(TIỂU LUẬN) tách chiết hợp chất kháng sinh trong dịch lên men nấm trichoderma ức chế nấm neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn hướng dẫn ThS Nguyễn Duy Long TS Nguyễn Thị Hai Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Kim Ngôn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CÁM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy Viện Khoa Học Ứng Dụng tất thầy cô truyền dạy kiến thức quý báu cho em suốt năm học vừa qua Qua em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Hai ThS Nguyễn Duy Long người định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh em xin cảm ơn thầy Phịng Thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng anh chị Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao bạn bè nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khăn, nản lòng suốt thời gian học tập, nghiên cứu sống Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Kim Ngôn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH TỪ VIẾT TẮT iv MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 5.1 Phương pháp tổng hợp tài liệu 5.2 Phương pháp nghiên cứu 5.3 Phương pháp xử lý số liệu Ý nghĩa khoa học đề tài Kết đạt Kết cấu đề tài CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nấm Trichoderma spp 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.1.4 Cơ chế kiểm sốt sinh học nấm Trichoderma phịng trừ nấm gây bệnh trồng 1.1.4.2 Ký sinh i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.4.3 Tiết kháng sinh (trích dẫn Nguyễn Hoàng Anh, 2013) 10 1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm Trichoderma spp giới Việt Nam 13 1.2.1 Trên giới 13 1.2.2 Tại Việt Nam 14 1.2.3 Ứng dụng Trichoderma nông nghiệp 15 1.3 Giới thiệu peptaibol chủng Trichoderma 16 1.3.1 Tình hình nghiên cứu Trichobrachin 22 1.3.2 Mức độ an toàn sinh học peptaibol 27 1.4 Giới thiệu chủng nấm gây bệnh đốm trắng long 27 1.4.1 Giới thiệu bệnh đốm trắng 27 1.4.2 Tác hại bệnh đốm trắng 30 1.4.3 Giới thiệu chủng nấm gây bệnh Neoscytalidium dimidiatum 30 1.4.4 Lịch sử nghiên cứu 32 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 35 2.2 Vật liệu nghiên cứu 35 2.2.1 Vật liệu: 35 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 35 2.2.3 Các loại môi trường: 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm 38 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.2 Phương pháp tách chiết kháng sinh peptailbol từ dịch lên men chủng nấm Trichoderma 39 2.3.3 Phương pháp xác định peptaibol chứa dịch chiết thô .42 2.3.4 Phương pháp khảo sát sơ hiệu kháng nấm kháng sinh peptaibol điều kiện invitro 43 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Kết khảo sát số đặc điểm hình thái đặc điểm sinh học chủng nấm Trichoderma 45 3.1.1 Đặc điểm hình thái chủng Trichoderma 45 3.1.2 Kết khảo sát khả sinh trưởng chủng Trichoderma TC25 TC15 46 3.2 Hàm lượng peptaibol thu dịch nuôi cấy chủng Trichoderma TC25 TC15 47 3.2.1 Kết phân tích phổ IR 48 3.2.2 Kết phân tích sắc ký phương pháp HPLC – UV 49 3.2.3 Kết phân tích sắc ký phương pháp HPLC-MS 50 3.3 Kết đánh giá hiệu đối kháng nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum với hợp chất thô peptaibol chủng Trichoderma TC25 điều kiện invitro 60 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 4.1 Kết luận 63 4.2 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH TỪ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật CPD: Comprehensive peptaibiotics database PDA: Potato Dextrose Agar PDB: Potato Dextrose Broth VSV: Vi sinh vật iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái vi thể Trichoderma harzianum Hình 1.2 Hình thái đại thể số chủng Trichoderma spp (http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=2104733_67fig15_23&req=4) Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh Rhizoctonia solani (Agrios, 2005) 10 Hình 1.4 Ức chế phát triển nấm Pythium ultimum chất kháng sinh tiết từ Trichoderma harzianum (Lê Thị Huệ, 2010) Hình 1.5 Cơ sở liệu CPD (Comprehensive Peptaibiotics Database- Stoppacher, 2013) 20 Hình 1.6 Cấu trúc phân tử alamethicin Hình 1.7 Tác động ức chế theo độ pha loãng khác M2 C chrysosperma YL sau ngày nuôi cấy Tỷ lệ pha lỗng (2, 4, 6, 8, 16) hình (A) (B) Hình 1.8 Phổ peptaibol Trichobrachin thu từ T longibrachiatum Hình 1.9 Phổ MS-HPLC peptaibol Trichoderma Hình 1.10 Triệu chứng bệnh xuất thân, cành long ( Nguồn: Viện bảo vệ thực vật, 2014) Hình 1.11 Triệu chứng bệnh long chín (Nguồn: Viện bảo vệ thực vật ,2014) 29 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách chiết hợp chất peptaibol thơ từ nấm Trichoderma 40 Hình 2.2 Q trình tách chiết kháng sinh peptailbol từ dịch lên men chủng nấm Trichoderma TC25 TC15 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sơ hiệu kháng nấm hợp chất kháng sinh peptaibol điều kiện invitro ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.1 Hình thái đại thể chủng nấm Trichoderma TC15 TC25 sau ngày nuôi cấy môi trường PDA 47 Hình 3.2 Dải phổ IR alamethicin hệ thống chạy phổ IR 48 Hình 3.3 Dải phổ IR chủng TC25 hệ thống chạy phổ IR 48 Hình 3.4 Dải phổ IR chủng TC15 hệ thống chạy phổ IR 49 Hình 3.5 Phổ phân tích HPLC-MS chủng Trichoderma TC15Error! Bookmark not defined Hình 3.6 Trình tự peptaibol chủng Trichoderma TC15 51 Hình 3.7 Phổ phân tích HPLC-MS chủng Trichoderma TC25Error! Bookmark not defined Hình 3.9 Tỷ lệ ức chế (%) hợp chất peptaibol thô với Neoscytalidium dimidiatum .61 Hình 3.10 Tỷ lệ đối kháng (%) hợp chất peptaibol thô với Neoscytalidium dimidiatum62 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm Trichoderma 45 Bảng 3.2 Đường kính tản nấm Trichodema (cm) sau ngày nuôi cấy 46 Bảng 3.3 Hàm lượng peptaibol thu chủng Trichoderma TC25 TC15 sau cô quay chân không 47 Bảng 3.4 Hàm lượng alamethicin thu bước sóng 215nmError! Bookmark not defined Bảng 3.5 Hàm lượng peptaibol sau tinh chế với dung môi methanol thu bước sóng 215nm từ chủng nấm khảo sát 49 Bảng 3.7 Trình tự peptaibol chủng Trichoderma TC25 (trích từ sở liệu) .Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 Tỷ lệ ức chế (%) hợp chất peptaibol thô với nấm Neoscytalidium dimidiatum 60 vii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong năm gần đây, nông nghiệp Việt Nam có bước tiến vượt bậc, đáp ứng nhu cầu lương thực - thực phẩm nước, ngồi sản lượng nơng sản xuất cịn xếp vào hàng đầu giới Tuy nhiên, chất lượng hiệu việc sản xuất nông sản hàng hóa cịn nhiều hạn chế so với nước khu vực Vì thế, cơng tác phát triển giống trồng phịng trừ sâu bệnh hại đóng vai trị vơ quan trọng Tuy nhiên biện pháp phịng trừ sâu bệnh hại thuốc hóa học để lại nhiều hệ lụy, khơng gây tốn chi phí cho nông dân mà đa dạng hệ vi sinh vật đất chất lượng đất bị suy giảm nghiêm trọng Vì vậy, biện pháp sinh học tập trung nghiên cứu thay dần biện pháp hóa học Các kết nghiên cứu cho thấy lồi vi khuẩn, nấm Bacillus subtilis, Trichoderma, Pseudomonas có khả đối kháng với nhiều loài nấm gây bệnh bảo vệ trồng chống lại vi sinh vật gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho trồng sinh trưởng phát triển tốt (Dunlap et al, 2013; Jamil Shafi et al., 2017; Radhakrishnan et al., 2017) Vì thế, khoảng 60% chế phẩm sinh học đăng ký giới sản phẩm dựa Trichoderma Do Trichoderma có khả tiêu diệt vi nấm gây hại trồng nhiều chế ký sinh, sinh kháng sinh, tiết enzyme ngoại bào làm phân hủy vách tế bào nấm bệnh Ở Việt Nam, ứng dụng nấm Trichoderma nông nghiệp nhiều Tuy nhiên, việc dùng trực tiếp bào tử Trichoderma sử dụng enzyme từ loài nấm hợp chất kháng sinh có nấm chưa có tài liệu nghiên cứu Do đó, việc nghiên cứu tách chiết peptaibol ứng dụng phòng trừ nấm bệnh trồng tài liệu tham khảo ban đầu để tiếp tục mở rộng cho hướng nghiên cứu hợp chất này, dừng lại giới hạn việc dùng sinh khối trực tiếp việc phịng bệnh mà cịn ứng dụng để trị ngăn lây lan phát tán loài nấm bệnh gây hại trồng ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC C: Phổ HPLC – UV alamethicin chủng nấm khảo sát bước sóng 215nm Phổ HPLC – UV alamethicin bước sóng 215nm Alamethicin Hình Phổ HPLC – UV alamethicin bước sóng 215nm Phổ HPLC – UV Trichoderma TC25 bước sóng 215nm ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình Phổ HPLC – UV Trichoderma TC25 bước sóng 215nm Phổ HPLC – UV Trichoderma TC15 bước sóng 215nm TC15 Hình Phổ HPLC – UV Trichoderma TC15 bước sóng 215nm ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC D: Cơ sở liệu amino acid peptaibol trích xuất từ CPD (Comprehensive Peptaibiotics Database) ID Abbreviation Aoh APAE b-Ala BOC - BTA DAMP Dec desmethyl8 AHMOD ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DPD 10 DPD-NO 11 EtNva 12 HMDA 13 HKP 14 Hyleu 15 Hyp 16 Iva 17 LAU 18 Lxx 19 MDA 20 MeLeu 21 MePhe 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 22 MePro 23 MeVal - 24 MHA 25 MOO 26 MOTDA 27 MPD 28 MYR 29 Oc 30 ODec 31 PDA 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 32 Phaol 33 PIHPPE 34 Pip 35 Pyr 36 SBA 37 Vxx 38 3M-Pro 39 4MPro ABAPABEA 40 41 Ac 42 ACC 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 43 Add 44 Ahe 45 AHMOD 46 AHMP 47 Aib 48 AMAE, Tdol 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 49 AMD 50 AMO2 51 AMO3 52 AMO4 53 AMOD 54 Aod 55 Aod-Oac 56 Aoe 14 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 57 Ala 58 Arg 59 Asn 60 Glu 61 Gln 62 Gly 63 Ile 64 Leu 65 Lys 66 Phe 15 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 67 Pro 68 Ser 69 Thr 70 Trp 71 Tyr 72 Val 73 Alaol 74 Aibol 75 Prool 76 Vxxol 77 Valol 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 78 Ivaol 79 Lxxol 80 Leuol 81 Ileol 82 Pheol 83 Argol 84 Trpol 85 APPS 86 Serol 17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC E: Phổ HPLC – MS chủng nấm Trichoderma TC25 TC15 18 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình Phổ phân tích HPLC-MS chủng Trichoderma TC15 19 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình Phổ phân tích HPLC-MS chủng Trichoderma TC25 20 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 21 ... dịch lên men nấm Trichoderma ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng long? ?? Mục đích nghiên cứu Tách chiết hợp chất kháng sinh dịch lên men nấm Trichoderma ứng dụng phòng trừ nấm gây. .. dịch chiết thô phương pháp sắc ký Khảo sát khả kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum từ dịch chiết kháng sinh có chủng nấm Trichoderma TC25 TC15 Kết cấu đề tài ? ?Tách chiết hợp chất kháng sinh dịch. .. thiệu chủng nấm gây bệnh đốm trắng long 1.4.1 Giới thiệu bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng (đốm nâu) loại bệnh nguy hiểm long, bệnh hại cành gây thiệt hại kinh tế lớn cho nhiều vùng trồng long bà 27