Tách chiết hợp chất kháng sinh trong dịch lên men nấm trichoderma ức chế nấm neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn hướng dẫn ThS Nguyễn Duy Long TS Nguyễn Thị Hai Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Kim Ngôn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CÁM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy Viện Khoa Học Ứng Dụng tất thầy cô truyền dạy kiến thức quý báu cho em suốt năm học vừa qua Qua em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Hai ThS Nguyễn Duy Long người định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh em xin cảm ơn thầy Phịng Thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng anh chị Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao bạn bè nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khăn, nản lòng suốt thời gian học tập, nghiên cứu sống Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Kim Ngôn ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH TỪ VIẾT TẮT iv MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 5.1 Phương pháp tổng hợp tài liệu 5.2 Phương pháp nghiên cứu 5.3 Phương pháp xử lý số liệu Ý nghĩa khoa học đề tài Kết đạt Kết cấu đề tài CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu nấm Trichoderma spp 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.1.4 Cơ chế kiểm sốt sinh học nấm Trichoderma phịng trừ nấm gây bệnh trồng 1.1.4.2 Ký sinh i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.4.3 Tiết kháng sinh (trích dẫn Nguyễn Hoàng Anh, 2013) 10 1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm Trichoderma spp giới Việt Nam 13 1.2.1 Trên giới 13 1.2.2 Tại Việt Nam 14 1.2.3 Ứng dụng Trichoderma nông nghiệp 15 1.3 Giới thiệu peptaibol chủng Trichoderma 16 1.3.1 Tình hình nghiên cứu Trichobrachin 22 1.3.2 Mức độ an toàn sinh học peptaibol 27 1.4 Giới thiệu chủng nấm gây bệnh đốm trắng long 27 1.4.1 Giới thiệu bệnh đốm trắng 27 1.4.2 Tác hại bệnh đốm trắng 30 1.4.3 Giới thiệu chủng nấm gây bệnh Neoscytalidium dimidiatum 30 1.4.4 Lịch sử nghiên cứu 32 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 35 2.2 Vật liệu nghiên cứu 35 2.2.1 Vật liệu: 35 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 35 2.2.3 Các loại môi trường: 36 2.3 Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm 38 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.2 Phương pháp tách chiết kháng sinh peptailbol từ dịch lên men chủng nấm Trichoderma 39 2.3.3 Phương pháp xác định peptaibol chứa dịch chiết thô 42 2.3.4 Phương pháp khảo sát sơ hiệu kháng nấm kháng sinh peptaibol điều kiện invitro 43 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Kết khảo sát số đặc điểm hình thái đặc điểm sinh học chủng nấm Trichoderma 45 3.1.1 Đặc điểm hình thái chủng Trichoderma 45 3.1.2 Kết khảo sát khả sinh trưởng chủng Trichoderma TC25 TC15 46 3.2 Hàm lượng peptaibol thu dịch nuôi cấy chủng Trichoderma TC25 TC15 47 3.2.1 Kết phân tích phổ IR 48 3.2.2 Kết phân tích sắc ký phương pháp HPLC – UV 49 3.2.3 Kết phân tích sắc ký phương pháp HPLC-MS 50 3.3 Kết đánh giá hiệu đối kháng nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum với hợp chất thô peptaibol chủng Trichoderma TC25 điều kiện invitro 60 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 4.1 Kết luận 63 4.2 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH TỪ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật CPD: Comprehensive peptaibiotics database PDA: Potato Dextrose Agar PDB: Potato Dextrose Broth VSV: Vi sinh vật iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái vi thể Trichoderma harzianum Hình 1.2 Hình thái đại thể số chủng Trichoderma spp (http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=2104733_67fig15_23&req=4) Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh Rhizoctonia solani (Agrios, 2005) 10 Hình 1.4 Ức chế phát triển nấm Pythium ultimum chất kháng sinh tiết từ Trichoderma harzianum (Lê Thị Huệ, 2010) 12 Hình 1.5 Cơ sở liệu CPD (Comprehensive Peptaibiotics Database- Stoppacher, 2013) 20 Hình 1.6 Cấu trúc phân tử alamethicin 21 Hình 1.7 Tác động ức chế theo độ pha loãng khác M2 C chrysosperma YL sau ngày nuôi cấy Tỷ lệ pha loãng (2, 4, 6, 8, 16) hình (A) (B) 23 Hình 1.8 Phổ peptaibol Trichobrachin thu từ T longibrachiatum 25 Hình 1.9 Phổ MS-HPLC peptaibol Trichoderma 26 Hình 1.10 Triệu chứng bệnh xuất thân, cành long (Nguồn: Viện bảo vệ thực vật, 2014) 29 Hình 1.11 Triệu chứng bệnh long chín (Nguồn: Viện bảo vệ thực vật ,2014) 29 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách chiết hợp chất peptaibol thô từ nấm Trichoderma 40 Hình 2.2 Quá trình tách chiết kháng sinh peptailbol từ dịch lên men chủng nấm Trichoderma TC25 TC15 41 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sơ hiệu kháng nấm hợp chất kháng sinh peptaibol điều kiện invitro 43 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.1 Hình thái đại thể chủng nấm Trichoderma TC15 TC25 sau ngày nuôi cấy môi trường PDA 47 Hình 3.2 Dải phổ IR alamethicin hệ thống chạy phổ IR 48 Hình 3.3 Dải phổ IR chủng TC25 hệ thống chạy phổ IR 48 Hình 3.4 Dải phổ IR chủng TC15 hệ thống chạy phổ IR 49 Hình 3.5 Phổ phân tích HPLC-MS chủng Trichoderma TC15Error! Bookmark not defined Hình 3.6 Trình tự peptaibol chủng Trichoderma TC15 51 Hình 3.7 Phổ phân tích HPLC-MS chủng Trichoderma TC25Error! Bookmark not defined Hình 3.9 Tỷ lệ ức chế (%) hợp chất peptaibol thô với Neoscytalidium dimidiatum 61 Hình 3.10 Tỷ lệ đối kháng (%) hợp chất peptaibol thô với Neoscytalidium dimidiatum62 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm Trichoderma 45 Bảng 3.2 Đường kính tản nấm Trichodema (cm) sau ngày nuôi cấy 46 Bảng 3.3 Hàm lượng peptaibol thu chủng Trichoderma TC25 TC15 sau cô quay chân không 47 Bảng 3.4 Hàm lượng alamethicin thu bước sóng 215nmError! Bookmark not defined Bảng 3.5 Hàm lượng peptaibol sau tinh chế với dung mơi methanol thu bước sóng 215nm từ chủng nấm khảo sát 49 Bảng 3.7 Trình tự peptaibol chủng Trichoderma TC25 (trích từ sở liệu) .Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 Tỷ lệ ức chế (%) hợp chất peptaibol thô với nấm Neoscytalidium dimidiatum 60 vii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong năm gần đây, nơng nghiệp Việt Nam có bước tiến vượt bậc, đáp ứng nhu cầu lương thực - thực phẩm nước, ngồi sản lượng nơng sản xuất xếp vào hàng đầu giới Tuy nhiên, chất lượng hiệu việc sản xuất nông sản hàng hóa cịn nhiều hạn chế so với nước khu vực Vì thế, cơng tác phát triển giống trồng phịng trừ sâu bệnh hại đóng vai trị vơ quan trọng Tuy nhiên biện pháp phịng trừ sâu bệnh hại thuốc hóa học để lại nhiều hệ lụy, không gây tốn chi phí cho nơng dân mà đa dạng hệ vi sinh vật đất chất lượng đất bị suy giảm nghiêm trọng Vì vậy, biện pháp sinh học tập trung nghiên cứu thay dần biện pháp hóa học Các kết nghiên cứu cho thấy loài vi khuẩn, nấm Bacillus subtilis, Trichoderma, Pseudomonas có khả đối kháng với nhiều lồi nấm gây bệnh bảo vệ trồng chống lại vi sinh vật gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho trồng sinh trưởng phát triển tốt (Dunlap et al, 2013; Jamil Shafi et al., 2017; Radhakrishnan et al., 2017) Vì thế, khoảng 60% chế phẩm sinh học đăng ký giới sản phẩm dựa Trichoderma Do Trichoderma có khả tiêu diệt vi nấm gây hại trồng nhiều chế ký sinh, sinh kháng sinh, tiết enzyme ngoại bào làm phân hủy vách tế bào nấm bệnh Ở Việt Nam, ứng dụng nấm Trichoderma nơng nghiệp nhiều Tuy nhiên, ngồi việc dùng trực tiếp bào tử Trichoderma sử dụng enzyme từ loài nấm hợp chất kháng sinh có nấm chưa có tài liệu nghiên cứu Do đó, việc nghiên cứu tách chiết peptaibol ứng dụng phòng trừ nấm bệnh trồng tài liệu tham khảo ban đầu để tiếp tục mở rộng cho hướng nghiên cứu hợp chất này, dừng lại giới hạn việc dùng sinh khối trực tiếp việc phòng bệnh mà ứng dụng để trị ngăn lây lan phát tán loài nấm bệnh gây hại trồng ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC C: Phổ HPLC – UV alamethicin chủng nấm khảo sát bước sóng 215nm Phổ HPLC – UV alamethicin bước sóng 215nm Alamethicin Hình Phổ HPLC – UV alamethicin bước sóng 215nm Phổ HPLC – UV Trichoderma TC25 bước sóng 215nm ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình Phổ HPLC – UV Trichoderma TC25 bước sóng 215nm Phổ HPLC – UV Trichoderma TC15 bước sóng 215nm TC15 Hình Phổ HPLC – UV Trichoderma TC15 bước sóng 215nm ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC D: Cơ sở liệu amino acid peptaibol trích xuất từ CPD (Comprehensive Peptaibiotics Database) MW_ ID Abbreviation Residue_free C H N O S MW monoisotopic Position Category L-(9S)-2amino-9hydroxy-8-oxo1 Aoh decanoic acid lipoamino 10 19 217 217,1314074 cyclo acid C- amino 2-(2´aminopropyl)a APAE minoethanol 14 118 118,110613 terminal alcohol 89 89,047678 internal amino acid N- other terminal residue beta-alanine, 3amino3 b-Ala propionic acid Di-tert-butyl dicarbonate -4 BOC - 10 18 218 218,115423 N5 BTA butanoic acid 88 88,052429 1,2-diamino-46 DAMP methylpentane 16 0 116 116,131348 terminal fatty acid C- other terminal residue N7 Dec decanoic acid (2S, 10 20 172 172,146329 terminal fatty acid 6S)-2- amino-6hydroxy-8desmethyl8 AHMOD oxodecanoic acid lipoamino 10 19 217 217,131407 internal acid ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP N1,N1dimethylpropane-1,29 DPD C- diamine 14 0 102 102,115698 terminal amine (2S)-N1,N1dimethylpropane-1,2diamine-N10 DPD-NO 11 EtNva C- oxide 14 118 118,1106126 terminal amine ethyl-norvaline 15 145 145,110278 internal amino acid 3-hydroxy 2- methyl12 HMDA N- decanoic acid 11 22 202 202,156894 hydroxyketone 13 HKP piperazine ring terminal fatty acid C- other 16 2 184 184,121177 terminal residue b14 Hyleu hydroxyleucine 13 147 147,089543 internal amino acid 15 Hyp hydroxyproline 131 131,0582428 internal amino acid 16 Iva isovaline 11 117 117,078978 internal amino acid N17 LAU lauric acid leucine 12 24 200 200,177629 terminal fatty acid 13 131 131,094628 internal amino acid or isoleucine 18 Lxx (isobaric) (2R)-methyl- 19 MDA decanoic acid N11 22 186 186,161979 terminal fatty acid 15 145 145,110278 internal amino acid 10 13 179 179,094628 internal amino acid N-methyl20 MeLeu leucine N-methyl- 21 MePhe phenylalanine 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 22 MePro methyl-proline 12 130 130,086803 internal amino acid 11 1 113 113,0840636 internal amino acid N-methylvaline 23 MeVal - -(4S,2E)-4methylhex-2- 24 MHA enoic acid N7 12 128 128,083729 terminal fatty acid 2-methyl-N-1oxooctanoic acid; 1-2- methyl-1oxooctanoic 25 MOO acid N9 18 158 158,130679 terminal fatty acid 2-methyl 3-oxo tetradecanoic acid; 1-2- methyl-1,3dioxotetradecan 26 MOTDA oic acid N15 28 256 256,203844 terminal fatty acid N1-methylpropane-1,227 MPD diamine myristic C4 12 0 88 88,100048 MYR amine acid, tetradecanoic 28 terminal acid N14 28 228 228,208929 terminal fatty acid N29 Oc octanoic acid 16 144 144,115029 N-1-oxo-430 ODec decenoic acid PDA diamine fatty acid N10 18 170 170,130679 propyl-1,331 terminal terminal fatty acid C3 10 11 0 74 74,084398 terminal amine ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2-(2-amino-3phenylpropyla 32 Phaol mino)ethanol 11 18 2 210 210,136827 N- amino terminal alcohol C- other 2,3,4,6,7,8hexahydro-1pyrrole[1,233 PIHPPE a]pyrimidine 13 26 0 224 224,212672 terminal residue 34 Pip pipecolic acid 11 129 129,078978 internal amino acid pyroglutamic 35 Pyr N- acid 129 129,042593 terminal amino acid C36 SBA sec-butyl-amine valine 11 0 73 73,089149 terminal amine 11 117 117,078978 internal amino acid or isovaline 37 Vxx (isobaric) (2S,3S)-3methylproline, 38 3M-Pro (cis-l-3-MePro) 12 130 130,086803 internal amino acid 39 4MPro 4-methylproline 12 130 130,086803 internal amino acid C- other terminal residue N- other terminal residue 2-[3-(4-Aminobutylamino)propylamino]ABAPABEA 40 41 - Ac 1-benzylethylamino- acetic acid 16 29 4 0 0 277 60 277,239221 60,021129 1-aminocyclopropane42 ACC carboxylic acid lipoamino 12 101 101,047678 internal acid ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (2S,8R,9R)-2amino-8,9dihydroxydecan 43 Add oic acid lipoamino 10 21 219 219,1470574 cyclo acid L-2-amino9,10-epoxy-8hydroxydecanoi 44 Ahe c acid lipoamino 10 19 217 217,131407 cyclo acid (2S, 4S, 6S)-2amino-6hydroxy-4methyl-8oxodecanoyl(2S , 4S, 6S)-2- amino-6hydroxy-4methyl-8oxodecanoic 45 AHMOD acid lipoamino 11 21 231 231,147057 internal acid 2-amino-5hydroxy-4methyl46 AHMP pentanoic acid lipoamino 13 147 147,089543 internal acid 103 103,063328 internal amino acid C- other terminal residue alphaaminoisobutyric acid, 2-methyl47 Aib alanine 2-[(2´aminopropyl)methylamino]ethanol, 48 AMAE, Tdol trichodiaminol 16 13 132 132,126263 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2-amino-4methyl49 AMD decanoic acid lipoamino 11 23 201 201,172878 internal acid 2-amino-4methyl-8oxodecanoic 50 AMO2 acid lipoamino 11 21 215 215,152143 internal acid 2-amino-8hydroxy-4methyl51 AMO3 decanoic acid lipoamino 11 23 217 217,167793 internal acid 2-amino-6methoxy-4methyl-8oxodecanoic 52 AMO4 acid lipoamino 12 23 245 245,162707 internal acid 2-amino-4methyl-8oxodec-6-enoic 53 AMOD acid lipoamino 11 19 213 213,136493 internal acid 2-amino-8oxodecanoic 54 Aod acid lipoamino 10 19 201 201,136493 cyclo acid 2-amino-9acetyl-8oxodecanoic 55 Aod-Oac acid lipoamino 12 21 259 259,141972 cyclo acid L-2-amino9,10-epoxy-8oxodecanoic 56 Aoe acid lipoamino 10 17 14 215 215,115757 cyclo acid ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP N-/Cterminal 57 Ala alanine 89 89,047678 , internal amino acid N-/Cterminal 58 Arg arginine 14 174 174,111675 , internal amino acid N-/Cterminal 59 Asn asparagine 132 132,053492 , internal amino acid N-/Cglutamic 60 Glu acid (glutamate) terminal 147 147,053157 , internal amino acid N-/Cterminal 61 Gln glutamine 10 146 146,069142 , internal amino acid N-/Cterminal 62 Gly glycine 75 75,032028 , internal amino acid N-/Cterminal 63 Ile isoleucine 13 131 131,0946282 , internal amino acid N-/Cterminal 64 Leu leucine 13 131 131,0946282 , internal amino acid N-/Cterminal 65 Lys lysine 14 2 146 146,1055272 , internal amino acid N-/Cterminal 66 Phe phenylalanine 11 15 165 165,0789782 , internal amino acid ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP N-/Cterminal 67 Pro proline 115 115,063328 , internal amino acid N-/Cterminal 68 Ser serine 105 105,042593 , internal amino acid N-/Cterminal 69 Thr threonine 119 119,058243 , internal amino acid N-/Cterminal 70 Trp tryptophan 11 12 2 204 204,0898772 , internal amino acid N-/Cterminal 71 Tyr tyrosine 11 181 181,073893 , internal amino acid N-/Cterminal 72 73 Val Alaol valine alaninol 11 1 0 117 75 117,078978 75,0684136 , internal amino acid C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol alphaaminoisobutyric 74 75 Aibol Prool acid-alcohol prolinol valinol 76 77 Vxxol Valol isovalinol valinol 11 11 1 1 0 89 101 89,0840636 101,0840636 / 5 13 13 1 16 1 0 103 103 103,0997136 103,0997136 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 78 Ivaol isovalinol leucinol 79 80 81 82 83 84 Lxxol Leuol Ileol Pheol Argol Trpol 13 1 103 103,0997136 / isoleucinol leucinol isoleucinol phenylalaninol argininol tryptophanol 6 11 15 15 15 13 16 14 1 1 1 1 0 0 0 117 117 117 151 160 190 117,1153636 117,1153636 117,1153636 151,0997136 160,1324106 190,1106126 C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol C- amino terminal alcohol N1-(2-amino-3phenylpropyl)s 85 86 APPS Serol permidine serinol C16 30 17 0 278 90 278,247046 90,0555032 terminal amine C- amino terminal alcohol ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC E: Phổ HPLC – MS chủng nấm Trichoderma TC25 TC15 18 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình Phổ phân tích HPLC-MS chủng Trichoderma TC15 19 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình Phổ phân tích HPLC-MS chủng Trichoderma TC25 20 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 21 ... lên men nấm Trichoderma ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng long? ?? Mục đích nghiên cứu Tách chiết hợp chất kháng sinh dịch lên men nấm Trichoderma ứng dụng phòng trừ nấm gây bệnh. .. dịch chiết thô phương pháp sắc ký Khảo sát khả kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum từ dịch chiết kháng sinh có chủng nấm Trichoderma TC25 TC15 Kết cấu đề tài ? ?Tách chiết hợp chất kháng sinh dịch. .. thiệu chủng nấm gây bệnh đốm trắng long 1.4.1 Giới thiệu bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng (đốm nâu) loại bệnh nguy hiểm long, bệnh hại cành gây thiệt hại kinh tế lớn cho nhiều vùng trồng long bà 27