Ứng dụng của kỹ thuật gen - MỘT SỐ ỨNG DỤNG CHỦ YẾU CỦA CÔNG NGHỆ GEN

1.3 Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp Nguyên lý chung bao gồm: - Tách chiết và tính sạch RNA thông tin mã hoá preproinsulin - Thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược - Sử dụng enzym giới h

PHẦN III MỘT SỐ ỨNG DỤNG CHỦ YẾU

CỦA CÔNG NGHỆ GEN

CHƯƠNG VIII ỨNG DỤNG KỸ CÔNG NGHỆ GEN TRONG Y HỌC VÀ CHẨN

ĐOÁN

I Kỹ thuật gen trong sản xuất chế

phẩm sinh học

1 Sản xuất insulin tái tổ hợp

1.1 Lược sử nghiên cứu insulin

- Do các tế bào beta của tuyến tụy sản

xuất, đóng vai trò chuyển hóa đường

- Bệnh tiểu đường (Diabetes) do thiếu hụt

insulin

- Từ năm 1922 đã tách chiết insulin từ tụy

bò và lợn để điều trị tiểu đường

- Cấu trúc phân tử insulin người được phát hiện vào năm 1926 Năm 1955 Sanger và cộng sự đã giải trình tự và sắp xếp acid

amin

- 1963-1965 đã tổng hợp nhân tạo bằng

con đường hóa học ⇒ đắt, không phù hợp

- 1967, phát hiện cấu trúc proinsulin

- 1969, phát hiện 3 dạng cấu trúc

- 1978, sản xuất insulin tái tổ hợp trong

E.coli

- 1982, insulin được phép lưu hành ở châu Ậu Bán ở Mỹ năm 1983

1.2 Cấu trúc gen mã hóa insulin ở

• Đoạn gen mã hóa cho 4 peptid của phân

tử insulin: Chuỗi peptid tín hiệu (leader), chuỗi B, chuỗi C và chuỗi A

Signal sequence is removed after targeting

to RER

Translation continues

on RER (forming proinsulin)

Removal of 33 amino

acids at Golgi

and S-S joining of A and B chains to form

insulin

Insulin is made up of 2 chains = 51 amino acids total

A chain = 21 amino acids

B chain = 30 amino acids

In reality both chains are present in

the same protein

1.3 Công nghệ sản xuất insulin tái

tổ hợp

Nguyên lý chung bao gồm:

- Tách chiết và tính sạch RNA thông tin mã hoá preproinsulin

- Thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược

- Sử dụng enzym giới hạn loại bỏ gen mã hóa chuỗi C, tách dòng riêng từng đoạn gen mã hóa chuỗi A và B

- Tạo vector biểu hiện gen đoạn A và B

- Biến nạp riêng mỗi loại vector trong E.coli

- Thực hiện quá trình lên men thu protein chuỗi lacZ và B-lacZ

A Thu riêng từng loại protein lai và thực hiện phản ứng cắt với cyanur bromid giữa a.a cuối cùng của insulin và a.a của β-galactosidase

- Tách và tinh sạch chuỗi A và B, sau đó tạo hỗn hợp chuỗi A và B, hình thành cầu nối disulfit và thu insulin thành phẩm

Sản xuất insulin tái tổ hợp

Human Insulin Production by Bacteria

6) join the plasmid and human fragment

and cut with a restriction enzyme

Human Insulin Production by Bacteria

Mix the recombinant plasmid with

bacteria.

Screening bacterial cells to learn which contain the human insulin gene is the hard part.

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

A fermentor used to grow recombinant bacteria.

This is the step when gene cloning takes place.

The single recombinant plasmid replicates within a cell

Then the single cell with many recombinant plasmids produces trillions of like cells with recombinant plasmid – and the human insulin gene

One cell with the

recombinant plasmid

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

The final steps are to collect the bacteria, break open the cells, and purify the insulin protein expressed from the recombinant human insulin gene.

2 Sản xuất hormon sinh trưởng tái

tổ hợp

2.1 Lịch sử nghiên cứu hormon sinh trưởng

- Hormon sinh trưởng người (hGH – Human

Growth Hormone) phát hiện năm 1920 Năm

1950 đã tách chiết hGH từ tuyến yên người

- 1956, hGH tách từ não bò, cừu, … dùng để

chữa bệnh lùn ở trẻ em

- 1972, cấu trúc phân tử của hGH được xác định

- 1985, hãng Genetech sản xuất thành công hGH

có tên Protropin

• Hormon sinh trưởng người hiện nay chủ yếu sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp gen Có

nhiều sản phẩm thương mại giúp điều trị bệnh hay giúp cho phát triển cơ bắp

• hGH là protein nhỏ, có 191 a.a Trong phân tử

có 2 liên kết disulfit

• Các gen mã hóa hGH của người, bò… chuyển vào động vật như cá, lợn,…tạo động vật chuyển gen phát triển nhanh

Human Growth Hormone (HGH)

( somatotropin)

• HGH promotes overall body growth

by increasing amino acid uptake by cells, protein synthesis and fat

utilization for energy

Insufficient production of HGH by the pituitary gland = dwarfism – Chubby face

– “Baby fat” around waist

– Unusual body properties as an adult

– ~ 4 feet tall only

– IQ = Normal

HGH helps undersized children reach their normal height and size

http://www.hopkinsmedicine.org/hmn/F01/photos/36.jpg

2.2 Cấu trúc gen mã hóa hormon

sinh trưởng người

• Họ gen có 5 gen mã hóa, nằm trên cánh dài

2.3 Công nghệ sản xuất hormon

sinh trưởng người TTH

Bao gồm các bước

- Tách chiết và tinh sạch mRNA từ tế bào thùy trước

tuyến yên và thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược

- Sử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gen mã hóa 23-24 a.a của chuỗi peptid tín hiệu

- Chuyển gen mã hóa hGH vào vector biểu hiện thích hợp

- Biến nạp vector TTH vào E.coli, nuôi cấy, thu sinh khối, tách chiết và tinh sạch hGH

- Tế bào biểu hiện: vi khuẩn, baculovirus, nấm men, tế bào trứng chuột

Pressure to use HGH to stimulate growth

in youngsters who have no deficiency but whose parents want them to grow up tall.

In the summer of 2003, the U.S FDA approved the use of human growth hormone (HGH) for

• boys predicted to grow no taller than 5′3″ and

• for girls, 4′11″

even though otherwise perfectly healthy.

If adult suffers with hypopituitarism, HGH therapy is also available

as normally payable under an insurance policy

Pre-recombinant era of HGH

production

HGH could be purified from cadaver (tử thi) pituitary glands

8 cadavers/year for 8 – 10 years per patient

Creutzfeldt-Jacob Disease (CJD) is one of the risk of using brain tissue

24 cases reported by 1993 in France from cadaver HGH

Protropin (Genentech) and

Humatrope (Eli Lilly)

Native human GH contains signal peptide needed to direct nascent polypeptide to RER in

eukaryotes Signal peptide is bad for E.coli (it can not synthetize this protein)

Signal sequence removed be EcoRI cleavage Coding sequence for first 24 aa also lost in the

process of removal

24 amino acids added back by synthetic DNA linker

Expressed in E coli successfully

hGH therapy is very expensive, costing anywhere from $800 to $2,500 a month

3 Sản xuất interferon tái tổ hợp

3.1 Lược sử nghiên cứu interferon

- Năm 1930, phát hiện gia súc nhiễm bệnh do một loại virus này, ít bị nhiễm loại virus khác Isaacs

và Linderman (1957) khi nuôi cấy phôi gà đã

phát hiện 1 loại protein mới gây ức chế tái bản virus, gọi là interferon (IFN)

- Trước năm 1980, sản xuất IFN từ tế bào bạch cầu người, lây nhiễm virus, sau đó nuôi trong phôi gà để tế bào bạch cầu sinh IFN ⇒ Giá

thành đắt

- Tháng 1 năm 1980 thành công sản xuất IFN bằng con đường TTH trong E.coli

- Interferon là protein hoặc glycoprotein,

TLPT – 16-45 kDa Có tác dụng ngăn cản

sự xâm nhiễm của virus hoặc kìm hãm

phát triển khối u.

- Interferon chia làm 2 nhóm:

♣ Nhóm 1: IFN α, IFN β, IFN ω

♣ Nhóm 2: IFN γ kém bền trong acid

• Interferons are small proteins released by macrophages,

lymphocytes, and tissue cells infected with a virus.

When a tissue cell is infected by a virus, it releases interferon

Interferon will diffuse to the surrounding cells When it binds to receptors on the surface of those adjacent cells, they begin the

production of a protein that prevents the synthesis of viral proteins This prevents the spread of the virus

throughout the body.

General Action of

Interferons

• Three types of interferons: alpha, beta and gamma.

Type I Interferons

• Type I: alpha and beta

• Alpha interferons are produced by leukocytes

• Beta interferons are produced by fibroblasts

• Both bind to interferon cell receptors type 1 and both encoded on chromosome 9

•They have different binding affinities but similar biological effects

•Viral infection is the stimulus for alpha and beta expression

• Used to mobilize our 1 st line of defense against invading organisms

•Largest group and are secreted by almost all cell types

Type II Interferon (gamma)

• Bind to type 2 receptors and its genes are encoded on

chromosome 12

•Initially believed that T helper cell type 1 lymphocytes,

cytotoxic lymphocytes and natural killer cells only produced IFNg, now evidence that B cells, natural killer T cells and professional antigen-presenting

cells secrete IFNg also.

• Gamma production follows

activation with immune and

inflammatory stimuli rather

than viral infection.

• This production is controlled

by cytokines secreted by

interleukin 12 and 18.

• Recombinant forms of alpha interferon include:

•Alpha-2a drug name Roferon

•Alpha-2b drug name Intron A

•Alpha-n1 drug name Wellferon

•Alpha-n3 drug name AlferonN

•Alpha-con1 drug name Infergen

•Recombinant forms of beta interferon include:

•Beta-1a drug name Avonex

•Beta-1b drug name Betaseron

•Recombinant forms of gamma interferon include:

•Gamma-1b drug name Acimmune

How Does It Prevent Viral

How Does It Prevent Viral

Replication?

virus

interferon

How Does it Prevent Viral

Replication?

virus

Inhibitory proteins

No replication

3.2 Gen mã hóa ở người và cơ chế

sinh IFN

• Trong tế bào người IFN-α mã hóa bởi 22 gen nằm trên cánh ngắn của NST số 9,

gen mã hoá IFN-β nằm trên NST số 2

• Gen mã hóa IFN-γ nằm trên NST số 12,

gồm 4 exon Sản xuất trong tế bào lympho

T

Vai trò của IFN trong trị bệnh do

nhiễm virus

• Điều trị viêm gan và ứng dụng trong điều trị ung thư

Single study shows association with TB

Negative studies not shown – mostly not published!

IL-12Rβ2 iNOS

3.3 Công nghệ sản xuất interferon

tái tổ hợp

• Sản xuất IFN-α: gây nhiễm nhân tạo virus vào tế bào bạch cầu Sử dụng một số loại virus như Sendal, Newcastle, λ

• Sản xuất IFN-β: từ nguyên bào sợi

4 Sản xuất yếu yếu tố VIII và IX tái

tổ hợp

• Các chất có ảnh hưởng đến sự đông máu:

từ I đến XII Trong đó yếu tố VIII và IX

đóng vai trò quan trọng.

5 Sản xuất vaccin tái tổi hợp và

vaccin DNA

5.1 Lược sử nghiên cứu và ứng dụng

- Năm 1780 Edward Jenner phát hiện

phương pháp phòng bệnh đậu mùa bằng chủng đậu với virus gây bệnh đậu bò giảm độc lực

- Luis Pasteur phát minh vaccin chữa bệnh dại

- Có thể chia vaccin làm 2 nhóm: truyền

thống và tái tổ hợp

ự

Smallpox - đậu mùa

• 1930’s Last natural UK case

• 1940’s last natural US case

• 1958 WHO program

• October 1977: Last case

(Somalia)

Smallpox• No animal reservoir

• Lifelong immunity

• Subclinical cases rare

• Infectivity does

not precede overt symptoms

• One Variola serotype

• Effective vaccine

• Major commitment by governments

• Vaccin truyền thống: là vi khuẩn hoặc virus sống

đã làm giảm độc lực Nhược điểm: thời gian bảo quản ngắn, khó bảo đảm an toàn → tính độc hồi lại

• Vaccin TTH: protein kháng nguyên nhờ kỹ thuật DNA Ưu điểm: giá thành rẻ, sử dụng rộng rãi

chống các bệnh do vi khuẩn, ký sinh trùng, viêm gan do virus

• Vaccin DNA có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh hiểm nghèo (ung thư, AIDS,…)

5.2 Vaccin tái tổ hợp

5.2.1 Vaccin TTH phòng chống viêm gan

- Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBV) được sản xuất trong nấm men S.cerevisae từ năm 1981 Bắt đầu sử dụng từ năm 1986

- Một số sản phẩm vaccin phòng chống HBV: Recombivax HB, Engeris B,

Genhevac B,… được sản xuất trong tế bào nấm men và vi khuẩn

The growth cycle

• HBV vaccin sử dụng gen mã hóa protein vỏ

Protein kháng nguyên HBsAg có khả năng tạo kháng thể miễn dịch mạnh nhất

• Gen mã hóa protein vỏ gồm 3 gen: Pre-S1mã

hóa chuỗi peptid gồm 128 a.a, Pre-S2 mã peptid

có 55 a.a và gen S mã hóa chuỗi peptid có 226 a.a

• Người ta tách riêng hoặc tổ hợp S, Pre-S1 và

Pre-S2 để tạo tổ hợp vaccin khác nhau

• Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV ở mức

cao, viêm gan cấp tính 37-49 %, xơ gan có HBV 47-87 %, ung thư gan có HBV 57-80%

Transcription of Hepatitis B virus

From Murray et al., Medical Microbiology 5 th

edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby Philadelphia,,

Note: HBeAg (E) is encoded in C region using different start codons and

is not shown

Figure 66-6

New Methods

• Recombinant DNA

•Single gene (subunit)

S-antigen mRNA

cDNA

Express plasmid

S-antigen mRNA

protein

Hepatitis B

vaccine

raised in yeast

5.2.2 Vaccin tái tổ hợp chống bệnh

sốt rét

• 300-500 nhiễm bệnh hàng năm, tử vong 1-3

triệu người Kí sinh trùng do 4 loài có vòng đời

và quá trình lây nhiễm phức tạp

• Vaccin từ gen kháng nguyên Pfs-25 đang được thử nghiệm Gen Pfs-25 được tách dòng từ

Plasmodium falciparum mã hóa cho protein có

TLPT 25 kDa

• Đã sử dụng vaccin phòng chống viêm não, cúm

gà Đang phát triển vaccin phòng chống sốt xuất huyết, HIV/AIDS

- Bệnh Gumboro do virus gây bệnh trên gà Năm

1996 nhiều nghiên cứu TTH gen kháng nguyên VP2 hoặc đoạn gen VP3, VP4 tạo vaccin DNA

- Vaccin DNA gồm 2 loại: vaccin tập hợp gen kháng nguyên và vaccin tập hợp gen sinh kháng thể

- Vaccin có nhiều ưu điểm: dễ dàng thiết

kế, sản xuất, bảo quản

DNA Vaccines and HIV

• HIV could be

prevented using DNA

Vaccines

-By isolating the gene for a protein

produced by HIV, a DNA Vaccine

could be created and immunity for the

protein and thus HIV could be

established People would then be

able to be immune to HIV.

• Many experiments

have been done

-Researchers have attempted to create

many varying DNA Vaccines, but none

have been entirely successful in

humans.

• Envelope gene

-A specific gene of HIV that could be used

to create a DNA Vaccine for HIV.

www.wellesley.edu

4

II Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn

đoán và điều trị

1 Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán

và điều trị ung thư do virus

- Ung thư vòm họng do virus RBV

(Epstein-Barr virus)

- Phát hiện 6 loại virus gây viêm gan nguyên

phát (HAV, HBV, HCV, HDBV, HEV và HGV)

1.2 Kỹ thuật gen và ứng dụng trong

điều trị ung thư

• Phương pháp phổ biến điều trị ung thư dùng

vector liệu pháp gen từ Paramyxovirus và kết

hợp xạ trị

• Hơn 50% trường hợp ung thư ở người liên quan đến hoạt tính gen p53

• Gen p53 có kích thước 23 kb, nằm trên NST 17

• Gen p53 sản xuất protein có TLPT 53 kDa, điều hòa quá trình phân chia tế bào và kích hoạt hiện tượng chết theo chu trình (apoptosis)

Naked DNA Target Cell

Therapeutic Protein

4 Sử dụng kỹ thuật microarray

trong chẩn đoán bệnh

• Mảng (thủy tinh, nhựa) có kích thước nhỏ chứa mẫu dò (300 ngàn – hàng triệu) cho phép chẩn đoán nhanh các bệnh liên quan vật chất di truyền (DNA, RNA)

5 Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng ở vật nuôi

• Chẩn đoán một số bệnh thường gặp trên tôm: bệnh đốm trắng do WSSV, còi do

MBV, đầu vàng (YHV)

The Asian pandemic

WSSV

1993 1991/2

1993

1993 1993

1994

1999

6 Sử dụng kỹ thuật gen trong chẩn đoán bệnh cây trồng và thực phẩm

chuyển gen

• Bệnh héo xanh do Xanthomonas

• Phát hiện bắp, ngô chuyển gen