời gian nghiên cứutừ tháng 01/2020 đến tháng 9/2021.
Tiêu chuẩn chọn:
- BN được chẩn đoán trên lâm sàng là NKHH dưới tại Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp Hải Phòng trong thời gian từ tháng 01/2020 đến tháng 9/2021
- Có kết quả nuôi cấy vi khuẩn và làm KSĐ
- Các kết quả định danh vi khuẩn rõ ràng và kháng sinh được thử nghiệm đúng theo hướng dẫn và thông tin được lưu trữ đầy đủ tại khoa Vi