Công nghệ tế bào tế bào động vật và thực vật

Việc trang bị kiến thức và kĩ năng về công nghệ tế bào cho sinh viên ngành Công nghệ sinh học là điều bắt buộc trong các trường đại học có đào tạo về Công nghệ sinh học

Báo cáo chuyên đề CNSH 1

Cán bộ hướng dẫn

Ts Nguyễn Văn Thành

Nhóm 1- Công nghệ Sinh Học K35

Danh Thị Phương Nga 3092492Phạm Thị Đàm Mi 3092418Đinh Thị Bé Ngọc 3092495Nguyễn Văn Quắc

Dương Trọng Tín

Cần Thơ, tháng 09 năm 2010

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠVIỆN NC&PT CÔNG NGHỆSINH HỌC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Công nghệ sinh học đang trở thành một ngành công nghệ ứng dụng phát triển mạnh mẽ và là ngành khoa học mũi nhọn của thế kỉ 21

Công nghệ tế bào là một trong năm hướng phát triển cùa ngành công nghệ sinh học đã và đang đem lại những hiệu quả khoa học và kinh tế rất triển vọng trong sự phát triển của loài người

Việc trang bị kiến thức và kĩ năng về công nghệ tế bào cho sinh viên ngành Công nghệ sinh học là điều bắt buộc trong các trường đại học có đào tạo về Công nghệ sinh học

NỘI DUNG

GIỚI THIỆU CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

- Công nghệ tế bào

Ngày nay, việc ứng dụng phương pháp nuôi cấy tế bào hoặc mô trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo để tạo ra những mô, cơ quan hoặc cơ thể

hoàn chỉnh với đầy đủ các tính trạng của cơ thể gốc đã trở thành một

ngành kĩ thuật, có qui trình xác định, được gọi là công nghệ tế bào

2

- Lịch sử phát triển

Về công nghệ tế bào các nước đều đã sử dụng rộng rãi kỹ thuật nuôi cấy mô (tissue culture) dung hợp tế bào (cell fusion) chuyển nhân (nuclear transplantation)

nuôi cấy các tế bào gốc, và đã có rất nhiều thành tựu

A.CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

I.SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1 CẤU TẠO

Hình 1: tế bào động vật2.CHỨC NĂNG

3

II.CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GỐC

1.TẾ BÀO GỐC

a.Khái niệm: tế bào gốc là những tế bào không chuyên biệt (chưa

biệt hóa) nhưng có khả năng trở thành các tế bào chuyên biệt và chức năng mới tương ứng

b.Chức năng: tế bào gốc được sử dụng để tạo các tế bào mới thay

thế cho các tế bào già, chết tự nhiên, bị tổn thương, bị mất chức

năng hay vì nguyên nhân khác

c.Nguồn gốc

Hình 2: Tế bào

gốc phôi

Hình 3: Tế bào gốc

phôi thai Hình 4: Tế bào gốc từ cuốn rốn trẻ sơ sinh

4

Hình 5: Tế bào

gốc tủy xương Hình 6: Tế bào gốc từ răng

Hình 7: Tế bào gốc của người trưởng thành

d.Phân loại tế bào gốc

•Tế bào gốc tổng năng: mỗi tế bào có thể phát triển thành

•Ghép các tế bào gốc tạo máu trong điều trị các tình trạng khác

nhau của suy thoái hệ thống tạo máu

•Chữa trị các bệnh thuộc hệ thần kinh do sự thoái biến của các tế bào thần kinh

•Tái tạo da sau chữa trị bỏng

•Tái tạo mô cơ-xương qua thủ thuật ghép các tế bào gốc phôi

•Ứng dụng vào các thủ thuật ghép tủy xương

• Trong thẩm mỹ: Các sản phẩm chăm sóc da

Hình 8: Sản phẩm chăm

sóc da từ tế bào gốc Hình 9: Ngân hàng tế bào gốc

2.ỨNG DỤNG

6

1.CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN NẠP

GEN

a.Chuyển nhiễm Dùng calcium phostphate kết tủa ADN

b.Lipofection Sử dụng các lipid trung tính hoặc mang cation để tạo

thành các liposome Phức lipid hợp nhất với màng huyết tương sẽ phóng thích ADN dính bám vào trong phần bào tan (cytosol)

c.Xung điện

d.Vi tiêm

III.ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN

Hình 8:Thiết bị vi tiêm Hình 9: Vi tiêm DNA vào tế bào

7

(1) Gen có chức năng nào đó được lựa chọn và phân lập trong phòng thí nghiệm

(2) Một con vật cho được gây siêu bài noãn và thu hoạch phôi từ ống dẫn trứng

(3) Gen được đưa vào trứng được thụ tinh bằng kỹ thuật vi tiêm

(4) Phôi chuyển gen được đưa vào con vật nhận mà có thể cho ra đời con non có gen đã chuyển

(5) Kiểm tra con non đối với gen mới chuyển, lai tạo để tạo con non có tính ổn định di truyền về tính trạng mới

Hình 10: Quá trình vi tiêm

8

e.Dùng súng bắn gen

Sử dụng các hạt kim loại như tungsten hoặc vàng làm vi đạn Vi đạn được bọc bằng ADN và đi với một vận tốc thích hợp để xâm nhập vào tế bào đích

f.Dùng vector virus

2.CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN

Hình 11: Qui trình chuyển gen động vật

9

a.Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật

b.Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen

c.Chuyển gen vào động vật

d.Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động vật bậc cao)

e.Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen

f.Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục

3.ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT CHUYỂN GEN Ở ĐỘNG VẬT

c.Sản xuất sữa

Hình 14: Bò sữa

d.Giảm ô nhiễm photpho – Lợn enviro-pig

Hình 15: Lợn enviro-pig

e.Sản xuất Biosteel

Hình 16: Dê sản xuất biosteel

f.Động vật thủy sinh chuyển gen

Hình 17: Cá chuyển gen

11

g.Côn trùng chuyển gen

Hình 18: Ruồi dấm

12

IV.NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ

1.ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ

a.Ưu điểm

•Sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều trị hoặc chẩn đoán

•Các tế bào động vật đáp ứng được quá trình hậu dịch mã chính xác đối với các sản phẩm protein sinh-dược

(biopharmaceutical protein)

•Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen

•Sản xuất các tế bào động vật để dùng như một cơ chất in

vitro trong nghiên cứu độc chất học và dược học.

•Sản xuất các cơ quan thay thế nhân tạo-sinh học/các dụng

cụ trợ giúp

13

•Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương mỏng kết quả là chúng rất dễ bị vỡ

• Môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền

•Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt

2.CÁC DÒNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ VÀ ĐẶC ĐIỂM

CỦA NÓ

a.Các tế bào dịch huyền phù

Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền phù

(suspension cells), hoặc không dính bám khi chúng sinh trưởng

trong nuôi cấy in vitro.

14

3.MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

CÓ VÚ

b.Các tế bào dính bám

Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám (cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng) Người ta sử dụng rộng rãi các loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi

(fibroblast)

Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huyết thanh của động vật có vú

4.CÁC SẢN PHẨM THƯƠNG MẠI CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ

Các sản phẩm sinh học được sản xuất bằng tế bào động vật có vú

Nhóm I

Enzyme Urokinase, hoạt tố plasminogen môHormone Hormone sinh trưởng (GH)Các nhân tố sinh trưởng Các cytokine khác

Nhóm II Vaccine

Bệnh dại, bệnh quai bị, bệnh sởi ở người…

Veterinary-FMD vaccine, New Cattle’s Disease

Nhóm III Kháng thể đơn dòng Các công cụ chẩn đoán

Nhóm IV Virus côn trùng Thuốc trừ sâu sinh học cho Baculovirus

Nhóm V Các chất điều hòa miễn dịch Interferon và interleukin

Nhóm VI Các tế bào nguyên vẹn Thử nghiệm độc chất học

Bảng 1 Các sản phẩm quan trọng của nuôi cấy tế bào động vật

16

V.NHÂN BẢN VÔ TÍNH Ở ĐỘNG VẬT

1.KHÁI NIỆM

2.QUY TRÌNH THỰC HIỆN

Nhân bản vô tính là phương pháp sinh sản đơn không thông qua

thụ tinh (không phân biệt giới tính) Bằng phương pháp này các cá thể có thể được tạo ra từ một tế bào lấy từ nguyên bản

Hình 20: qui trình nhân bản vô tính cừu Dolly

17

Thú cảnh nuôi

3.ỨNG DỤNG

Hình 21: Bản sao Snuppy

và “bố” của nó Hình 22: Mèo CC

Hình 23: Cừu Dolly

18

Hình 25: Lợn nhân bản Hình 26: 3 thế hệ chuột nhân

bản

Hình 24: Bò nhân bản Gia súc nhân bản

19

B CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

I SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO THỰC VẬT

1 CẤU TRÚC TẾ BÀO

THỰC VẬT

2 CHỨC NĂNG TẾ BÀO

THỰC VẬT

20

II.NUÔI CẤY MÔ

1.ĐẶC ĐIỂM

a.Nuôi cấy mô: tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ

dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm

b.Cơ sở sinh lí:

•Tính toàn năng: khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây hòa

chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp

•Sự phân chia phân hóa, phản phân hóa của tế bào

Phân hóa: 1 tế bào, 1 khối tế bào phân hóa thành mô, cơ quan, hệ cơ quan

Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu ki gặp điều kiện thuận lợi 21

c.Các nhân tố đảm bảo thành công trong công nghệ nuôi cấy mô-

tế bào thực vật:

•Đảm bảo điều kiện vô trùng, phòng thí nghiệm phải chuyên hóa cao

•Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách

•Chọn mô cấy, xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy

d.Các bước trong kĩ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật

•Tạo vật liệu khởi đầu: thường chọn chồi là bộ phận nuôi cấy thích

hợp nhất khử trùng cấy trong môi trường khởi động để tái sinh

•Giai đoạn nhân nhanh: vật liệu khởi đầu được chuyển sang môi

trường nhân nhanh có bổ sung Xitokinin để tái sinh 1 thành nhiều chồi

•Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: tách riêng các chồi cho vào môi

trường tạo rể (bố sung Auxin) mỗi chồi ra rể thành 1 cây hoàn chỉnh

•Giai đoạn ra cây: cây trong ống nghiệm đủ tiêu chuẩn (chiều cao,

số lá, số rể) sẽ được chuyển sang môi trường tự nhiên 22

2.SƠ LƯỢC CÁC KỸ THUẬT DÙNG TRONG NUÔI CẤY MÔ

A Mô sẹo từ Catharanthus roseus

(B)Nuôi cấy dịch tế bào từ

Coryphanta spp (C) Nốt sần C roseus (D) Đầu rễ từ C roseus

(E)Tái sinh cây từ C roseus callus (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave

tequilana (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora (I) Nuôi cấy rễ

cây Psacalium decompositum.

Hình 27: Một số kỹ thuật dùng

trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

23

a.Nuôi cấy phôi nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là

những chất rất cần trong nuôi cấy phôi Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của

phôi nuôi cấy in vitro Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên

b.Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng ( nito, phospho, kali, calxi) và vi lượng ( Mg, Fe, Mn, Co,Zn, )

Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B1, B6, B3, ) và các chất điều hoà sinh trưởng

Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol 24

c Nuôi cấy mô phân sinh

Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0,1mm÷ 1cm

Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch

virus và nhân giống invitro Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử

dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin

d Nuôi cấy bao phấn

Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan

e Nuôi cấy tế bào đơn

Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc

xử lý enzym Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau

25

f Nuôi cấy protoplast

Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast có thể tạo ra các cây lai soma Ngoài ra còn có thể

sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene

3 ỨNG DỤNG

a Nhân giống vô tính với quy mô lớn

b Củ khoai bi và hạt giống nhân tạo

c Sản xuất cây giống sạch mầm bệnh

d Lập ngân hàng gen thực vật 26

Hình 31: Trầu bà chân vịt

nuôi cấy mô Hình 30: Nuôi cấy mô sâm Ngọc Linh

Hình 28: Phôi vô tính

III.NUÔI CẤY PHÔI THỰC VẬT

1.NUÔI CẤY PHÔI HỮU TÍNH

2.NUÔI CẤY PHÔI VÔ TÍNH

a.Đặc điểm

Có 2 sự kiện quyết định liên quan đến chương trình sớm của quá trình phát triển:

- Cảm ứng biệt hóa tế bào của những tế bào tiền phôi

- Biểu hiện trình tự phát triển ở các tế bào tiền phôi

28

Các phôi phát triển qua các giai đoạn liên tiếp của hình thành phôi bao gồm : giai đoạn hình tim, hình cầu, hình cá đuối.

Hình 33: Các giai đoạn liên tiếp phát triển của phôi vô tính.

29

•Các chất điều hòa sinh trưởng

c.Hạt nhân tạo: các phôi vô tính hình thành trong nuôi cấy được

bao bọc bằng một vỏ chứa chất dinh dưỡng và những chất bổ sung khác tạo ra các hạt nhân tạo (Demarly, 1986 ; Redenbaugh và

cộng sự, 1986)

Hình 34: Hạt khoai tây nhân tạo

b.Các nhân tố ảnh hưởng đến phát sinh phôi

30

3.ỨNG DỤNG

a.Ứng dụng của nuôi cấy phôi hữu tính:

•Thu nhận thể đơn bội

•Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt

•Nhân giống các cây hiếm

•Thụ phấn trong ống nghiệm

b.Ứng dụng của nuôi cấy phôi vô tính

•Nhân giống nhanh và dễ dàng

•Tạo củ siêu nhỏ (micro), hạt nhân tạo, công nghệ hóa quá trình nhân giống, vườn ươm và xây dựng mô hình trồng thử

IV.NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

Tế bào trần là tế bào thực vật bị loại bỏ vách bởi 1 xử lý enzyme Đó là tế bào tự do, cô lập, không định hướng (vì không còn chịu sự tương quan trong hệ thống thực vật) 31

Hình 35: Các bước nuôi cấy tế bào trần

1.NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN

Dung hợp tế bào trần là sự hợp nhất của các tế bào sôma không có thành tế bào của các cá thể hoặc các loài khác nhau và sau đó tái sinh cây lai từ các tế bào đã dung hợp

32

Ứng dụng của tế bào trần

•Chọn dòng tế bào

•Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vật

•Biến nạp di truyền, đưa các cơ quan tử, virus, DNA

ngoại lai vào tế bào thực vật

•Là hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp

thành tế bào

2.DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

a.Các phương pháp dung hợp

•Dung hợp tự phát (Spontaneuouso fusion)

•Dung hợp bằng điện

b.Cơ sở tế bào học của dung hợp tế bào trần

Nếu dung hợp chỉ xảy ra tế bào chất và cơ quan tử các nhân vẫn giữ nguyên thì tạo thành thể lai tế bào chất (Cybrid) Còn trường hợp tế bào chất và nhân được dung hợp thì tạo tế bào lai thực sự (Hybrid)

c.Lựa chọn sản phẩm dung hợp

33

V.KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THỰC VẬT

1.CÁC ĐIỀU KIỆN

34

2.PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN

•Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.

•Chuyển gen gián tiếp nhờ virus

a.Phương pháp chuyển gen gián tiếp

b.Phương pháp chuyển gen trực tiếp

•Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)

•Chuyển gen bằng xung điện (electroporation)

•Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)

•Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm

•Chuyển gen bằng phương pháp hóa học

•Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn (pollen tube)

Hình 36: Súng bắn gen Hình 37: Sơ đồ nguyên lý hoạt

động của súng bắn gen