CHUYÊN ĐỀ TỔNG QUAN VỀ MIỄN DỊCH HỌC BỆNH SỞI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG CHUYÊN ĐỀ TỔNG QUAN VỀ MIỄN DỊCH HỌC BỆNH SỞI Nghiên cứu sinh: Nguyễn Ngọc Quỳnh Chuyên ngành: Dịch tễ học Mã số: 62 72 01 17 Hà Nội, năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG CHUYÊN ĐỀ TỔNG QUAN VỀ MIỄN DỊCH HỌC BỆNH SỞI Nghiên cứu sinh: Nguyễn Ngọc Quỳnh Chuyên ngành: Dịch tễ học Mã số: 62 72 01 17 Hà Nội, năm 2018 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ NỘI DUNG Khái niệm về đáp ứng miễn dịch Đặc điểm vi rút sởi 18 Tổng quan về kháng thể kháng vi rút sởi 18 1 Đáp ứng miễn dịch vi rút sởi 18 1.2 Các phương pháp đánh giá kháng thể vi rút sởi 21 Tình trạng tồn lưu kháng thể kháng vi rút sởi .28 2.1 Tình trạng tồn lưu kháng thể vi rút sởi ở phụ nữ có thai 28 2.2 Tình trạng tồn lưu kháng thể vi rút sởi truyền từ mẹ sang ở trẻ sau sinh 30 Các yếu tố ảnh hưởng đến tình trạng kháng thể vi rút sởi 34 KẾT LUẬN 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 CÁC CHỮ VIẾT TẮT BTN: Bệnh truyền nhiễm BV: Bệnh viện CBYT: Cán y tế ECDC: European Centre for Disease Prevention and Control Trung tâm kiểm soát phòng ngừa bệnh tật Châu Âu EIA: Enzyme Immunoassay Xét nghiệm miễn dịch Enzym ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay Xét nghiệm miễn dịch liên kết với Enzym GAVI: Global Alliance for Vaccines and Immunizations Liên minh vắc xin tiêm chủng toàn cầu GMT: Geometric Means Titre Giá trị trung bình nhân KN: Kháng nguyên KT: Kháng thể MAC-ELISA: IgM antibody-capture-Enzyme Linked Immunosorbent Assay Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme PNCT: Phụ nữ có thai PRNT: Plaque Reduction Neutralization Test Xét nghiệm kháng thể trung hòa giảm đám hoại tử PTN: Phịng thí nghiệm SARS: Severe acute respiratory syndrome Hội chứng Hơ hấp cấp tính nặng TCMR: Tiêm chủng mở rộng TTYTDP: Trung tâm Y tế dự phòng VSDT: Vệ sinh dịch tễ WHO: World Health Organization Tổ chức Y tế giới XN: Xét nghiệm YTCC: Y tế cơng cộng YTDP: Y tế dự phịng ĐẶT VẤN ĐỀ Sởi bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, dễ lây truyền vi rút sởi gây nên Trước năm 1980, chương trình tiêm chủng chưa triển khai rộng rãi, bệnh sởi làm khoảng 2,6 triệu trường hợp tử vong Thế giới năm Hiện nay, bệnh sởi nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở trẻ em tồn cầu mặc dù có vắc xin an tồn hiệu Khoảng 114 900 người chết bệnh sởi vào năm 2014 - chủ yếu trẻ em tuổi Trước có vắc xin, khoảng 90% trẻ nhỏ bị nhiễm sởi trước đạt đến tuổi 15 Tiêm chủng mở rộng có tác động lớn tới việc giảm mắc tử vong bệnh sởi Trong thời gian 2000-2014, ước tính tiêm phịng bệnh sởi làm giảm 17,1 triệu người tử vong Tử vong bệnh sởi Thế giới giảm tới 79% từ 546 800 trường hợp năm 2000 so với 114 900 năm 2014 Trên giới, chương trình tiêm chủng mở rộng bắt đầu hoạt động năm 1974 phát triển nhanh với nhiều thành bảo vệ sức khỏe ghi nhận Tới nay, có 190 quốc gia thực hiện chương trình tiêm chủng mở rộng với gần 30 loại vắc xin [1] Tiêm chủng mở rộng bắt đầu triển khai ở Việt Nam năm 1981 Bộ Y tế khởi xướng với hỗ trợ Tổ chức Y tế Thế giới Quỹ nhi đồng liên hợp quốc Mục tiêu ban đầu chương trình cung cấp dịch vụ tiêm chủng miễn phí cho trẻ em tuổi, bảo vệ trẻ khỏi bệnh truyền nhiễm (Lao, Bạch hầu, Ho gà, Uốn ván, Bại liệt, Sởi) Đến năm 2011, có 11 loại vắc xin đưa vào chương trình Tại Việt Nam, sởi nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ nhỏ Năm 2008, tỷ lệ tử vong ở trẻ nhỏ nhóm bệnh thời ấu thơ: sởi, ho gà, bại liệt, bạch hầu, uốn ván chiếm 0,9% riêng sởi 0,6% Số ca nghi sởi toàn quốc báo cáo giai đoạn 2005-2009 36.282 ca với 7.086 ca chẩn đoán xác định phịng thí nghiệm Mục tiêu loại trừ sởi vào năm 2012 đặt Chương trình Mục tiêu Quốc gia khơng đạt Từ 2013 – 2014, dịch sởi bùng phát diện rộng 63/63 tỉnh, Thành phố toàn quốc với tổng số mắc 17.000 trường hợp (năm 2013 1.123 trường hợp năm 2014 15.877 trường hợp) Tỷ lệ mắc trung bình năm 2013 – 2014 9,35 trường hợp /100.000 dân Kết phân tích dịch tễ học cho thấy có thay đổi đáng kể về lứa tuổi mắc sởi so với các vụ dịch sởi trước Trong giai đoạn từ 2005 – 2008 nhóm tuổi mắc sởi nhiều nhóm tuổi từ 1-6 tuổi nhóm 18 – 26 tuổi, vụ dịch năm 2013 – 2014 cho thấy tỷ lệ mắc sởi cao ở nhóm tuổi tuổi, đặc biệt nhóm trẻ chưa đến lịch tiêm chủng vắc xin sởi , Để trả lời câu hỏi tiêm chủng cho đối tượng nhằm xây dựng chiến lược tiêm chủng cách có hiệu quả, việc nghiên cứu tìm hiểu tình trạng tồn lưu kháng thể mức độ suy giảm kháng thể truyền từ mẹ sang ở trẻ sau sinh có ý nghĩa vơ quan trọng Tuy nhiên các nghiên cứu xác định tình trạng tồn lưu kháng thể giới nước chưa thực hiện nhiều khó thực hiện chi phí tốn Tổng quan các nghiên cứu về tình trạng tồn lưu kháng thể kháng vi rút sởi truyền từ mẹ sang từ trước đến nhằm các mục tiêu sau: Mô tả về đáp ứng miễn dịch vi rút sởi số kỹ thuật xác định tình trạng kháng thể kháng vi rút sởi Mơ tả tình trạng tồn lưu kháng thể kháng vi rút sởi ở phụ nữ có thai tình trạng tồn lưu kháng thể truyền từ mẹ sang ở trẻ sau sinh Mô tả số yếu tố liên quan đến tình trạng tồn lưu kháng thể truyền từ mẹ sang ở trẻ sau sinh NỘI DUNG Khái niệm về đáp ứng miễn dịch Trong cộng đồng sinh vật, đấu tranh sinh tồn các quy luật tự nhiên, sinh vật đều nhiều có khả tự bảo vệ chống lại xâm nhập vật lạ nào, nhằm bảo tồn tính toàn vẹn chúng Khả tự bảo vệ xuất hiện ở thể sống nhỏ bé chưa tiến hoá Cùng với tiến hoá sinh vật, các biện pháp bảo vệ ngày phong phú hoàn thiện, đáp ứng miễn dịch biện pháp quan trọng phức tạp Miễn dịch (immunity) khả thể nhận loại bỏ các vật lạ (trong miễn dịch học gọi kháng nguyên) Ở thể người đáp ứng miễn dịch có thể tạm chia làm hai loại: miễn dịch tự nhiên miễn dịch thu được, song cần lưu ý hai loại đáp ứng liên quan với chặt chẽ 1.1 Miễn dịch tự nhiên (native immunity, natural immunity) hay miễn dịch không đặc hiệu 1.1.1 Khái niệm Miễn dịch tự nhiên (hay miễn dịch không đặc hiệu) khả tự bảo vệ sẵn có mang tính di trùn các thể lồi Nói cách khác khả tự bảo vệ cá thể có từ lúc sinh, khơng địi hỏi phải có tiếp xúc trước thể với các kháng nguyên vật lạ tức khơng cần phải có giai đoạn mẫn cảm Cơ chế phát huy tác dụng, dù kháng nguyên xâm nhập lần đầu hay các lần sau, có vai trị quan trọng ở lần đầu tiên, lúc đáp ứng miễn dịch thu chưa phát huy tác dụng Trong nhiều trường hợp miễn dịch tự nhiên giai đoạn mở đầu cho miễn dịch thu 1.1.2 Các hàng rào đáp ứng miễn dịch tự nhiên 1.1.1.1 Hàng rào vật lý Đó da niêm mạc có tác dụng ngăn cách nội môi thể với ngoại môi xung quanh Da lành lặn, không bị sây sát cản trở xâm nhập kháng nguyên Da gồm nhiều lớp tế bào, có lớp tế bào ngồi sừng hoá, ln bong đổi mới, tạo cản trở vật lý trước xâm nhập kháng nguyên Niêm mạc có lớp tế bào bề mặt có tác dụng cản trở tốt, ngồi tính đàn hồi da, cịn bao phủ bởi lớp chất nhầy Chất nhầy tuyến ở niêm mạc tiết ra, tạo nên màng bảo vệ làm cho vi khuẩn các vật lạ không bám thẳng vào tế bào, mà bám điều kiện tiên để chúng có thể xâm nhập vào sâu Một số niêm mạc (mắt, miệng, đường tiết niệu) thường xuyên rửa bởi các dịch tiết, loãng (nước mắt, nước bọt, nước tiểu) Một số niêm mạc khác, đặc biệt niêm mạc ở đường hơ hấp, lại có các vi nhung mao ln rung động có tác dụng cản bịu mang theo vi khuẩn các vật lạ, không cho chúng vào phế nang đẩy dần chúng khỏi phế quản phản xạ ho hắt 1.1.1.2 Hàng rào hoá học Da niêm mạc giữ vai trò quan trọng ngăn cách thể với môi trường bên ngoài, nên tác dụng cản trở học, chúng tăng cường với số yếu tố hoá học Trên da, nhờ có các chất tiết acid lactic (tạo độ toan), acid béo mồ hôi tuyến mỡ da mà vi khuẩn không tồn L.Arnold đặt bacterium progidisum da thấy sau 10 phút 10% có khả gây bệnh, sau 20 phút 1% sau 30 phút 0% Tại niêm mạc, chất nhầy che chở bề mặt tế bào khỏi bị enzym neuramini – dase virus tác động Dịch tiết các tuyến nước mắt, nước bọt, nước mũi, sữa… có chứa nhiều lysozym, loại enzyme muramidase có tác dụng vỏ số vi khuẩn Những thành phần khác huyết bổ thể, interferon thấm niêm mạc tham gia thêm vào quá trình bảo vệ không đặc hiệu Như vậy, da niêm mạc, hàng rào hoá học phối hợp làm tăng tác dụng hàng rào vật lý Một số tế bào, các thực bào chuyển từ máu quá niêm mạc tham gia vào quá trình miễn dịch tự nhiên Một kháng nguyên vượt qua hàng rào da niêm mạc gặp phải hàng rào hoá học bên thể, huyết có chứa lysozym, protein phản ứng C (CR: C reactive protein), các thành phần bổ thể, interferon… Tại ổ viêm nồng độ protein C tăng cao, với có mặt Ca ++, có tác dụng phế cầu trùng có thể cố định bổ thể Bổ thể có thể hoạt động hoạt hoá (theo đường cạnh) bởi các chất hydratcacbon, lypopolysaccarid… vi khuẩn, chọc thủng vách tế bào làm dung giải vi khuẩn Bổ thể hệ thống nhiều thành phần, chất protein hoạt hoá theo trình tự định Khi hoạt hoá thành phần cắt làm hai phần, phần có tác dụng riêng Một số thành phần bổ thể hoạt hoá, C3a, C5a có tác dụng hoá ứng dụng bạch cầu, gây giãn mạch, giải phóng các chất trung gian từ các hạt bạch cầu ái kiềm Một số thành phần khác, C3b, cịn dính vào vi khuẩn, giúp cho các tế bào thực bào dễ tiếp cận tiêu diệt vi khuẩn, mặt các tế bào có cá receptor đặc hiệu dành cho C3b (C3R) Đó tác dụng chuẩn bị bổ thể 24 So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu tính đáng tin cậy các kít phản ứng có ý nghĩa quan trọng cơng tác kiểm soát sởi Nguyên lý dựa phủ kháng nguyên vi rút sởi (toàn hạt vi rút) hoặc kháng nguyên tái tổ hợp Tiếp cho huyết pha loãng nhận biết kháng thể đặc hiệu hệ thống cộng hợp kháng IgG người gắn enzym-cơ chất So sánh mật độ quang học ở mẫu chuẩn với mẫu huyết xác định xác nồng độ kháng thể huyết người bệnh Điểm lợi phương pháp thao tác đơn giản, độ đặc hiệu cao, tốn sinh phẩm hóa chất, Có thể dùng máy tự động giảm bớt thao tác cho người làm xét nghiệm, tránh sai sót lây nhiễm, cho phép thực hiện đồng thời nhiều mẫu Đọc kết máy không phụ thuộc vào chủ quan người làm xét nghiệm Có thể lưu các bảng kết các thông số kỹ thuật thuận lợi cho việc kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm Giá thành xét nghiệm tương đối rẻ Hiện nay, phương pháp ELISA định lượng kháng thể sởi sử dụng rộng rãi hầu hết các phòng thí nghiệm ở Việt Nam dạng các Kít thương mại hãng IBL, Siemens, biomarker, Abcam…Các kit có giá thành chất lượng chẩn đoán khác So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu tính đáng tin cậy các kít phản ứng để lựa chọn sử dụng có ý nghĩa quan trọng cơng tác phát hiện kiểm soát sởi Nguyên lý kỹ thuật ELISA xác đinh nồng độ IgG IgG kháng vi rút sởi có huyết bệnh nhân gắn với kháng nguyên phủ bề mặt nhựa Tiếp theo cộng hợp (kháng thể kháng IgG người gắn enzym) gắn với IgG đặc hiệu với vi rút sởi – kháng nguyên gắn nhựa Cho chất, phản ứng enzyme – kháng thể chuyển màu xanh Dừng phản ứng đọc mật độ quang học So sánh mật độ quang học với mẫu kháng thể chuẩn 25 Chuẩn bị sinh phẩm ˗ Để sinh phẩm, nhựa ở nhiệt độ phòng trước thực hiện phản ứng ˗ Pha loãng cộng hợp theo tỷ lệ + 50 dung dịch pha loãng cộng hợp (nếu dùng nhựa cho 250 μl cộng hợp với 12,5 ml dung dịch pha loãng Lắc nhẹ ˗ Dung dịch pha loãng mẫu: cứ 50ml đệm POD cho 2,5ml dung dịch mầu Lắc nhẹ trước dùng Số lượng dung dịch pha loãng mẫu sử dụng cho nhựa 20 ml ˗ Pha chất: 1ml chất TMB cho 10ml dung dịch đệm pha chất Chú ý pha lọ mầu để tránh ánh sáng Quy trình kỹ thuật ˗ Pha lỗng mẫu, kháng thể chuẩn theo tỷ lệ 1+20: 20 μL huyết hoặc kháng thể chuẩn với 400 μL dung dịch pha loãng mẫu Trộn đều votex (mẫu kháng thể chuẩn sau pha có thể bảo quản ở nhiệt độ – 8oC qua đêm) ˗ Lấy nhựa đủ để làm số mẫu (1 mẫu giếng) cộng thêm mẫu cho huyết chuẩn Đánh dấu mã mẫu mẫu chuẩn sơ đồ hiển thị các giếng nhựa (Hình 1) A1 A2 P/N P/N Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu P/N P/N Hình Ví dụ sơ đồ cho mẫu (A1: Giếng phủ kháng nguyên; A2: giếng chứng kháng nguyên; P/N kháng thể chuẩn) ˗ Cho 200 μL dung dịch pha loãng mẫu (không cho dung dịch mầu) vào giếng nhựa 26 ˗ Cho 20 μL kháng thể chuẩn P/N pha loãng (1+20) vào cặp giếng nhựa (A1: phủ kháng nguyên vi rút sởi ; A2: chứng âm kháng nguyên) ˗ Tiếp theo cho 20 μL mẫu huyết pha loãng vào giếng cặp giếng (Hình 1) Cặp giếng cuối cho 20 μL kháng thể chuẩn P/N Lưu ý không cho đồng thời kháng thể chuẩn ở cặp giếng cặp giếng cuối Cần phải làm theo thứ tự kháng thể chuẩn P/N ở hàng giếng đầu tiên, các mẫu huyết cuối kháng thể chuẩn P/N ở hàng giếng cuối Trộn đều các giếng cách dùng pipet hút lên, xịt xuống (thời gian trộn mẫu khoảng 15 phút/1 phiến nhựa, có thể sử dụng pipet đa kênh để tiết kiệm thời gian trộn mẫu) Sau trộn mẫu, đậy nhựa miếng dán ˗ Ủ nhựa 60 ± phút ở nhiệt độ +37 ± °C ˗ Rửa nhựa cách hút bỏ toàn dung dịch giếng, cho 0.3 mL dung dịch pha loãng POD, rửa lần ˗ Cho cộng hợp: Cho 100 μL cộng hợp pha loãng vào giếng ˗ Ủ nhựa 60 ± phút ở nhiệt độ +37 ± °C ˗ Rửa nhựa lần ˗ Cho chất: Cho 100 μL dung dịch chất pha vào giếng ˗ Ủ nhựa ở nhiệt độ +18 đến +25 °C 30 ± phút, tránh ánh sáng ˗ Dừng phản ứng: cho 100 μL dung dịch dừng phản ứng (Chú ý giữ tốc độ cho dung dịch dừng phản ứng giống cho chất) ˗ Đo mật độ quang học: bước sóng 450 nm vịng sau dừng phản ứng, bước sóng giao động 615 690nm) Đọc kết Nội kiểm ˗ Tính giá trị ΔA mẫu (bằng giá trị OD mẫu ở giếng có kháng nguyên trừ giá trị OD ở giếng kháng nguyên chứng) ˗ Giá trị ΔA kháng thể chuẩn phải nằm khoảng giá trị thấp cao cung cấp ở lô sản phẩm theo bảng barcode 27 ˗ Sự khác biệt ΔA kháng thể chuẩn ở đầu cuối nhựa không vượt quá ±20 % giá trị trung bình các giá trị ˗ Nếu các giá trị kháng thể chuẩn không đạt các điều kiện kết mẫu khơng chấp nhận phải làm lại thử nghiệm Đánh giá kết Giá trị ΔA kháng thể chuẩn cung cấp bởi sinh phẩm (bảng barcode) Chỉ số hiệu chỉnh = ——————————————————————————— Giá trị trung bình ΔA kháng thể chuẩn ở phản ứng Tính số hiệu chỉnh theo công thức Giá trị ΔA mẫu huyết cần phải nhân với số hiệu chỉnh Lưu ý thực hiện nhiều nhựa cần tính số hiệu chuẩn riêng cho nhựa Kết định tính, có độ nhạy 99.6 % Mẫu âm tính ΔA < 0.100 (cut-off) Mẫu dương tính ΔA > 0.200 Khơng xác định 0.100 ≤ ΔA ≤ 0.200 Với mẫu bệnh phẩm không xác định cần phải làm lại thử nghiệm giữ nguyên kết lần thử nghiệm đầu mẫu khơng xác định, mẫu có thể âm tính hoặc dương tính Kết định lượng Tính kết các mẫu có giá trị ΔA cao ngưỡng (cut off) thấp 2.5 Các mẫu có giá trị ΔA sau khơng tính kết Mẫu có giá trị ≥ 2.5 tiến hành pha loãng mẫu ở độ pha loãng cao làm lại thử nghiệm - (ΔA) < 0.100 (cut-off) - (ΔA) ≥ 2.5 Kết định lượng hàm lượng kháng thể theo công thức: 28 Log10mIU/mL = α × ΔAβ Giá trị α β cung cấp theo sinh phẩm ở bảng barcode Tình trạng tồn lưu kháng thể kháng vi rút sởi Nhiều thập kỷ thực hiện tiêm chủng để phòng các bệnh ở trẻ em cho thấy các chương trình tiêm chủng thành công dẫn đến giảm mạnh tỷ lệ mắc tử vong Tuy nhiên, phổ biến kháng thể mẹ có tiêm chủng vắc xin dẫn đến hệ lụy không dự đoán trước Điều thấy rõ qua hiện tượng các trẻ nhỏ sống các quần thể có tỷ lệ tiêm chủng vắc xin cao, nơi mà vắc xin sởi dùng vài thập kỷ, gần trở nên nhạy cảm với bệnh sởi Trước người ta coi trẻ