Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Bộ môn Bệnh cây – Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Viện Di truyền nông nghiệp
- Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam
Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 3/2017 đến tháng 3/2018.
Vật liệu nghiên cứu
3.3.1 Thu thập mẫu, cây thí nghiệm
- Nguồn nấm gây bệnh được phân lập từ nấm bệnh đốm nâu thanh long
Nấm đối kháng Trichoderma asperellum và Trichoderma harzianum được cung cấp bởi Bộ môn Bệnh cây thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trong khi nấm đối kháng Chaetomium sp được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới của cùng Học viện.
3.3.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
- Nồi hấp, tủ lạnh, buồng cấy nấm, kính hiển vi, cân điện tử, giá nuôi cấy nấm, xoong, tủ sấy
Các dụng cụ nhỏ cần thiết cho thí nghiệm bao gồm: cân kỹ thuật, bình đựng nước, bình tam giác, đũa thủy tinh, bếp điện, vải màn lọc, hộp lồng petri và que cấy nấm Ngoài ra, các dụng cụ khác như đèn cồn, khay đựng, giấy ẩm, dao, kéo, panh, chậu nhựa, kính lúp, túi lấy mẫu các loại, giấy bạc và màng bọc thực phẩm cũng rất quan trọng trong quá trình thực hiện thí nghiệm.
- Agar, đường glucose, sucrose, khoai tây, cà rốt, nước cất vô trùng,
- Dung môi tách chiết hoạt chất sinh học:
+ Dung môi: Ethyl acetate (EtOAc)
+ Dung môi: n – Butanol và một số dung môi khác.
Nội dung nghiên cứu
Nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum được phân lập và nuôi cấy trên các môi trường PDA, WA, PCA, từ đó tiến hành quan sát đặc điểm hình thái như tản nấm và sợi nấm, cùng với những đặc điểm sinh học của loại nấm này.
- Nghiên cứu đặc tính sinh học nấm đối kháng Trichoderma asperellum, Trichoderma harzianum và Chaetomium sp đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum
Thử nghiệm hiệu lực ức chế của nấm Trichoderma và Chaetomium sp đối với nấm gây bệnh đốm nâu thanh long Neoscytalidium dimidiatum
Nghiên cứu quy trình tách chiết và lựa chọn dung môi là bước quan trọng để thu nhận các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm Việc tối ưu hóa quy trình tách chiết không chỉ giúp nâng cao hiệu suất thu hồi mà còn đảm bảo chất lượng của các hoạt chất, góp phần vào việc phát triển các sản phẩm từ nấm có giá trị cao.
- Nghiên cứu đánh giá hiệu lực sinh học của các hợp chất sinh học thu được từ nấm đối kháng Chaetomium sp và Trichoderma đối với nấm
Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh trên cây thanh long.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
* Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Đĩa petri, ống đong, ống nghiệm, bình tam giác, đũa thủy tinh được sấy khử trùng ở 140 o C trong 2 giờ
* Môi trường WA (Water Agar medium)
Agar được điều chế bằng cách hòa tan trong nước sôi và hấp vô trùng ở nhiệt độ 121 oC (1,5atm) trong 45 phút Sau khi hấp, môi trường để nguội xuống khoảng 60 oC trước khi đổ vào các đĩa petri với thể tích 5ml mỗi đĩa, giúp thao tác cấy bào tử dễ dàng hơn Môi trường này thích hợp để phân lập nấm ban đầu, ít bị lẫn tạp do nghèo dinh dưỡng và dùng để nuôi cấy đơn bào tử.
Môi trường PDA (Potato D-Glucose Agar) là một loại môi trường giàu dinh dưỡng, được sử dụng để nuôi cấy và thuần hóa nấm Mục đích chính là quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc và kích thước sợi nấm, cũng như sắc tố tản nấm sinh ra trên môi trường Những chỉ tiêu này đóng vai trò quan trọng trong việc phân loại các loại nấm khác nhau.
Để điều chế môi trường nuôi cấy nấm, chọn những củ khoai tây khỏe mạnh, gọt vỏ và cắt nhỏ Đun sôi khoai tây trong nước cất khoảng 15-20 phút, sau đó lọc lấy dịch trong và bổ sung nước cất Tiếp theo, cho agar và đường glucose vào dịch khoai tây, khuấy đều và đun sôi lại Đổ hỗn hợp vào bình tam giác, phủ giấy bạc và khử trùng ở 121°C (1.5atm) trong 45 phút Sau khi nguội đến 60°C, thêm kháng sinh Penicillin hoặc Streptomycin (10mg/100ml), lắc đều và đổ vào đĩa Petri đã khử trùng, với lượng 10-15ml mỗi đĩa Khi môi trường đông cứng, có thể tiến hành phân lập và nuôi cấy nấm.
* Môi trường PCA (Potato Carot Agar)
Phương pháp điều chế bao gồm việc chọn những củ khoai tây và cà rốt khỏe mạnh, gọt sạch vỏ và cắt thành miếng nhỏ Sau đó, cho khoai tây và cà rốt vào nước cất, đun sôi trong 15-20 phút, rồi lọc qua vải màn để lấy dịch trong Tiếp theo, bổ sung nước cất đủ liều lượng, cho từ từ agar và đường glucose vào dịch, khuấy đều cho tan hết và đun sôi lại Cuối cùng, cho dịch vào bình tam giác, phủ giấy bạc và khử trùng trong nồi hấp ở 121 °C (1.5atm) trong 45 phút, sau đó để nguội đến 60 °C.
* Môi trường PDB (Potato Dextrose Broth)
Để điều chế dịch khoai tây, chọn những củ khoai tây không bị bệnh và còn nguyên vẹn, gọt sạch vỏ và cắt thành miếng nhỏ Ngâm khoai tây vào nước cất theo liều lượng đã định, đun sôi trong 15-20 phút, sau đó lọc bằng vải màn để thu được dịch trong, bỏ bã khoai tây và bổ sung nước cất đủ liều lượng Tiếp theo, cho từ từ đường glucose đã cân vào dịch khoai tây, khuấy đều cho tan hết và đun sôi lại Sau khi hoàn thành, cho dịch vào bình tam giác, phủ giấy bạc và khử trùng trong nồi hấp ở 121 oC (1.5atm) trong 45 phút Cuối cùng, để nguội môi trường đến nhiệt độ 30 oC.
3.5.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm
3.5.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm
- Sử dụng nguồn nấm thuần Cấy nấm vào giữa đĩa petri (chứa môi trường PGA) và đặt trong tủ định ôn được chỉnh ở các ngưỡng nhiệt độ: 15 o C, 20 o C,
25 o C, 30 o C, 35 o C Mỗi ngưỡng nhiệt độ nhắc lại 3 lần (3 đĩa petri)
- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy
3.5.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm
- Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PDA và đặt ở các ngưỡng pH: 3, 4, 5, 6, 7, 8 Mỗi ngưỡng pH nhắc lại 3 lần (3 đĩa petri)
Để chuẩn bị môi trường PDA với nồng độ pH phù hợp, trước tiên chọn củ khoai tây sạch bệnh, rửa sạch, gọt vỏ và thái nhỏ Sau đó, cho vào nồi nước cất 1000ml và đun sôi trong 20 phút, lọc lấy phần nước qua phễu có màng lọc Tiếp theo, điều chỉnh nồng độ pH bằng cách nhỏ từ từ dung dịch NaOH và HCl cho đến khi đạt yêu cầu Thêm từ từ agar và đường glucose vào, khuấy đều rồi cho vào bình tam giác, đậy nắp bằng giấy bạc Cuối cùng, hấp khử trùng ở 121 oC, 1.5 atm trong 2 giờ và để nguội xuống 60 oC.
+ Dùng đột lấy một miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm đặt vào giữa đĩa petri chứa môi trường PDA chứa các nồng độ pH
- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy
3.5.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển của nấm
- Nguồn nấm thuần được cấy trên các môi trường PDA, PCA, WA ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Mỗi môi trường nhắc lại 3 lần (3 đĩa petri)
+ Chuẩn bị các môi trường PDA, PCA, WA (mục 3.5.1)
+ Dùng đột lấy một miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm đặt vào giữa đĩa petri chứa môi trường PDA, PCA, WA
3.5.3 Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng đối với nấm
Neoscytalidium dimidiatum trong phòng thí nghiệm
Chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng với nấm
Neoscytalidium dimidiatum Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 01 hộp petri
CT1: Cấy riêng nấm đối kháng và Neoscytalidium dimidiatum
CT2: Cấy nấm đối kháng trước Neoscytalidium dimidiatum 24 giờ
CT3: Cấy nấm đối kháng sau Neoscytalidium dimidiatum 24 giờ
CT4: Cấy nấm đối kháng và Neoscytalidium dimidiatum đồng thời
Đối với công thức 2, 3, 4, cần sử dụng đột đã được khử trùng để lấy phần đỉnh sinh trưởng của sợi nấm từ nguồn nấm thuần Sau đó, tiến hành cấy chuyển với khoảng cách giữa miếng thạch và mép đĩa khoảng 1,5 cm Cuối cùng, cấy một miếng thạch của nấm còn lại ở phía đối diện của đĩa petri.
+ Công thức đối chứng: đặt miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm vào giữa đĩa petri chưa môi trường PDA
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm đối kháng và nấm
Neoscytalidium dimidiatum sau 1-5 ngày nuôi cấy
Tính hiệu lực đối kháng (%) theo công thức Abbott
H: Là hiệu lực ức chế của nấm đối kháng
C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng (không xử lý)
T: Đường kính tản nấm ở công thức xử lý
3.5.3.1 Khảo sát hiệu lực ức chế của các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm đối kháng đã lựa chọn
Chúng tôi đã thực hiện khảo sát để đánh giá hiệu quả ức chế của các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình phát triển của nấm, nhằm chống lại sự phát triển của nấm đối kháng.
Neoscytalidium dimidiatum Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 01 hộp petri
CT1: Đối chứng - Cấy nấm N dimidiatum trên môi trường PDA
CT2: Cấy nấm N.dimidiatum trên môi trường chứa 90% PDA + 10% dd nấm đối kháng
CT3: Cấy nấm N.dimidiatum trên môi trường chứa 70% PDA + 30% dd nấm đối kháng
CT4: Cấy nấm N.dimidiatum trên môi trường chứa 50% PDA + 50% dd nấm đối kháng
Nấm đối kháng được nuôi cấy trong môi trường lỏng phù hợp cho từng loài, với nhiệt độ và thời gian tối ưu đã được nghiên cứu, đồng thời thực hiện quá trình lắc ở tốc độ 120 rpm.
- Dịch nuôi được tách ra từ dung dịch nhân nuôi và được đong thể tích
- Pha môi trường PDA và dịch nuôi nấm theo tỷ lệ các công thức thí nghiệm
- Đặt miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm bệnh vào giữa đĩa petri tương ứng từng công thức
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 1-5 ngày nuôi cấy
3.5.3.2 Nghiên cứu quy trình tách chiết và lựa chọn dung môi để tách chiết các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm đối kháng đã lựa chọn
* Nghiên cứu và lựa chọn dung môi tách chiết để thu các loại hoạt chất sinh học được sản sinh trong quá trình nhân nuôi
Dung môi được lựa chọn để áp dụng trong kỹ thuật tách chiết:
+ Dung môi: Ethyl acetate (EtOAc)
+ Dung môi: n – Butanol và một số dung môi khác
* Nghiên cứu quy trình kỹ thuật tách chiết các hợp chất sinh học từ nấm đối kháng đã lựa chọn
- Phương pháp tách chiết các hoạt chất sinh học được nấm đối kháng tiết ra trong môi trường nuôi cấy thu hoạt chất sinh học
Phương pháp nuôi cấy nấm đối kháng được thực hiện theo nghiên cứu của Kanokmedhakul et al (2006), trong đó nấm được nuôi trên môi trường lỏng thích hợp cho từng loài Quá trình này được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian tối ưu đã được xác định, với tốc độ lắc là 120 rpm.
Hình 3.1 Nấm đối kháng Trichoderma asperellum đƣợc nuôi cấy trên môi trường thích hợp dạng lỏng ở tốc độ lắc 120rpm
Dịch nuôi được tách ra từ dung dịch nhân nuôi và được đong thể tích
Quy trình tách chiết bằng dung môi n – Hexane:
Để tiến hành chiết xuất, cho 500ml dịch nuôi vào phễu chiết, sau đó thêm 300ml dung môi n-Hexane và lắc đều hỗn hợp Tiếp theo, cố định phễu chiết lên giá đỡ và chờ cho hỗn hợp lắng xuống, phân thành 3 lớp rõ rệt.
Sử dụng cốc đo thủy tinh để tách dung dịch ở lớp dưới cùng qua van Sau đó, lắc đều hỗn hợp còn lại trong phễu chiết và tiếp tục để lắng lần thứ hai.
- Dung dịch phân thành 3 lớp, tiếp tục tách lớp dung dịch dưới cùng qua van vào cốc thủy tinh 1
- Lắc đều hỗn hợp còn lại trong phễu chiết và để lắng lần 3
Tách lớp dung dịch cuối cùng và thứ hai qua van vào cốc thủy tinh 1 Sau đó, tách riêng lớp dung môi trên cùng chứa hoạt chất sinh học của nấm ra một bình tam giác có nắp giấy bạc, sử dụng dịch chiết từ dung môi n-Hexane.
- Làm tương tự các bước trên tách chiết dịch nấm ở cốc thủy tinh 1 trên thêm
2 lần với dung môi n – Hexane (mỗi lần sau dùng khoảng 200ml n – Hexane)
Hình 3.2 Phễu tách chiết hoạt chất sinh học do nấm đối kháng Trichoderma asperellum tiết ra bằng dung môi
Xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý thống kê trong Excel 2010 và chương trình IRRISTAT 5.0
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 KẾT QUẢ THU THẬP, PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA NẤM NEOSCYTALIDIUM DIMIDIATUM GÂY BỆNH ĐỐM NÂU THANH LONG
4.1.1 Kết quả điều tra mức độ bệnh đốm nâu thanh long Neoscytalidium dimidiatum Để tiến hành theo dõi diễn biến bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra chúng tôi tiến hành điều tra tại một số địa điểm thuộc tỉnh Bình Thuận và Quảng Ninh kết quả thu được trong bảng 4.1
Bảng 4.1 Mức độ bệnh đốm nâu thanh long năm 2016 – 2017 Địa điểm Triệu chứng Bộ phận bị hại Tỷ lệ bệnh (%)
Hàm Thuận Nam Đốm nâu Thân, quả 70,3
Hàm Thuận Bắc Đốm nâu Thân, quả 54,9
Quảng Yên Loét thân Thân 17,8
Uông Bí Loét thân Thân 15,5
Số liệu điều tra phối hợp cùng với các cán bộ của Trung tâm khuyến nông, bảo vệ thực vật của tỉnh Bình Thuận và Quảng Ninh
Hình 4.1 Mức độ bệnh đốm nâu thanh long năm 2016 – 2017
Bệnh đốm nâu thanh long tại tỉnh Bình Thuận gây hại nặng, với tỷ lệ bệnh đạt 70,3% ở Hàm Thuận Bắc, cao hơn nhiều so với 54,9% ở Hàm Thuận Nam Trong khi đó, tại Quảng Yên và Uông Bí (Quảng Ninh), tỷ lệ bệnh chỉ ở mức 17,8% và 15,5%, cho thấy mức độ gây hại ở Bình Thuận cao gấp 3 – 4 lần Bệnh này tạo ra các vết đốm nâu trên thân và quả, ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất và chất lượng, từ đó tác động đến khả năng xuất khẩu Khu vực phía Nam với diện tích trồng thanh long lớn và điều kiện thời tiết nóng ẩm thuận lợi, tạo điều kiện cho bệnh phát triển mạnh mẽ, trong khi khu vực phía Bắc với nhiệt độ trung bình thấp hơn không chịu ảnh hưởng nặng nề như vậy.
4.1.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Neoscytalidium dimidiatum
Hình 4.2 Triệu chứng bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long
Nguồn nấm thuần được phân lập từ mẫu nhiễm bệnh tại tỉnh Bình Thuận đã được nuôi cấy trên môi trường PDA Sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng 25-28 độ C, chúng tôi đã quan sát và ghi nhận các đặc điểm phát triển của tản nấm, bao gồm đường kính và hình thái của tản nấm.
Nấm Neoscytalidium dimidiatum là tác nhân gây bệnh đốm nâu trên thanh long, phát triển nhanh chóng trên môi trường PDA với đường kính tản nấm đạt 90mm sau 3 ngày nuôi cấy Tản nấm có hình dạng tròn, xốp và màu xám đen.
Bảng 4.2 Đặc điểm tản nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu thanh long trên môi trường PDA
Ngày sau cấy Đường kính tản nấm
(mm) Đặc điểm hình thái tản nấm
2 46,83 Tròn, xốp, màu xám nhạt
3 90,00 Tròn, xốp, màu xám nhạt
4 90,00 Tròn, xốp, màu xám đen
5 90,00 Tròn, xốp, màu xám đen
Hình 4.3 Sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy
Sau 1-2 ngày cấy, tản nấm có màu trắng, chuyển sang màu xám nhạt vào ngày thứ 3 trên môi trường PDA Đến ngày thứ 4-5, tản nấm chuyển sang màu xám đen và phát triển dày, xốp.
4.1.3 Sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum trên các môi trường sau 5 ngày nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm
Neoscytalidium dimidiatum trong điều kiện invitro Chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm Neoscytalidium dimidiatum trên 3 môi trường WA, PCA, PDA sau 5 ngày thu được ở bảng 4.3
Bảng 4.3 Đường kính (mm) tản nấm Neoscytalidium dimidiatum trên các môi trường sau 5 ngày nuôi cấy Ngày
Môi trường nuôi cấy nấm
Ghi chỳ: Đường kớnh đĩa petri ỉ 90mm
Nấm Neoscytalidium dimidiatum cho thấy sự phát triển mạnh mẽ trên môi trường PDA (Potato – Đường glucose – Agar), với đường kính tản nấm đạt 41,83 mm sau 2 ngày và 90 mm sau 3 ngày nuôi cấy Mặc dù nấm cũng phát triển trên môi trường WA và PCA, nhưng tốc độ phát triển chậm hơn, với đường kính tản nấm đạt 19,17 mm trên WA và 38,17 mm trên PCA sau 2 ngày nuôi cấy.
WA là môi trường nghèo dinh dưỡng nên tốc độ phát triển của nấm rất chậm
Hình 4.4 Sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường
WA, PCA, PDA sau 3 ngày nuôi cấy
Hình 4.5 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
A: Tản nấm Neoscytalidium dimidiatum nuôi cấy trên môi trường WA B: Tản nấm Neoscytalidium dimidiatum nuôi cấy trên môi trường PCA C: Tản nấm Neoscytalidium dimidiatum nuôi cấy trên môi trường PDA
4.1.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm
Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường PDA
Bảng 4.4 trình bày kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum trên môi trường PDA Kết quả cho thấy đường kính tản nấm (mm) sau các ngày nuôi cấy phụ thuộc vào các mức pH khác nhau.
Hình 4.6 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 2 ngày nuôi cấy
Nấm Neoscytalidium dimidiatum phát triển tốt nhất ở pH 6, 7 và 8, với pH 7 cho thấy sự phát triển nhanh chóng, khi chỉ sau 2 ngày nấm đã phủ kín đĩa petri Cụ thể, ở pH 8, đường kính tản nấm đạt 73,83 mm, trong khi ở pH 6 là 75,50 mm Ngược lại, sự phát triển ở pH 4 và 5 rất hạn chế, với đường kính tản nấm chỉ đạt 39,67 mm và 36,50 mm Do đó, pH thích hợp cho sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum là từ 6 đến 8.
Neoscytalidium dimidiatum phát triển nằm trong khoảng pH 6 – 8
4.1.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Neoscytalidium dimidiatum
Nhiệt độ( o C) Đường kính tản nấm (mm)sau các ngày nuôi cấy
1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
Hình 4.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm N dimidiatum sau 2 ngày nuôi cấy
Nấm Neoscytalidium dimidiatum có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15-35°C, với điều kiện tối ưu là từ 25-35°C Cụ thể, nấm này phát triển mạnh nhất ở nhiệt độ 30-35°C, đạt đường kính tản 90mm sau 2-3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ở 30°C.
Nấm Neoscytalidium dimidiatum phát triển mạnh mẽ trong điều kiện mùa hè ở Việt Nam, nơi có nhiệt độ trung bình cao và thời tiết nóng ẩm Các tỉnh phía Nam như Bình Thuận, Tiền Giang, Long An với nhiệt độ trung bình năm cao và ổn định, cùng với mùa mưa ẩm, tạo điều kiện lý tưởng cho nấm này phát sinh và phát triển thành dịch bệnh Ngược lại, ở một số vùng phía Bắc như Ninh Bình, Quảng Ninh, nơi có nhiệt độ trung bình năm thấp hơn và diện tích trồng thanh long nhỏ, việc hình thành dịch bệnh trở nên khó khăn hơn.
4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM ĐỐI KHÁNG
4.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm đối kháng Trichoderma
4.2.1.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Trichoderma harzianum
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm đối kháng Trichoderma harzianum
Ngày Môi trường nuôi cấy nấm
Hình 4.8 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm đối kháng Trichoderma harzianum sau 3 ngày nuôi cấy
Nấm Trichoderma harzianum phát triển mạnh mẽ trên môi trường PDA, với đường kính tản nấm đạt 67,17 mm sau 2 ngày và mọc kín đĩa petri 80 mm sau 3 ngày nuôi cấy Trong khi đó, trên môi trường WA và PCA, nấm vẫn phát triển nhưng với tốc độ chậm hơn; cụ thể, sau 2 ngày, đường kính tản nấm trên WA chỉ đạt 27,5 mm và trên PCA là 49,33 mm Sự phát triển chậm trên môi trường WA được lý giải bởi đây là môi trường nghèo dinh dưỡng.
4.2.1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm đối kháng Trichoderma asperellum Ngày
Môi trường nuôi cấy nấm
Ghi chỳ: Đường kớnh đĩa petri ỉ 90mm
Hình 4.9 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm đối kháng Trichoderma asperellum sau 3 ngày nuôi cấy
Nấm Trichoderma asperellum phát triển mạnh mẽ trên môi trường PDA (Potato – Đường glucose – Agar), với đường kính tản nấm đạt 77,17 mm sau 2 ngày và 90 mm sau 3 ngày nuôi cấy Trong khi đó, trên môi trường WA và PCA, nấm vẫn phát triển nhưng tốc độ chậm hơn, với đường kính tản nấm đạt 36,67 mm sau 2 ngày trên WA và 57,83 mm trên PCA Môi trường WA, do nghèo dinh dưỡng, dẫn đến sự phát triển chậm của nấm.
Hình 4.10 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm đối kháng Trichoderma asperellum
A: Tản nấm đối kháng Trichoderma asperellum nuôi cấy trên môi trường WA B: Tản nấm đối kháng Trichoderma asperellum nuôi cấy trên môi trường PCA C: Tản nấm đối kháng Trichoderma asperellum nuôi cấy trên môi trường PDA
4.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm đối kháng Trichoderma trên môi trường PDA
4.2.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm đối kháng Trichoderma harzianum trên môi trường PDA
Bảng 4.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm
Trichoderma harzianum trên môi trường PDA pH Đường kính tản nấm (mm) sau các ngày nuôi cấy
Ghi chỳ: Đường kớnh đĩa petri ỉ 80mm
Hình 4.11 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Trichoderma harzianum trên môi trường PDA sau 2 ngày nuôi cấy
Theo bảng 4.8, đường kính tản nấm ở các mức pH không có sự khác biệt lớn, chỉ sau 3 ngày nấm đã mọc kín đĩa petri Đặc biệt, ở pH 5,6, đường kính tản nấm lớn hơn, trong khi ở pH 8, đường kính tản nấm nhỏ nhất Điều này cho thấy rằng điều kiện pH từ 4-8 không ảnh hưởng nhiều đến sự phát triển của nấm.
4.2.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm đối kháng Trichoderma asperellum trên môi trường PDA
Bảng 4.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm
Trichoderma asperellum trên môi trường PDA pH Đường kính tản nấm (mm) sau các ngày nuôi cấy
Ghi chỳ: Đường kớnh đĩa petri ỉ 80mm
Hình 4.12 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum trên môi trường PDA sau 2 ngày nuôi cấy
