Beta Thalassemia là bệnh thiếu máu tan máu bẩm sinh gây ra bởi sự bất thường về di truyền trên gen beta-globin (HBB) để lại hậu quả nghiêm trọng về sức khỏe, ảnh hưởng tới giống nòi và là gánh nặng cho gia đình và xã hội. Xét nghiệm phát hiện sớm người mang gen bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện nay sử dụng chứng dương tách chiết từ máu của người mang đột biến, dẫn tới sự không đồng nhất về chất lượng, sự thiếu hụt nguồn chứng dương đặc biệt là những đột biến hiếm.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TẠO THƯ VIỆN CHỨNG DƯƠNG CHO XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN BỆNH BETA THALASSEMIA Bạch Thị Như Quỳnh1,, Nguyễn Hải Bằng1, Hà Thị Thu2 Nguyễn Văn Thảnh1, Dương Quốc Chính3 Trường Đại học Y Dược Hải Phòng Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam Viện Huyết học truyền máu Trung ương Beta Thalassemia bệnh thiếu máu tan máu bẩm sinh gây bất thường di truyền gen beta-globin (HBB) để lại hậu nghiêm trọng sức khỏe, ảnh hưởng tới giống nòi gánh nặng cho gia đình xã hội Xét nghiệm phát sớm người mang gen bệnh kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng chứng dương tách chiết từ máu người mang đột biến, dẫn tới không đồng chất lượng, thiếu hụt nguồn chứng dương đặc biệt đột biến Mục tiêu: tạo thư viện chứng dương cho đột biến gen HBB Đối tượng phương pháp: 1456 bệnh nhân tiến hành sàng lọc phát người mang gen bệnh Gen bệnh sau phát tạo dòng gen tế bào E Coli với chủng DH5α, nuôi cấy tăng sinh để tạo thư viện chứng dương Kết quả: áp dụng công nghệ DNA tái tổ hợp, từ mẫu DNA có bệnh nhân dương tính với beta thalassemia, nghiên cứu tạo nguồn thư viện gồm mẫu đối chứng dương tính đột biến gen HBB bao gồm: CD17, CD41/42, CD26, CD71/72, CD95, -28, IVS1.1 IVS1.5 Từ khóa: Beta Thalassemia, Thư viện chứng dương, Công nghệ DNA tái tổ hợp I ĐẶT VẤN ĐỀ Beta Thalassemia (còn gọi bệnh tan máu bẩm sinh), bệnh lý huyết học di truyền liên quan đến bất thường hemoglobin (một protein cấu trúc hồng cầu có chức vận chuyển oxy) Bệnh Beta Thalassemia xuất xảy đột biến gen lượng chuỗi β cho kiểu hình β+ hai đột biến đoạn gen làm khả tổng hợp chuỗi β cho kiểu hình β0 Tại Hải Phòng, từ năm 2018 đến áp dụng quy trình multiplex PCR chẩn đốn đột biến gen gây bệnh thalassemia (2; 3) Trong quy trình loại HBB phân bố NST 11 với chiều dài khoảng 45kb Ở bệnh nhân Thalassemia, hồng cầu bị phá vỡ mức dẫn đến tình trạng thiếu máu gây hậu nghiêm trọng đến giống nòi Theo thống kê có khoảng 380 dạng đột biến gen β globin liên quan tới bệnh Beta Thalassemia, chia thành trường hợp: đột biến làm giảm tổng hợp số đột biến phổ biến gây bệnh liên quan đến bệnh β-Thalassemia khu vực Đông Nam Á Việt Nam lựa chọn bao gồm: CD17 (A→T), CD41/42 (-TTCT), CD26 (G→A) (HbE), CD71/72 (+A), -28 (A→G), CD95 (+A), IVSI-1 (G→T), IVSI-5 (G→C), IVSI-1, IVSI-5 -28.1-5 Theo tiêu chuẩn xét nghiệm đột biến gen kỹ thuật sinh học phân tử, chứng dương (positive control) chạy kèm xét nghiệm yếu tố bắt buộc phải có để kiểm sốt độ tin cậy kết Vậy nguồn chứng dương thu thập từ đâu cách vấn đề mà người làm xét nghiệm chẩn đoán thực quan tâm Những yêu cầu Tác giả liên hệ: Bạch Thị Như Quỳnh Trường Đại học Y Dược Hải Phòng Email: btnquynh@hpmu.edu.vn Ngày nhận: 25/10/2021 Ngày chấp nhận: 03/11/2021 TCNCYH 151 (3) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC dẫn đến thiếu hụt nghiêm trọng mẫu DNA dương tính đặc biệt mẫu đột biến chứng dương sử dụng Việt Nam tách chiết từ máu bệnh nhân mang đột biến gen beta thalassemia Xuất phát từ lý tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm tạo thư viện gồm mẫu đối chứng dương tính tám loại đột biến gen HBB công nghệ DNA tái tổ hợp II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu Tám loại đột biến: CD17, CD41/42, CD26, CD71/72, CD95, IVS1-1, IVS1-5 -28 thu thập từ 1456 bệnh nhân được chẩn đoán mắc Thalassemia dựa dấu hiệu lâm sàng, số hóa sinh, huyết học, điện di huyết sắc tố điển hình bệnh Khơng thu nhận mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nhũ nhi tháng tuổi mẫu bệnh phẩm có số hoá sinh, huyết học điện di huyết sắc tố khơng điển hình; bệnh nhân khơng đồng ý chấp thuận tham gia nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành Labo công nghệ cao - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng - 72A Nguyễn Bỉnh Khiêm - Ngơ Quyền - Hải Phịng Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2019 đến tháng 3/2021 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu mẫu Phương pháp lấy mẫu thuận tiện, mL máu ngoại vi bệnh nhân nghi ngờ mang đột biến gen beta-thalassemia thu thập vào ống chống đông EDTA Phương pháp tách chiết DNA DNA tổng số tách chiết từ máu toàn phần theo kit Blood DNA Mini Kit (OMEGA) Tất mẫu sau tách chiết tiến hành đo nồng độ độ tinh máy đo quang phổ Nanodrop Chỉ mẫu có tỷ số A260/ A280 ≥ 1,8 đạt yêu cầu độ tinh 10 sử để phân tích Phương pháp khuếch đại gen Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thừa hưởng từ nghiên cứu: “Xây dựng quy trình phát đột biến gen Thalassemia Hải Phòng dựa kỹ thuật multiplex PCR” Trong số cặp mồi phát đột biến CD17; CD95; CD71/72; -28 IVS1.1 nhóm nghiên cứu thiết kế, cải biên từ cơng trình nghiên cứu trước Các cặp mồi lai: CD41/42; IVS1.5; CD26 sử dụng trình tự cơng bố Liên đoàn Thalassemia giới Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20µL) gồm: GoTaq Hot Start Master Mix 2X, pmol primer, 100 - 150 ng DNA khn Chu trình nhiệt: 94°C/5 phút, 37 chu kỳ [94°C/30 giây Tgm/30 giây - 72°C/30 giây], 72°C/5 phút Bảo quản 4°C Nhiệt độ gắn mồi (Tm) 62oC cho đột biến CD17, CD41/42, IVS1.1, IVS1.5 CD95 63oC cho đột biến CD26, CD71/72 -28 Sản phẩm sau phản ứng tiến hành điện di gel agarose 2,5%, 100 Vol vòng 30 phút.6 Tạo dòng gen Sản phẩm gen đột biến gắn vào vector tách dòng PCR2.1 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5 - α Các dòng tế bào sàng lọc kỹ thuật enzyme cắt giới hạn; kỹ thuật PCR thực giải trình tự gen hệ thống ABI 3500 để khẳng định dòng tế bào tái tổ hợp chứa đột biến gen mong muốn Kỹ thuật cấy chuyển sau 10 lần nuôi cấy sau tháng lưu giữ nhiệt độ -80o thực để kiểm tra tính bảo tồn gen dịng tế bào tái tổ hợp Kết giải trình tự so sánh với trình tự tham chiếu ngân hàng gen phần mềm BioEdit Ngoại kiểm Từ dòng tế bào tái tổ hợp bảo quản nhiệt độ -80o, chứa loại đột biến gen HBB, lựa chọn ngẫu nhiên đại diện cho dạng đột biến để tách chiết thu nhận DNA plasmid DNA plasmid sử dụng làm đối TCNCYH 151 (3) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III KẾT QUẢ chứng dương cho quy trình chẩn đốn đột biến gen gây bệnh thalassemia kỹ thuật multiplex PCR Quy trình có sử dụng mẫu DNA mẫu máu bệnh nhân mang đột biến gen HBB tương ứng với loại đột biến để đối sánh Kết phân tích so sánh nguồn chứng dương từ mẫu máu bệnh nhân nguồn chứng dương tái tổ hợp độ đặc hiệu nồng độ sản phẩm PCR sau thực phản ứng multiplex PCR Nồng độ DNA đo phương pháp quang phổ kế Độ đặc hiệu phản ứng kiểm tra kỹ thuật điện di gel Agarose Sàng lọc đột biến gen HBB kỹ thuật Multiplex-PCR Từ 200 mẫu DNA thu từ 200 bệnh nhân chẩn đoán mang gen bệnh thalassemia bệnh viện Trường Đại học học Y dược Hải Phòng bệnh viện Phụ sản Hải Phịng, chúng tơi thực phản ứng multiplex PCR Kết có 59 bệnh nhân mang gen β-thalassemia gồm loại đột biến Trong số đột biến, Cd26 chiếm tỉ lệ cao nhất: 45,7%, đột biến CD17, CD71/72, CD41/42 với tỉ lệ tương ứng là: 17,0%, 15,2%, 11,9% Đối với Để hai loại đột biến IVS1.1, IVS1.5, phối hợp với Viện Huyết học Truyền máu Trung ương để tiến hành sàng lọc 1256 bệnh nhân Với 1256 bệnh nhân sàng lọc, ghi nhận trường hợp mang đột biến IVS1.1 trường hợp mang đột biến IVS1.5 với tỉ lệ 0,08% Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ tuyệt đối quy định đạo đức nghiên cứu y sinh Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu hồn tồn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia Bệnh nhân thông báo kết xét nghiệm gen để giúp cho bác sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật NC 1.1 Kết tổng hợp đoạn gen chứa đột biến gây bệnh kỹ thuật PCR M NC 26 M Hình Kết PCR khuếch đại đột biến gen HBB M100: Maker 100bp, NC: Negative Control, 1.1: đột biến IVS1.1, 26: đột biến CD26 Bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu tương ứng cho đột biến CD17, CD41/42, CD26, CD71/72, CD95, -28, IVS1.1 IVS1.5 để khuếch đại DNA bệnh nhân mang đột biến Kết PCR khuếch đại số loại đột biến beta-thalassemia minh họa Hình TCNCYH 151 (3) - 2022 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết diện di gel agarose 2,5% cho thấy sản phẩm PCR thu (tương ứng với loại đột biến) băng sáng nhất, rõ nét, kích thước với kích thước mồi khuếch đại; mẫu chứng âm khơng có vạch chứng tỏ phản ứng khơng bị nhiễm DNA ngoại lai Các sản phẩm PCR đảm bảo chất lượng cho kỹ thuật Kết tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang đột biến Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng loại đột biến gen HBB gắn vào vector tách dòng pCR 2.1/TA cloning (Invitrogen) biến nạp vào tế bào E.coli - DH5α Tế bào E.coli - DH5α sau biến nạp phát triển môi trường LB lỏng Dịch nuôi cấy cấy trải mơi LB agar (100 μl/đĩa) có bổ sung Amp; Xgal IPTG (Hình 2) Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu xanh Hình Kết cấy chọn lọc môi trường LB Amp=Xgal = IPTG Khuẩn lạc xanh: tế bào không nhận gen đột biến; Khuẩn lạc trắng: tế bào có khả nhận gen đột biến Lựa chọn khuẩn lạc màu trắng khuẩn lạc màu xanh đĩa môi trường tương ứng với loại đột biến để tiến hành tách DNA plasmid sử dụng enzyme cắt giới hạn để chọn lọc plasmid mang đột biến gen mong muốn Sản phẩm sau điện di gel agarose 1,5% (Hình 3) Hình Kết cắt chọn lọc DNA plasmid enzyme giới hạn Đường chạy M: Maker 100bp; X: khuẩn lạc xanh; 17.1-17.4: dòng tế bào mang plasmid pP/ CD17; 71.1-71.5: dòng tế bào mang plasmid pB/CD71/72; 41.2-41.3: dòng tế bào mang plasmid pB/CD41/42; 26.3: dòng tế bào mang plasmid pB/CD26; 28.4: dòng tế bào mang plasmid pB/-28; 95.1-95.4: dòng tế bào mang plasmid pB/CD95; I1.1-I1.5: dòng tế bào mang plasmid pB/ IVS-I.1; I5.1-I5.5: dòng tế bào mang plasmid pB/IVS.I.5 12 TCNCYH 151 (3) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Quan sát ảnh điện di thấy rằng, DNA plasmid sau cắt đường chạy: 17.1-17.3; 71.3-71.5; 41.2-41.3; 26.3; 28.4; 95.1-95.3; I1.1-I1.5; I5.1-I5.5 xuất băng rõ rệt có kích thước tương ứng với kích thước đoạn gen đích gắn vào vecto Giải trình tự dịng tế bào mang đột biến Sản phẩm phản ứng PCR từ DNA plasmid tách chiết từ dòng tế bào tái tổ hợp tiến hành xác định trình tự Kết giải trình tự máy ABI 3500 cho thấy tín hiệu giải trình tự gen đặc hiệu, rõ nét, khơng xuất tín hiệu nhiễu Từ trình tự gen thu nhận được, tiến hành phân tích phần mềm BioEdit Hình Đại diện kết phân tích trình tự gen đột biến CD71/72 phần mềm Bio Edit TCNCYH 151 (3) - 2022 13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết kiểm tra tính bảo tồn gen đột biến đối Chọn ngẫu nhiên dòng tế bào tái tổ hợp cho loại đột biến để tiến hành hoạt hóa mơi trường nghèo dinh dưỡng Sau thực cấy chuyển dịng tế bào môi trường LB lỏng đến lần thứ 10 Sau lần cấy chuyển tiến hành đo mật độ phát triển tế bào bước sóng 600 nm để đánh giá khả phát triển tế bào sau lần nuôi cấy Kết sau lần cấy chuyển, mật độ tế bào đạt OD600 khoảng 5,9 - 6,3 sau thời gian 2,5h - 3h Và sau lần cấy chuyển, tế bào thu lại để tiến hành kiểm tra kỹ thuật PCR Các tế bào sau 10 lần nuôi cấy chứa đột biến tương ứng đưa vào ban đầu Kết ngoại kiểm chứng dương tái tổ hợp Các dịng tế bào tái tổ hợp sau chuyển đến Viện Huyết học Truyền máu Trung Ương để đánh giá Kết ngoại kiểm thể Bảng Bảng Kết ngoại kiểm chứng dương tái tổ hợp kỹ thuật Multiplex-PCR Nồng độ DNA (ng/mL) STT Mã số Trước phản ứng Sau phản ứng Độ đặc hiệu phản ứng Mẫu máu bệnh nhân Tế bào tái tổ hợp Mẫu máu bệnh nhân Tế bào tái tổ hợp Mẫu máu bệnh nhân Tế bào tái tổ hợp CD17-R 63 1,8 831,6 1247 +++ ++++ CD41/42-R 86 1,8 867 1201 ++ ++++ CD26-R 106,3 1,8 846,6 1519 + ++++ CD71/72-R 100 1,8 831 1256 ++ ++++ -28-R 89 1,8 790 1198 + ++++ CD95-R 124 1,8 824 1255 ++ ++++ IVSI.1-R 69 1,8 810 1220 + ++++ IVSI.5-R 65 1,8 819 1230 + ++++ (“+”, “++”,“+++”,“++++”: mức độ đặc hiệu phản ứng multiplex-PCR) Có đồng kết xác định đột biến DNA tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân DNA tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp cho kết ổn định đặc hiệu IV BÀN LUẬN Từ 200 mẫu bệnh phẩm thu nhận Hải Phòng sàng lọc mẫu bệnh phẩm mang loại đột biến CD17; CD41/42; CD95; CD71/72; -28 CD26 Để sàng lọc loại đột biến IVS.I1 IVS.I5, phải thực 14 số lượng mẫu tương đối lớn 1246 mẫu tỉ lệ dương tính 0,08% Với tỉ lệ dương tính thấp hai loại đột biến cộng đồng, việc tạo nguồn chứng dương đường tái tổ hợ cần thiết Các đột biến tổng hợp kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu quy trình tối ưu hoá từ đề tài nghiên cứu trước nhóm tác giả, sản phẩm PCR thu đặc hiệu.5 Sự hình thành hai loại khuẩn lạc xanh TCNCYH 151 (3) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC trắng mơi trường chọn lọc có bổ sung Amp, Xgal IPTG tồn hai loại tế bào: loại nhận gen đột biến loại không nhân gen đột biến Theo thiết kế, vectơ vectơ pCR®2.1 mang gen lac-Z tổng hợp nên b-galactosidase có khả chuyển hóa X-gal thành hợp chất có màu xanh Do đó, tế bào nhận vectơ pCR®2.1 tự đóng vịng có gen lac-Z hoạt động thường tạo enzyme b-galactosidase chuyển hóa X-gal nên khuẩn lạc có màu xanh Những khuẩn lạc chứa hai vị trí cắt giới hạn EcoR I.8 Trong nghiên cứu này, sử dụng enzyme cắt giới hạn E.coRI, enzyme có vị trí cắt sát bên với sản phẩm PCR (trình tự khuếch đại gen đích) chèn Vị trí cắt hai đầu gen đích cách gen đích khoảng 5bp, gen đích cắt khỏi vector tách dịng, kích thước gen đích gần khơng thay đổi hình ảnh điện di Khác với nghiên cứu Wen Wang cs, họ sử dụng vector T pBluescrip (Stratagen) trình tách trắng nhận plasmide tái tổ hợp có đoạn DNA ngoại lai xen vào lac promoter gen cấu trúc lac-Z operon Lac nên lac promoter bị bất hoạt.7 Chọn lọc plasmid tái tổ hợp (chứa đột biến mong muốn) kỹ thuật sử dụng enzyme cắt giới hạn cho hiệu suất cao từ tổng số khuẩn lạc màu trắng thu cho loại đột biến (Bảng 1) Vector tách dịng pCR 2.1, sau vị trí promoter đoạn lacZα mã hóa cho 146 axit amin enzym β-galactosidase, vùng cắt gắn đa vị thiết kế đoạn với 15 vị trí cắt enzym hạn chế, dịng gen thực tạo chứng dương cho đột biến gen alpha Thalassemia Sở dĩ đột biến alpha thường đột biến xố đoạn với kích thước lớn, phù hợp với việc sử dụng vector pBluescrip (Stratagen) đột biến điểm gen HBB.9 Chúng sử kỹ thuật PCR để sàng lọc cho dòng tế bào tái tổ hợp Kết khơng có sai khác hai phương pháp PCR cắt Enzyme giới hạn (Bảng 2) Hiệu suất chọn lọc tính số khuẩn lạc trắng mang gen đột biến tổng số khuẩn lạc trắng thu cho loại đột biến Bảng So sánh hiệu suất chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp kỹ thuật sử dụng Enzyme cắt giới hạn PCR STT Plasmide Hiệu suất chọn lọc Hiệu suất chọn lọc PCR enzyme cắt giới hạn (%) (%) pB/ CD17 35 35 pB/ CD41/42 34 34 pB/ CD26 20 20 pB/ CD71/72 22 22 pB/ -28 18 18 pB/ CD95 44 44 pB/ IVSI-1 48 48 pB/ IVSI-5 50 50 TCNCYH 151 (3) - 2022 15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết giải trinh tự gen từ dòng tế bào tái tổ hợp khẳng định dòng tế bào tái tổ hợp thu có chứa đột biến mong muốn Phân tích kết giải trình tự gen bằng phần mềm BioEdit, so sánh với trình tự gen đột biến NCBI nhận độ tương đồng cao: 99 - 100% (Bảng 3) Bảng So sánh trình tự gen đột biến gen HBB STT Tên đột biến Mã số Genbank Độ tương đồng với gene nghiên cứu CD41/42 EU 760925 100% CD95 KR 028331 99% CD71/72 MK 476941 99% -28 MK 476491 100% Mã số Genbank Độ tương đồng với gene nghiên cứu STT Tên đột biến CD17 GU 324922 99% CD26 MK 476504 99% IVS.I1 AH 001475 100% IVS.I5 MK 476464 99% Các dòng tế bào tái tổ hợp thực tăng sinh 10 lần liên tục không xảy tượng đào thải gen nhận khẳng định thành công nghiên cứu Bernacki S H cộng nghiên cứu tạo dòng tế bào mang chứng dương cho đột biến rối loạn di truyền thực tăng sinh tế bào qua 20 lần để loại trừ dòng tế bào bị đào thải gen đột biến Kết phần lớn dịng tế bào có tính ổn định cao Tuy nhiên có số phần trăm nhỏ dịng tế bào khơng đảm bảo sức sống khơng đảm bảo tính ổn định gen đột biến loại bỏ.9 Đối với dòng tế bào chứa loại đột biến gen HBB, chúng tơi tiếp tục kiểm tra tính bảo tồn gen sau thời gian bảo quản nhiệt độ -800 C kết thật khả quan tất dịng tế bào hồn tồn khơng xảy tượng đào thải gen nhận Các dòng tế bào tái tổ hợp mang loại đột biến gen HBB gửi tới Labo xét 16 nghiệm Di truyền - Sinh học Phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương để đánh giá thử nghiệm Kết cho thấy nguồn chứng dương tạo đường tái tổ hợp ổn định đặc hiệu so sánh với đối chứng dương mẫu máu người mang gen bệnh Khi thực phản ứng multiplex PCR, nồng độ DNA khn từ dịng tế bào tái tổ hợp thấp (1,8 ng/mL) so với nồng độ DNA khuôn tách chiết từ mẫu máu toàn phần người mang gen bệnh (CD17- 63 ng/ml) Đặc biệt việc sử dụng chứng dương tạo theo kỹ thuật tái tổ hợp loại bỏ sản phẩm không đặc hiệu thường xuất từ chứng dương mẫu máu người mang đột biến V KẾT LUẬN Chúng thành công việc tạo thư viện chứng dương 08 loại đột biến gen HBB: CD17, CD41/42, CD26, CD71/72, CD95, TCNCYH 151 (3) - 2022 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC -28, IVS1.1 IVS1.5 Đây nguồn chứng dương ổn định, cần thiết để thay cho nguồn chứng dương từ mẫu bệnh phẩm phòng thí nghiệm chẩn đốn phân tử Sản phẩm đưa giải pháp thay nhanh chóng, chi phí thấp, cho đột biến di truyển khác mà chưa tạo dòng tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO Kazazian HJ, Dowling C, Waber P, Huang S, Lo W The spectrum of beta-thalassemia genes in China and Southeast Asia Blood 1986;68(4):964966 doi:10.1182/blood.V68.4.964.964 Nopparatana C, Panich V, Saechan V, et al The spectrum of beta-thalassemia mutations in southern Thailand Southeast Asian J Trop Med Public Health 1995;26 Suppl 1:229-234 Molecular analysis of β-thalassemia in South Vietnam Svasti 2002 American Journal of Hematology; Wiley Online Library Accessed November 2, 2021 https://onlinelibrary.wiley com/doi/abs/10.1002/ajh.10193 Lê Hồng Thu Nghiên cứu đặc điểm gen đột biến bệnh nhân Beta-Thalassemia Hải Phòng Published online 2017 Accessed October 18, 2021 http://125.212.201.8:6008/ handle/DHKTYTHD_123/5220 Lê Hồng Thu Áp dụng kỹ thuật PCR để xác định đột biến gen bệnh nhân nghi ngờ beta-thalassemia Hải Phòng 2017;458 Sambrook, J Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed Addgene - Analyze Sequence Accessed November 2, 2021 https://www.addgene.org/ browse/sequence_vdb/2283/ Wang W, Tan ASC, Chong SS “Reconstituted” α-Thalassemia Genomic Samples as Positive Controls for the Molecular Diagnostic Laboratory Clinical Chemistry 2002;48(6):952-955 doi:10.1093/ clinchem/48.6 952 Genetically Characterized Positive Control Cell Lines Derived from Residual Clinical Blood Samples Clinical Chemistry Oxford Academic Accessed October 18, 2021 https://academic.oup.com/clinchem/article/51/ 11/2013/5629754?login=true Summary GENETIC LIBRARY OF MUTATIONS FOR BETA THALASSEMIA Beta thalassemia is an inherited blood deficit disease caused by genetic disorders in betaglobin gene It leads to severe health problems for infected individuals as well as the society Early detection of genetic carriers is done by molecular analysis techniques that compare blood sample with positive control extracted from people with the rare genetic mutations However, one drawback is the lack of homogeneity in quality and source of positive control, especially of rare mutations The objective of this study was to create a genetic library of positive control of mutations of HBB gene A total of 1456 patients diagnosed with beta thalassemia were screened and tested for genetic carriers Detected genes were inserted into E coli cells with DH5α strain for expansion to create positive control library By using recombinant DNA technology using the available DNA of beta thalassemia positive patients, the study has created a positive control library for mutations of HBB gene including: CD17, CD41/42, CD26, CD71/72, CD95, -28, IVS 1.1 and IVS 1.5 Keywords: Beta Thalassemia, positive control material, recombinant DNA technology TCNCYH 151 (3) - 2022 17 ... bệnh nhân chẩn đoán mang gen bệnh thalassemia bệnh viện Trường Đại học học Y dược Hải Phòng bệnh viện Phụ sản Hải Phịng, chúng tơi thực phản ứng multiplex PCR Kết có 59 bệnh nhân mang gen β -thalassemia. .. đột biến gen HBB gửi tới Labo xét 16 nghiệm Di truyền - Sinh học Phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương để đánh giá thử nghiệm Kết cho thấy nguồn chứng dương tạo đường tái tổ hợp ổn định... 1456 bệnh nhân được chẩn đoán mắc Thalassemia dựa dấu hiệu lâm sàng, số hóa sinh, huyết học, điện di huyết sắc tố điển hình bệnh Khơng thu nhận mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nhũ nhi tháng tuổi mẫu bệnh