Bài viết trình bày tiến hành phân lập và mô tả vi khuẩn oxi hóa methane từ nhiều nguồn có sinh phát thải khí methane như nước sông, hầm biogas, ruộng lúa, dạ cỏ bò. Qua kết quả định lượng, chủng S15b có khả năng làm giảm methane cao nhất. Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên trình tự gen 16S rDNA cho thấy chủng S15b là Dyadobacter sediminis.
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG LÀM GIẢM KHÍ METHANE – GÂY HIỆU ỨNG NHÀ KÍNH Nguyễn Văn Minh*, Lê Huỳnh Nhật Giao, Ngô Lập Vinh, Phạm Lê Minh, Đinh Thị Mai Anh, Nguyễn Hoài Linh Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh *Tác giải liên lạc: minhvisinh@gmail.com TĨM TẮT Từ cuối kỷ 19, nóng lên toàn cầu phát với gia tăng nhiệt độ trung bình đại dương bầu khí trái đất CO2 chiếm khoảng 77% tổng lượng khí nhà kính, CH4 với lượng phát thải thấp có khả giữ nhiệt cao gấp 25 lần so với CO2 tăng lên khơng khí năm 0,6% (IPCC, 2013) Trong tự nhiên, Methanotroph (MOB) nhóm vi khuẩn có khả sử dụng methane nguồn lượng carbon MOBs thuộc phân lớp α γ nhóm Protobacteria, dựa hình thái, đặc tính sinh lí xếp màng tế bào chất, đường chuyển hóa carbon, khả cố định N2, nang túi bào tử, màu sắc khuẩn lạc, khả di động, Methanotroph chia thành chi Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter Methylococcus (Whittenbury et al., 1970) Trong nghiên cứu này, phân lập vi khuẩn oxi hóa khí methane (MOB) từ nước thải hầm biogas, nước sơng, bùn lúa, cỏ bị mơi trường NMS có bổ sung khí CH4 nguồn carbon Kết phân lập thu 87 chủng vi khuẩn phát triển mơi trường NMS agar, có chủng S15b, DC3a, MO2 BĐ41 có khả làm giảm methane Qua kết định lượng, chủng S15b có khả làm giảm methane cao Kết định danh kỹ thuật sinh học phân tử dựa trình tự gen 16S rDNA cho thấy chủng S15b Dyadobacter sediminis Từ khóa: 16S rDNA, Dyadobacter sediminis, MOB, methane ISOLATION AND SCREENING OF MICROORGANISMS POTENTIAL FORDECREASE METHANE – GREENHOUSE EFFECT Nguyen Van Minh*, Le Huynh Nhat Giao, Ngo Lap Vinh, Pham Le Minh, Dinh Thi Mai Anh, Nguyen Hoai Linh Ho Chi Minh City Open University *Corresponding Author: minhvisinh@gmail.com ABSTRACT Since the late 19th century, global warming has been detected with the rise in the average temperature of Earth's atmosphere and oceans CO2 accounted for 77% of greenhouse gases, while methane emissions are lower but have the ability to keep the heat higher 25 times than CO2 and increased 0.6% in the air each year (IPCC, 2013) In nature, Methanotrophic (MOB) bacteria are ability to utilize methane as a sole carbon and energy source In this study, we isolated Methane oxidation bacteria (MOB) from biogas digesters, river water, rice mud and rumen in NMS medium with CH4 as the sole carbon source MOBs belong to the α and γ-subclass of Protobacteria Based on morphology, physiological properties the arrangement of intra-cytoplasmic membranes, pathways of carbon 569 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học assimilation nitrogen fixation ability, the presence of cysts or spores, colony color and motility, the methanotrophs were initially classified into five genera Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter and Methylococcus Isolated results showed 87 bacterial strains grown on NMS agar, of which four strains S15b, DC3a, MO2 and BD41, were able to reduce methane Quantitative results showed that the S15b strain has the highest methane reduction potential Identification by molecular biology technique based on the 16S rDNA gene sequence showed that the S15b strain is Dyadobacter sediminis Keywords: 16S rDNA, Dyadobacter sediminis, MOB, methane TỔNG QUAN Hiệu ứng nhà kính kết trao đổi không cân lượng trái đất với không gian xung quanh, dẫn đến gia tăng nhiệt độ khí trái đất Các khí nhà kính chủ yếu: nước, CO2, CH4, N2O, O3, khí CFC Methane phát thải từ q trình phân hủy kỵ khí chất hữu diễn nhiều điều kiện môi trường khác đất canh tác, đất rừng, đất ngập nước đến trầm tích thủy vực, trầm tích biển,… Bên cạnh đó, người đóng góp vào nguồn phát thải khí methane vào khí sản xuất cơng nghiệp (chưng cất than đá, khai thác dầu mỏ), nông nghiệp (chất thải chăn ni, dày lồi nhai lại, canh tác lúa nước,…) Hiện nay, việc giảm thiểu CH4 phương pháp vật lí, hóa học hấp thụ carbon hoạt tính đốt biện pháp có hiệu khơng cao (Melse et al.,2005) Vì vậy, cơng nghệ sinh học trở thành biện pháp vừa thân thiện với mơi trường vừa tiết kiệm chi phí Trong đó, vi khuẩn oxi hóa khí methane mắc xích quan trọng việc giải vấn đề Năm 1906, nhà vi sinh vật học người Hà Lan Nicolaas Söhngen lần mô tả sinh vật phát triển methane phân lập từ nước ao vật liệu trồng thủy sinh Cho đến nay, nhóm vi khuẩn MOB tìm thấy tự nhiên bao gồm đất (Whittenburyet al.,1970), trầm tích (Smith et al.,1997), bãi rác (Wise et al.,1999), nước ngầm (Fliermans et al.,1988), nước biển (Holmes et al., 1995), than bùn (Dedysh et al., 2000) Dựa đặc tính sinh lý di truyền MOB hướng nghiên cứu ứng dụng nhóm vi sinh vật tiến hành Vai trò hàng đầu MOB hệ sinh thái oxy hóa methane tạo từ trình phân hủy kỵ khí hợp chất hữu trước khí vào khí quyển, từ giảm thiểu tác động methane nóng lên tồn cầu Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành phân lập mơ tả vi khuẩn oxi hóa methane từ nhiều nguồn có sinh phát thải khí methane nước sơng, hầm biogas, ruộng lúa, cỏ bị NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Các chủng vi khuẩn có khả oxi hóa methane phân lập từ mẫu nước sông, ao; nước thải hầm biogas; bùn lúa; cỏ bò, trâu; ruột mối thị xã Bến Cát tỉnh Bình Dương, huyện Củ Chi, Nhà Bè, tỉnh Cà Mau Môi trường phân lập giữ giống môi trường Nitrate – Mineral – Salts (NMS) có bổ sung 1,5% agar (Whittenbury et al., 1970) Môi trường chứa KNO3 1.0 g; MgSO4.7H2O 1.0g; CaCl2.H2O 0.2 g; 3.8% (w/v); Fe EDTA 0,1 ml; 0,1% (w/v) NaMo.4H2O 0.5 ml; lit H2O; ml 570 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 hỗn hợp vi lượng: FeSO4.7H2O 500 mg; ZnSO4.7H2O 400 mg; MnCl2.7H2O 20 mg, CoCl2.6H2O 10 mg, NiCl2.6H2O 10 mg, H3BO3 15 mg, EDTA 250 mg, lit H2O; 10ml hỗn hợp vitamin: Biotin 2.0 mg, Folic acid 2.0 mg, Thiamine HCl 5.0 mg, Ca patothenate 5.0 mg, Vitamin B12 0.1 mg, Riboflavin 5.0 mg, Nicotiamide 5.0 mg, lit H2O; pH 6,8 – 7; hấp vô trùng 121oC, 20 phút, atm PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phân lập làm Mẫu mối rửa qua ethanol 70 %, cắt bỏ đầu, dùng kẹp tách ruột mối Sau rửa lại với ethanol 70% (Trinkerl Marion et al., 1990) chuyển vào bình serum 50 ml đậy kín nắp cao su silicon chứa 10 ml mơi trường NMS có bổ sung CH4 nguồn carbon Tương tự với mẫu đất mẫu nước, ủ lắc 30oC bình serum chứa môi trường NMS với CH4 nguồn carbon Sau - ngày, hút – 10 ml dịch ni chuyển vào bình serum chứa mơi trường NMS khác, lặp lại lần Sau khoảng 25 ngày, pha lỗng dịch ni với dung dịch NaCl 0,85% với độ pha loãng từ cấp số đến cấp số Trải 100 µL dịch ni độ pha lỗng cuối lên môi trường NMS agar, nồng độ đĩa, ủ 30ºC hộp kín có bổ sung 30-50% CH4 Các khuẩn lạc mọc môi trường tiếp tục cấy sang môi trường NMS agar nhiều lần đến khuẩn lạc mọc đường cấy đồng (về màu sắc, kích thước, hình dạng), rời (Dehysh et al., 2010) Nhuộm gram Để quan sát hình thái vi thể chủng phân lập được, tiến hành nhuộm Gram chủng vi sinh vật sau ngày nuôi ủ NMS agar quan sát kính hiển vi với vật kính 100X (Roy et al., Kỷ yếu khoa học 2010) Đánh giá khả oxy hóa methane chủng vi khuẩn Vi khuẩn oxi hóa khí methane ni bình serum thủy tinh 500 ml, có nắp cao su kẹp nhơm chứa 100ml NMS 50 – 70% CH4 Đậy kín nắp lọ, ủ lắc 200 ppm/ 30oC/ ngày Sau bổ sung khí vi khuẩn, chúng tơi tiến hành lấy mẫu khí gửi phân tích lần Viện cơng nghệ hóa học số 01 Mạc Đĩnh Chi Hỗn hợp phản ứng phân tích máy phân tích sắc ký khí Agilent Technologies 6890 Plus, máy trang bị phần mềm GC Chem Station để xử lý số liệu Phân tích CH4 sử dụng detector ion hóa lửa FID cột mao quản DB-624 (chiều dài 30 m, đường kính cột 250 μm, độ dày lớp phim 0,32 μm) với chế độ hoạt động: Nhiệt độ lò 60 o C; Áp suất 20,0 PSI; Tỷ lệ chia dòng 25/1; Nhiệt độ buồng tiêm 250 oC; Nhiệt độ đầu dị 250 oC; khí mang N2 Thể tích mẫu bơm phân tích: 0,2 mL Sau ngày nuôi ủ, tiếp tục lấy mẫu khí gửi phân tích lần để xác định %CH4 giảm Định danh kỹ thuật sinh học phân tử Mẫu vi khuẩn S15b gửi giải trình tự định danh công ty Nam Khoa, phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen 16S rDNA Kết giải trình tự BLAST để so sánh trình tự ngân hàng sở liệu NCBI Sau tiến hành xây dựng phát sinh loài phương pháp Maximum likelihood (khả tối ưuML) với phần mềm MEGA Khoảng cách di truyền thiết lập dựa mơ hình thuật tóa n tiến hóa Kimura’s two parameter KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết phân lập làm Từ 38 mẫu bao gồm cỏ, nước, đất 571 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 bùn, mối, phân bị thu thập Bình Dương, Củ Chi, Nhà Bè, Bến Cát, 87 chủng vi khuẩn phân lập môi trường NMS với CH4 nguồn carbon có 45 chủng vi khuẩn Gram (-) 42 chủng vi khuẩn Gram (+) Các dạng khuẩn lạc môi trường NMS agar hầu hết bóng ướt, hình trịn, màu trắng đục trắng ngã vàng, trắng ngã hồng Quan sát kính hiển vi cho thấy chúng có hình trực ngắn, lê, cầu đôi cầu Kết định lượng %CH4 giảm Từ 87 vi khuẩn phân lập qua trình định lượng, xác định chủng: chủng S15b phân lập từ nước sông, chủng MO2 phân lập từ ruột mối, chủng DC3b phân lập từ cỏ bò, chủng BĐ41 phân lập từ bùn lúa có khả làm giảm CH4 cao chủng S15b có khả oxi hóa methane Theo nghiên cứu Dayeri Dianou cộng (1997) số 20 chủng MOB phân lập được, chủng có khả oxi hóa methane cao 96% thấp 23% Như vậy, kết Dayeri Dianou cộng có kết cao so với kết (43 - 55%) Theo nghiên cứu Malashenko cộng (2004), nhóm vi khuẩn MOBs có khả sinh exopolymer (EPS) chất cho sinh trưởng vi sinh vật dị dưỡng khác Nghiên cứu Whittenbury cộng (1970) cho biết vi khuẩn khơng sử dụng khí methane phát triển môi trường NMS với CH4 nguồn carbon sử dụng chất hữu hòa tan thành phần agar Vì trình phân lập dễ có nhầm lẫn vi sinh vật sử dụng methane vi sinh vật không sử dụng methane Kết định danh chủng S15b Kỷ yếu khoa học Thực phản ứng PCR nhân vùng gen 16S rDNA chủng S15b với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR đoạn gen dài 483 bp Từ kết giải trình tự vùng gen 16S rDNA chủng S15b, tiến hành BLAST để so sánh mức độ tương đồng với trình tự ngân hàng sở liệu NCBI Kết cho thấy chủng S15b có mức độ tương đồng cao với nhiều loài thuộc chi Dyadobacter, số Query cover đạt 94% Ngoài ra, sau dựng phả hệ phân tử, chúng tơi nhận thấy trình tự S15b có mức gần gũi cao với trình tự loài Dyadobacter sediminis, số bootstrap đạt 97%, cho thấy mức độ gần gũi S15b Dyadobacter sediminis có độ tin cậy lên đến 97% Dyadobacter sediminis mô tả ông Tian M cộng (2015) từ mẫu trầm tích lịng đất, nằm lưu vực sơng Mohe, phía Đơng Bắc Trung Quốc Chưa có cơng trình nghiên cứu đặc điểm sinh lý, vật liệu di truyền chủng Dyadobacter sediminis Vì vậy, để tăng độ tin cậy cho kết thử nghiệm khả sử dụng làm giảm CH4 chủng S15b mơ hình thực nghiệm Đồng thời tập trung nghiên cứu đến ezyme methane monooxygenase đoạn gen pmoA, mmoX chủng S15b KẾT LUẬN Thu 87 chủng vi khuẩn có tiềm giảm CH4 từ 38 mẫu bao gồm cỏ, nước thải biogas, nước sông, mối, đất bùn khác địa bàn huyện Củ Chi, huyện Nhà Bè, thị xã Bến Cát, tỉnh Bình Dương Trong có 45 chủng Gram (-) 42 chủng Gram (+) Định lượng phần trăm CH4 giảm 31 chủng vi khuẩn Thu chủng có khả làm giảm CH4 Trong đó, chủng S15b phân lập từ nước 572 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 sông làm giảm CH4 cao Kết định danh kỹ thuật sinh Kỷ yếu khoa học học phân tử cho thấy chủng S15b thu loài Dyadobacter sediminis TÀI LIỆU THAM KHẢO DEDYSH S.N., DUNFIELD P.F (2010) Facultative and obligate methanotrophs: how to identify and differentiate them Methods in Enzymology, pp 31-43 DIANOU D., ESPIRITU B.M., ADACHI K., SENBOKU T., (1997) Isolation and some properties of methane-oxidizing bacteria from a subtropical paddy field., Soil Sci Plant Nutr., 43, pp 735-740 FLIERMANS C.B., PHELPS T.J., RINGELBERG D., MIKELL A.T., WHITE D.C (1988) Mineralization of trichloroethylene by heterotrophic enrichment cultures Mineralization of trichloroethylene by heterotrophic enrichment cultures Applied and Environmental Microbiology 54, pp 1709 – 1714 WISE M.G., MCARTHUR J.V., SHIMKETS LJ (1999) Methanotroph diversity in landfill soil: isolation of novel types I and type II methanotrophs whose presence was suggested by culture-independent 16S ribosomal DNA analysis Appl Environm Microbiol 65, pp 4887 - 4897 573 ... chủng: chủng S15b phân lập từ nước sông, chủng MO2 phân lập từ ruột mối, chủng DC3b phân lập từ cỏ bị, chủng BĐ41 phân lập từ bùn lúa có khả làm giảm CH4 cao chủng S15b có khả oxi hóa methane Theo... đó, vi khuẩn oxi hóa khí methane mắc xích quan trọng vi? ??c giải vấn đề Năm 1906, nhà vi sinh vật học người Hà Lan Nicolaas Sưhngen lần mơ tả sinh vật phát triển methane phân lập từ nước ao vật. .. thái vi thể chủng phân lập được, tiến hành nhuộm Gram chủng vi sinh vật sau ngày nuôi ủ NMS agar quan sát kính hiển vi với vật kính 100X (Roy et al., Kỷ yếu khoa học 2010) Đánh giá khả oxy hóa methane