Nghiên cứu xây dựng thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán bệnh alpha thalassemia

Bài viết Nghiên cứu xây dựng thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán bệnh alpha thalassemia được nghiên cứu nhằm tạo ra thư viện gồm các mẫu đối chứng dương cho 6 loại đột biến trên gen alphaglobin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.

Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HC Y DƯỢC HẢI PHÒNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG THƯ VIỆN CHỨNG DƯƠNG CHO XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA Bạch Thị Như Quỳnh1, Nguyễn Hải Bằng1, Hà Thị Thu2 Nguyễn Văn Thảnh, Vũ Thị Thu Trang1, Dương Quốc Chính3 TĨM TẮT Mục tiêu: tạo thư viện chứng dương cho đột biến gen alpha-globin Đối tượng phương pháp: từ 200 bệnh nhân chẩn đoán mang gen bệnh Thalassemia tiến hành sàng lọc nhằm phát đột biến SEA, THAI, α-4.2, α-3.7, HbCs C.2delT kỹ thuật MultiplexPCR Các gen đột biến tạo dòng tế bào E Coli với chủng DH5α, nuôi cấy tăng sinh để tạo thư viện chứng dương Các dòng tế bào tái tổ hợp tiến hành đánh giá ngoại kiểm Viện Huyết Học Truyền máu Trung ương quy trình phát đột biến gen gây bệnh alpha thalassemia kỹ thuật multiplex PCR Kết quả: Từ mẫu DNA bệnh nhân dương tính với alpha-thalassemia, nghiên cứu tạo nguồn thư viện gồm mẫu chứng dương tính đột biến gen alpha-globin bao gồm: SEA, THAI, α-4.2, α-3.7, HbCs, C.2delT Kết ngoại kiểm cho thấy nguồn chứng dương tạo đường tái tổ hợp ổn định đặc hiệu so sánh với đối chứng dương mẫu máu người mang gen bệnh Kết luận: Các chứng dương tái tổ hợp đủ tiêu chuẩn sử dụng Trường Đại học Y Dược Hải Phịng Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam Viện Huyết học truyền máu Trung ương Chịu trách nhiệm chính: Bạch Thị Như Quỳnh Email: btnquynh@hpmu.edu.vn Ngày nhận bài: 11.1.2022 Ngày phản biện khoa học: 19.3.2022 Ngày duyệt bài: 25.5.2022 12 xét nghiệm chẩn đoán bệnh alphathalassemia Từ khóa: Alpha-thalassemia, Thư viện chứng dương, Cơng nghệ DNA tái tổ hợp SUMMARY CREATING THE POSITIVE CONTROL LIBRARY FOR MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES TO DIAGNOSE OF ALPHA THALASSEMIA Objective: create a positive control library for mutations on the alpha-globin gene Subject and method: 200 patients diagnosed with Thalassemia genes were screened to detect mutations SEA, THAI, α-4.2, α-3.7, HbCs and C.2delT using Multiplex-PCR technique The mutation genes were developed in E coli cells with DH5α strain, cultured and proliferated to create the positive control library Positive controls were externally assessed at the National Institute of Hematology and Blood Transfusion using detection protocol for gene mutations causing alpha thalassemia with multiplex PCR technique Result: From the available DNA of alpha-thalassemia-positive patients, a library of positive controls of mutations in the alphaglobin gene was created, including SEA, THAI, α-4.2, α-3.7, HbCs, C.2delT External quality assessment results showed that the positive controls generated by recombinant pathway are more stable and specific comparing with the positive controls derived from human blood samples from genes carriers Conclusion: The TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 recombinant positive controls can be applied in diagnostic tests for alpha-thalassemia Keywords: Alpha-thalassemia, positive control material, recombinant DNA technology I ĐẶT VẤN ĐỀ Alpha-thalassemia bệnh lý di truyền liên quan đến bất thường protein cấu trúc có chức vận chuyển oxy hồng cầu – Hemoglobin Nguyên nhân bệnh bất thường cấu trúc số lượng gen alpha-globin nằm cánh ngắn nhiễm sắc thể số 16 [4] Tùy thuộc vào số gen alpha-globin bị bất thường dẫn tới kiểu hình thiếu máu từ nhẹ đến nặng tử vong [5] Những bệnh nhân alphathalassemia khơng có triệu chứng thường phát làm xét nghiệm sinh học phân tử bất thường gen alpha-globin, tiềm ẩn nguy di truyền gen bệnh cho hệ sau Việc phát người lành mang gen bệnh có ý nghĩa vơ to lớn tư vấn di truyền nhằm hướng tới loại bỏ hoàn toàn gen bệnh khỏi cộng đồng Thành phố Hải Phòng, từ năm 2018 đến nay, áp dụng quy trình multiplex PCR chẩn đốn đột biến gen gây bệnh thalassemia với loại đột biến phổ biến liên quan đến bệnh alphathalassemia khu vực Đông Nam Á Việt Nam bao gồm: SEA, THAI, α-4.2, α-3.7, HbCs, C.2delT [1] Theo tiêu chuẩn xét nghiệm đột biến gen kỹ thuật sinh học phân tử, chứng dương (positive control) chạy kèm xét nghiệm yếu tố bắt buộc phải có để kiểm soát độ tin cậy kết Nguồn chứng dương thu thập từ đâu cách vấn đề mà người làm xét nghiệm chẩn đoán thực quan tâm Những yêu cầu dẫn đến thiếu hụt nghiêm trọng mẫu DNA dương tính đặc biệt mẫu đột biến chứng dương sử dụng Việt Nam tách chiết từ máu bệnh nhân mang đột biến gen alpha thalassemia [2] Xuất phát từ lý tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm tạo thư viện gồm mẫu đối chứng dương cho loại đột biến gen alphaglobin công nghệ DNA tái tổ hợp II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Sáu loại đột biến: SEA, THAI, α-4.2, α3.7, HbCs C.2delT sàng lọc từ 200 bệnh nhân chẩn đoán mang gen bệnh Thalassemia Địa điểm thời gian: Nghiên cứu tiến hành Labo trung tâm - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng – Số 72A Nguyễn Bỉnh Khiêm - Ngơ Quyền - Hải Phịng Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2019 đến tháng 3/2021 Phương pháp nghiên cứu 3.1 Thiết kế nghiên cứu - Nghiên cứu thực nghiệm 3.2 Các phương pháp sử dụng nghiên - Phương pháp thu mẫu Phương pháp lấy mẫu thuận tiện, mL máu ngoại vi bệnh nhân thu thập vào ống chống đông EDTA Các mẫu thu thập dựa dấu hiệu lâm sàng, số hóa sinh, huyết học, điện di huyết sắc tố điển hình bệnh thalassemia Loại trừ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nhũ nhi tháng tuổi mẫu bệnh phẩm có số hố sinh, huyết học điện di huyết sắc tố không điển hình; bệnh nhân khơng đồng ý chấp thuận tham gia nghiờn cu 13 Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG - Phương pháp tách chiết DNA DNA tổng số tách chiết từ máu toàn phần theo kit Blood DNA Mini Kit (OMEGA) Tất mẫu sau tách chiết tiến hành đo nồng độ độ tinh máy đo quang phổ Nanodrop - Phương pháp khuếch đại gen Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thừa hưởng từ nghiên cứu: “Xây dựng quy trình phát đột biến gen Thalassemia Hải Phòng dựa kỹ thuật multiplex PCR” Thành phần phản ứng PCR (tổng thể tích 25µL) gồm: GoTaq Hot Start Master Mix 2x, pmol primer, 100 - 150 ng DNA khn Chu trình nhiệt: 95°C/3 phút, 35 chu kỳ [94°C/1 phút – 65°C /1 phút - 72°C/1 phút 30 giây], 72°C/8 phút, bảo quản 4°C Sản phẩm sau phản ứng tiến hành điện di gel agarose 1,5%, 100 Vol vòng 30 phút [1] - Tạo dòng gen Sản phẩm gen đột biến gắn vào vector tách dòng PCR2.1 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5 -  Các dòng tế bào sàng lọc kỹ thuật enzyme cắt giới hạn; kỹ thuật PCR thực giải trình tự gen hệ thống ABI 3500 để khẳng định dòng tế bào tái tổ hợp chứa đột biến gen mong muốn Thực kỹ thuật cấy chuyển sau 10 lần nuôi cấy sau tháng lưu giữ nhiệt độ -800 để kiểm tra tính bảo tồn gen dòng tế bào tái tổ hợp Kết giải trình tự so sánh với trình tự tham chiếu ngân hàng gen phần mềm BioEdit - Ngoại kiểm Các dòng tế bào tái tổ hợp đại diện cho loại đột biến tiến hành ngoại kiểm quy trình phát đột biến gen gây bệnh alpha thalassemia kỹ thuật multiplex PCR Viện Huyết học Truyền máu Trung Ương Quy trình có sử dụng mẫu 14 DNA mẫu máu bệnh nhân mang đột biến gen alpha-globin tương ứng với loại đột biến để đối sánh Kết phân tích so sánh nguồn chứng dương từ mẫu máu bệnh nhân nguồn chứng dương tái tổ hợp độ đặc hiệu nồng độ sản phẩm PCR sau thực phản ứng multiplex PCR Nồng độ DNA đo phương pháp quang phổ kế Độ đặc hiệu phản ứng kiểm tra kỹ thuật điện di gel Agarose Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ quy định đạo đức nghiên cứu y sinh thông qua Hội đồng đạo đức Trường Đại học Y dược Hải Phòng Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu hồn tồn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia Bệnh nhân thông báo kết xét nghiệm gen để giúp cho bác sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sàng lọc đột biến gen alphaglobin kỹ thuật Multiplex-PCR Từ 200 mẫu DNA thu 200 bệnh nhân chẩn đoán mang gen bệnh thalassemia bệnh viện Trường Đại học học Y dược Hải Phòng bệnh viện Phụ sản Hải Phịng, chúng tơi thực phản ứng multiplex PCR Kết có 86 bệnh nhân mang gen α-thalassemia gồm loại đột biến Trong số đột biến, đột biến SEA chiếm tỉ lệ cao nhất: 73%, đột biến 3.7, THAI, HbCs, c2delT 4.2 với tỉ lệ tương ứng là: 19.3%, 3,3%, 2,2%, 1.1% 1.1% Kết tổng hợp đoạn gen chứa đột biến gây bệnh kỹ thuật PCR TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu tương ứng cho đột biến SEA, THAI, 3.7, 4.2, HbCs c2delT để khuếch đại DNA bệnh nhân mang đột biến Kết PCR khuếch đại số loại đột biến alphathalassemia minh họa Hình Hình Hình ảnh minh họa kết PCR khuếch đại đột biến gel Alpha-globin M 1kb: marker kilobase, Pos: dương tính, NC: âm tính, 3.7: đột biến đoạn 3.7 kilobase, 4.2: đột biến đoạn 4.2 kilobase, SEA: đột biến SEA, Cs: đột biến HbCs, C2: đột biến C2DelT Kết diện di gel agarose 1.5% cho thấy sản phẩm PCR thu (tương ứng với loại đột biến) băng sáng nhất, rõ nét, kích thước với kích thước mồi khuếch đại; mẫu chứng âm khơng có vạch chứng tỏ phản ứng không bị nhiễm DNA ngoại lai Kết tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang đột biến Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng loại đột biến gen alpha globin gắn vào vector tách dòng pCR 2.1/TA cloning (Invitrogen) biến nạp vào tế bào E coli–DH5α Tế bào E coli–DH5α sau biến nạp phát triển môi trường LB lỏng Dịch nuôi cấy cấy trải mơi LB agar (100 μl/đĩa) có bổ sung Amp; Xgal IPTG (Hình 2) Hình Kết cấy chọn lọc môi trường LB Amp=Xgal = IPTG 15 Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG Khuẩn lạc xanh: tế bào không nhận gen đột biến; Khuẩn lạc trắng: tế bào có khả nhận gen đột biến Lựa chọn khuẩn lạc màu trắng khuẩn lạc màu xanh đĩa môi trường tương ứng với loại đột biến để tiến hành tách DNA plasmid sử dụng enzyme cắt giới hạn để chọn lọc plasmid mang đột biến gen mong muốn Sản phẩm sau điện di gel agarose 1.5% (Hình 3) Quan sát ảnh điện di thấy rằng, DNA plasmid sau cắt đường chạy: T2, T3, S3, S5, CS1, CS2, DEL1, 42.2 37.1 xuất băng rõ rệt có kích thước tương ứng với kích thước đoạn gen đích gắn vào vecto Hình Kết cắt chọn lọc DNA plasmid enzyme giới hạn Đường chạy M: thang ADN chuẩn; X: plasmid dòng khuẩn lạc xanh; T2-T3: dòng tế bào mang plasmid pA/THAI; S3-S5: dòng tế bào mang plasmid pA/SEA; CS1-CS2: dòng tế bào mang plasmid HbCs; DEL1-DEL2: dòng tế bào mang plasmid C2DELT; 42.2: dòng tế bào mang plasmid pA/4.2; 3.7: dòng tế bào mang plasmid 3.7 Giải trình tự dịng tế bào mang đột biến Lựa chọn Các dòng plasmid tái tổ hợp tương ứng với loại đột biến t để tách chiết 16 DNA Nồng độ ADN plasmid đo quang phổ kế Nồng độ ADN plasmid sau tách chiết tất dòng từ 119,2 ng/ μl trở lên Kết tỷ số A260/280 100% mẫu thỏa mãn khoảng giá trị 1,8-2 ADN sau tách chiết có độ tinh khiết cao đảm bảo chất lượng để tiến hành kỹ thuật giải trình tự gen Kết giải trình tự máy ABI 3500 cho thấy tín hiệu giải trình tự gen đặc hiệu, rõ nét, khơng xuất tín hiệu nhiễu Từ trình tự gen thu nhận được, tiến hành phân tích phần mềm BioEdit (Hình 4) TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Hình Đại diện kết phân tích trình tự gen đột biến Thai phần mềm Bio Edit Kết kiểm tra tính bảo tồn gen đột biến Chọn ngẫu nhiên dòng tế bào tái tổ hợp cho loại đột biến để tiến hành hoạt hóa mơi trường nghèo dinh dưỡng Sau thực cấy chuyển dịng tế bào mơi trường LB lỏng đến lần thứ 10 Sau lần cấy chuyển tiến hành đo mật độ phát triển tế bào bước sóng 600 nm để đánh giá khả phát triển tế bào sau lần nuôi cấy Kết sau lần cấy chuyển, mật độ tế bào đạt OD600 khoảng 5.9-6.3 sau thời gian 2,5h-3h Và sau lần cấy chuyển, tế bào thu lại để tiến hành kiểm tra kỹ thuật PCR Các tế bào sau 10 lần nuôi cấy chứa đột biến tương ứng đưa vào ban đầu Kết ngoại kiểm chứng dương tái tổ hợp Các dòng tế bào tái tổ hợp sau chuyển đến Viện Huyết học Truyền máu Trung Ương để đánh giá Kết ngoại kiểm thể Bảng 17 Công trình nghiên cứu KHOA HC TRNG I HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG Bảng Kết ngoại kiểm chứng dương tái tổ hợp kỹ thuật Multiplex-PCR Nồng độ DNA (ng/L) Độ đặc hiệu Trước phản ứng Sau phản ứng phản ứng (ng/l) (ng/l) STT Mã số Tế bào Tế bào Mẫu Mẫu Tế bào Mẫu tái tổ tái tổ máu BN máu BN tái tổ hợp máu BN hợp hợp SEA-R 60 1,8 812 1250 ++++ +++++ THAI-R 75 1,8 822 1211 +++ +++++ 3.7-R 102 1,8 709 1210 ++ +++++ 4.2-R 123 1,8 789 1234 ++ +++++ HbCs-R 97 1,8 806 1300 ++ +++++ C2DELT-R 64l 1,8 864 1321 + +++++ (“+”, “++”, “+++”, “++++”: mức độ đặc hiệu phản ứng multiplex-PCR) Có đồng kết xác định đột biến DNA tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân DNA tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp cho kết ổn định đặc hiệu IV BÀN LUẬN Nghiên cứu phát 86/200 mẫu dương tính với loại đột biến gen alpha globin sàng lọc, chiếm 43% Trong số đột biến, đột biến SEA chiếm tỉ lệ cao nhất: 73%, đột biến 3,7, THAI, HbCs, C2DelT -4.2 với tỉ lệ tương ứng là: 19,3 %, 3,3%, 2,2%, 1.1% 1.1% Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Đ T Q Mai (2021) 85 bệnh nhi Thalassemia điều trị bệnh viện Trẻ em Hải Phòng [3] Kết nghiên cứu tỷ lệ mang đột biến C.2delT 4.2 tương đối thấp cộng đồng (1.1%) chứng tỏ cần thiết việc tạo nguồn thư viện chứng dương Các quy trình PCR phát loại đột biến sử dụng cặp mồi đặc hiệu tương ứng nhóm tác giả tối ưu nghiên cứu trước đây, đảm bảo độ nhạy độ đặc hiệu [1] 18 Trên mơi trường ni cấy có bổ sung Amp tế bào nhận plasmid biến nạp vào phát triển giúp loại bỏ tế bào không nhận plasmid Sàng lọc dòng tế bào mang plasmid gắn gen đột biến alpha-thalassemia X-gal IPTG dựa nguyên lý: tế bào nhận vector pCR®2.1 tự đóng vịng có gen lac-Z hoạt động thường tạo enzyme galactosidase chuyển hóa X-gal thành hợp chất có màu xanh nên khuẩn lạc có màu xanh Những tế bào nhận plasmid tái tổ hợp có đoạn DNA ngoại lai xen vào lac promoter gen cấu trúc Lac-Z operon Lac nên lac promoter điều khiển gen cấu trúc phiên mã khơng có tạo thành enzyme β-galactosidase để phân hủy X-gal tạo khuẩn lạc màu trắng IPTG sử dụng với tư cách chất cảm ứng cho operon lac gắn vector pCR®2.1 [6] TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 515 - THÁNG - SỐ ĐẶC BIỆT - PHẦN II - 2022 Những dịng tế bào có khả mang gen đột biến, tiến hành cắt với enzyme cắt giới hạn vài khuẩn lạc từ dòng tế bào màu xanh làm đối chứng Kết điện di (Hình 3) 20 dòng tế bào mang đột biến SEA, 17 dòng tế bào mang đột biến HbCs, 15 dòng tế bào mang đột biến THAI, dòng tế bào mang đột biến -4.2 dòng tế bào mang đột biến -3.7 Song song với việc chọn lọc dòng tế bào mang đột biến phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để sàng lọc dòng tế bào mang đột biến Kết cho thấy có tương đồng 100% hai phương pháp Kết giải trình tự phân tích phần mềm BioEdit, trình tự sau phân tích so sánh với trình tự chuẩn tương ứng phần mềm Genebank Kết cho thấy trình tự có độ tương đồng cao (99%) (Bảng 2) Bảng So sánh trình tự gen đột biến gen Alpha-Globin Độ tương đồng với gene STT Tên đột biến Mã số Genbank nghiên cứu SEA KX4581114 99% THAI AP023476 99% -3.7 NG0000006 99% -4.2 AF221717 99% HbCs HQ156224 99% C.2delT SAF271160 99% Các dòng tế bào tái tổ hợp thực tăng sinh 10 lần liên tục không xảy tượng đào thải gen nhận khẳng định thành công nghiên cứu Phương pháp cấy chuyển để đánh giá tính ổn định tế bào tái tổ hợp Bernacki S H cộng khẳng định giá trị nghiên cứu công bố năm 2005 cho thấy sở khoa học phương pháp [7] Để khẳng định thêm tính ổn định tế bào tái tổ hợp chứa gen đột biến, nghiên cứu tiến hành kiểm tra tính bảo tồn gen sau tháng bảo quản nhiệt độ -800 C Kết cho thấy tất dịng tế bào khơng xảy tượng đào thải gen nhận Các dòng tế bào tái tổ hợp mang loại đột biến gen alpha globin đánh giá thử nghiệm Labo xét nghiệm Di truyền - Sinh học Phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương – đơn vị đầu nghành việc chẩn đoán phát bệnh máu Việt Nam Kết cho thấy nguồn chứng dương tạo đường tái tổ hợp ổn định đặc hiệu so sánh với đối chứng dương mẫu máu người mang gen bệnh Khi thực phản ứng multiplex PCR, nồng độ DNA khn từ dịng tế bào tái tổ hợp thấp (1,8 ng/L) so với nồng độ DNA khn tách chiết từ mẫu máu tồn phần người mang gen bnh (SEA- 60 19 Công trình nghiên cứu KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG ng/l) Đặc biệt việc sử dụng chứng dương tạo theo kỹ thuật tái tổ hợp loại bỏ sản phẩm không đặc hiệu thường xuất từ chứng dương mẫu máu người mang đột biến V KẾT LUẬN Chúng thành công việc tạo thư viện chứng dương 06 loại đột biến gen alpha globin: SEA, THAI, -3.7, -4.2, HbCs C.2delT Đây nguồn chứng dương ổn định, cần thiết để thay cho nguồn chứng dương từ mẫu bệnh phẩm phịng thí nghiệm chẩn đoán phân tử Sản phẩm đưa giải pháp thay nhanh chóng, chi phí thấp, cho đột biến di truyển khác mà chưa tạo dòng tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO Quỳnh B.T.N., Thu L.H., Hường V.T.B cộng Áp dụng kỹ thuật PCR phát đột biến gen bệnh nhân nghi ngờ alphaThalassemia Hải phòng Y học Việt Nam, 20 2017, 461(2), 7-10 Quỳnh B.T.N., Bằng N.H., Thu H.T cộng (2022) Tạo thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán bệnh Beta Thalassemia TCNCYH, 151(3), 9– 17 Mai Đ.T.Q, Sáng N.N, Quỳnh B.T.N Xác định đột biến gen gây bệnh Thalassemia trẻ em bệnh viện Trẻ em Hải Phòng Y học Việt Nam, 2021, 509(1), 361-365 Raja Z.A.M, Ainoon O., Hafiza al et al (2014), Molecular characteristic of alpha thalassaemia among patients diagnosed in UKM Medical Centre, Malaysian J Pathol; 36(1):27 – 32 Galanello R Cao A (2011) Alphathalassemia Genet Med, 13(2), 83–88 Sambrook, J., Fritsch, E R., & Maniatis, T Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) Cold Spring Harbor.1989., NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press Bernacki S H et al, Genetically characterized positive control cell lines derived from residual clinical blood sample, Clinical Chemistry 2005 , 51:11: pp 20132024  ... gen bệnh nhân nghi ngờ alphaThalassemia Hải phòng Y học Việt Nam, 20 2017, 461(2), 7-10 Quỳnh B.T.N., Bằng N.H., Thu H.T cộng (2022) Tạo thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử chẩn. .. gen alpha- globin bị bất thư? ??ng dẫn tới kiểu hình thiếu máu từ nhẹ đến nặng tử vong [5] Những bệnh nhân alphathalassemia khơng có triệu chứng thư? ??ng phát làm xét nghiệm sinh học phân tử bất thư? ??ng... biến gen alpha globin đánh giá thử nghiệm Labo xét nghiệm Di truyền - Sinh học Phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương – đơn vị đầu nghành việc chẩn đoán phát bệnh máu Việt Nam Kết cho thấy