Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát điều kiện phản ứng PSR nhằm phát hiện nhanh gen mecA trên MRSA. Kết quả đã xác định được điều kiện tối ưu của phản ứng PSR là ở nhiệt độ 65 0C trong 50 phút, với nồng độ tối ưu của mồi F1+Nr/R1+N là 1,6 µM và nồng độ tối ưu của mồi F2/R2 là 0,1 µM.
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 Khảo sát điều kiện phản ứng polymerase spiral reaction việc phát nhanh gen kháng methicillin Staphylococcus aureus Vũ Quang Hiếu1,*, Trần Thị Quỳnh Như2 Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT, Đại học Nguyễn Tất Thành Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh *vqhieu@ntt.edu Tóm tắt Staphylococcus aureus (S aureus) vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm cho người vật nuôi, đặc biệt chúng kháng lại kháng sinh methicillin Việc phát dòng S aureus kháng kháng sinh methicillin (MRSA) giúp cho việc lựa chọn kháng sinh phù hợp điều trị Trình tự gen mecA quy định tổ hợp kháng methicillin MRSA sử dụng làm biomarker cho kĩ thuật sinh học phân tử Phản ứng trùng hợp vòng xoắn - Polymerase spiral reaction (PSR) gây khuếch đại đoạn gen mecA điều kiện đẳng nhiệt không yêu cầu trang thiết bị đắt tiền Mục tiêu nghiên cứu khảo sát điều kiện phản ứng PSR nhằm phát nhanh gen mecA MRSA Kết xác định điều kiện tối ưu phản ứng PSR nhiệt độ 65 0C 50 phút, với nồng độ tối ưu mồi F1+Nr/R1+N 1,6 µM nồng độ tối ưu mồi F2/R2 0,1 µM Giới hạn phát phản ứng PSR DNA tách chiết 10-3 ng/μL tế bào vi khuẩn tế bào/μL ® 2021 Journal of Science and Technology - NTTU Đặt vấn đề MRSA (Staphylococcus aureus kháng methicillin) tác nhân gây bệnh nhiễm trùng hàng đầu người [1] Trước đây, kháng sinh methicillin sử dụng rộng rãi điều trị S aureus Tuy nhiên đến năm 1961, chủng MRSA phân lập [2] Trong khảo sát Mĩ từ 6.2004 đến 12.2005 cho thấy có 18 650 người chết nhiễm trùng MRSA [3] Cịn châu Âu, ước tính có khoảng 170 000 ca nhiễm MRSA hàng năm, gây 000 ca tử vong [4] Do đó, việc chẩn đốn chủng MRSA bệnh nhân xem tiêu chuẩn xét nghiệm, tiêu chí quan trọng điều trị bệnh nhiễm trùng Đến nay, nhiều nghiên cứu phát MRSA cách sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử thông qua việc phát gen mecA, kĩ thuật PCR xem “tiêu chuẩn vàng” [5] Tuy nhiên, kĩ thuật Đại học Nguyễn Tất Thành Nhận 14.05.2021 Được duyệt 21.06.2021 Công bố 15.07.2021 Từ khóa Staphylococcus aureus, MRSA, Polymerase Spiral Reaction, gen mecA PCR đòi hỏi sở xét nghiệm phải có đầy đủ trang thiết bị bao gồm máy luân nhiệt, bồn điện di máy đọc gel Gần đây, phương pháp phân tử phản ứng trùng hợp vòng xoắn (Polymerase Spiral Reaction PSR) cho phép khuếch đại đoạn gen đích điều kiện ổn nhiệt đáp ứng yêu cầu độ nhanh, độ đặc hiệu độ nhạy cao [6] Nhờ ưu điểm bật mà phương pháp PSR ngày nghiên cứu sâu rộng nhằm áp dụng việc phát nhanh tác nhân gây bệnh Cho đến nay, chưa thấy nghiên cứu sử dụng phương pháp PSR để phát gen mecA MRSA Do vậy, nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng phương pháp PSR nhằm xây dựng quy trình phát nhanh MRSA Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 S aureus (ATCC 33592) mang gen mecA (MRSA) làm đối chứng dương, S aureus (ATCC 29213) làm đối chứng âm, số chủng S aureus khác cung cấp Phịng Vi sinh, Viện Kĩ thuật Cơng nghệ cao Nguyễn Tất Thành Một số hóa chất sinh học phân tử bao gồm 2X WarmStart Colorimetric LAMP Master Mix (New England Biolabs (NEB), Anh), PCR kit (NEB, Anh) Agarose gel (Bioline, Anh), nước khử ion Các mồi thiết kế đặt tổng hợp Công ty Phù Sa, Việt Nam Hóa chất dùng ni cấy vi sinh gồm TSB Tryptic Soy Broth (Merch, Đức), TSA - Tryptic Soy Agar (Merch, Đức), NaCl (Biopharmaceuticals & Titrimetry), Agar 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế mồi Bộ mồi cho phản ứng PSR thiết kế vùng gen mecA MRSA với số hiệu NG_047937.1 từ ngân hàng liệu gene NCBI Các cặp mồi thiết kế theo hướng dẫn website Primer Explorer v.5 (https://primerexplorer.jp/e/), với đoạn N Nr thiết kế dựa nghiên cứu Liu cộng (2015), thay đổi vài nucleotide chèn thêm trình tự enzyme cắt BamHI [6] Sau thiết kế, cặp mồi kiểm tra độ đặc hiệu chương trình Primer Blast NCBI 2.2.2 Tách chiết DNA DNA vi khuẩn tách chiết theo phương pháp CTAB Minas cộng (2011) [7] Độ tinh hàm lượng DNA tổng số sau tách chiết kiểm tra việc đo số OD hai điểm có bước sóng 260 nm 280 nm máy đo OD (Jenway – Anh) Tỉ số OD260/280 nằm khoảng 1,8 - 2,2 chứng tỏ DNA đủ tiêu chuẩn để làm vật liệu cho phản ứng PCR, PSR 2.2.3 PCR khuếch đại gen mecA Một phản ứng PCR bao gồm loại mồi 0,4 µL (10 µM); dNTPs 0,4 µL (10 mM); enzyme Taq DNA polymerase 0,1 µL; OneTaq Standard Reaction Buffer (5X) µL; DNA mẫu (50 ng/µL) µL nước khử ion cho tổng thể tích cuối phản ứng 20 µL Phản ứng sau chạy với chu trình nhiệt: tiền biến tính 95 0C phút; 40 chu kì với biến tính 95 0C 15 giây, bắt cặp 53,7 0C 15 giây kéo dài 68 0C 15 giây; cuối bước hậu kéo dài 72 0C phút máy PCR (Cole-Parmer Ltd – UK) Quan sát kết PCR thông qua điện di gel agarose 1,5 % pha đệm TBE 1X, chạy điện 75 V, 75 phút nhận biết thuốc nhuộm GelRed Kết đọc hệ thống chụp ảnh gel (Cleaver Scientific - Anh) Sản phẩm PCR giải trình tự cơng ty VNDAT kết giải trình tự phân tích nhờ phần mềm Bioedit, Seaview Blast 2.2.4 Thiết lập phản ứng PSR Nồng độ thành phần phản ứng dựa theo dẫn nhà sản xuất Phản ứng PSR thực với tổng thể tích phản ứng 15 µL theo tỉ lệ thành phần sau: 2,4 µL mồi loại mồi F1+Nr/R1+N (10 µM); 0,3 µL loại mồi F2/R2 (10 µM); 7,5 µL LAMP master mix; µL DNA mẫu (6 ng/µL) bổ sung nước khử ion cho thể tích cuối 15 µL Hỗn hợp phản ứng ủ máy ủ nhiệt khô nhiệt độ 65 0C 60 phút Kết đánh giá thông qua thay đổi màu sắc ống mẫu dương mẫu âm sau phản ứng, đồng thời quan sát nhờ điện di gel agarose 1,5 % điện 60 V 60 phút 2.2.5 Tối ưu hóa phản ứng PSR Các thông số cần tối ưu phản ứng PSR gồm nhiệt độ, thời gian nồng độ mồi 2.2.5.1 Khảo sát nhiệt độ tối ưu Hỗn hợp phản ứng trộn với phân thành 14 nhóm ống, nồng độ, thể tích thành phần điều kiện khác không thay đổi, thay đổi nhiệt độ phản ứng Thiết lập chương trình gradient nhiệt độ (các mức nhiệt độ từ (55 – 68) 0C với mức cách 0C) máy PCR đặt ống phản ứng vào mức nhiệt độ tương ứng Các yếu tố thời gian 50 phút, nồng độ mồi 2,4 µL mồi loại mồi F1+Nr/R1+N (10 µM); 0,3 µL loại mồi F2/R2 (10 µM); lượng DNA phản ứng (6 ng/µL) giữ yên 2.2.5.2 Khảo sát thời gian tối ưu Tương tự trên, hỗn hợp phản ứng với nồng độ thể tích thành phần đồng giữ nguyên điều kiện khác, thay đổi thời gian phản ứng Thời gian tối ưu phản ứng khảo sát từ (30 – 65) phút, khoảng cách phút với điều kiện nhiệt độ tối ưu Các yếu tố nhiệt độ 65 0C, nồng độ mồi 2,4 µL mồi loại mồi F1+Nr/R1+N (10 µM); 0,3 µL loại mồi F2/R2 (10 µM); lượng DNA phản ứng (6 ng/µL) giữ yên 2.2.5.3 Khảo sát nồng độ mồi tối ưu Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 Cặp mồi F1+Nr/R1+N khảo sát khoảng nồng độ 0,4 µM - 3,2 µM, cặp mồi F2/R2 khảo sát khoảng nồng độ 0,05 µM - 0,4 µM Nồng độ mồi hỗn hợp thay đổi tương ứng với nồng độ nghiệm thức Bảng Đồng thời, điều kiện nồng độ thành phần lại phản ứng không thay đổi, tiến hành ủ phản ứng nhiệt độ thời gian tối ưu Các yếu tố thời gian 50 phút, nhiệt độ 65 0C lượng DNA phản ứng (6 ng/µL) giữ nguyên Mẫu chuẩn MRSA ATCC 33592 dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi F1+Nr/R1+N Kết điện di sản phẩm PCR Hình cho thấy giếng số xuất băng có kích thước sản phẩm gần với vạch 200 bp theo Ladder 100 bp, ước đốn băng có kích thước khoảng 208 bp Điều cho thấy cặp mồi F1+Nr/R1+N sử dụng để khuếch đại gen mecA nhân thành công đoạn gen có kích thước tương đương với kích thước gen mecA (dài 208 bp theo lí thuyết) Bảng Các nghiệm thức khảo sát mồi F2/R2 (µM) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,4 11 16 21 F1+Nr/R1+N (µM) 0,8 1,6 2,4 12 13 14 17 18 19 22 23 24 3,2 10 15 20 25 Trong đó, số - 25 nghiệm thức khảo sát nồng độ mồi tương ứng 2.2.6 Khảo sát giới hạn phát phản ứng PSR Giới hạn phát (LOD) phản ứng PSR xác định dãy nồng độ mẫu đưa vào bao gồm lượng DNA tách chiết mật độ tế bào Các LOD ghi nhận phản ứng có thay đổi màu pH nồng độ mẫu thấp Kết thảo luận 3.1 Kết 3.1.1 Thiết kế mồi Mồi thiết kế website Primer Explorer v.5 trình tự gen mecA MRSA, kết chọn hai cặp mồi có thơng số kĩ thuật tốt nhất, trình tự mồi trình bày Bảng Bảng Trình tự cặp mồi phản ứng PSR Tên Độ dài Trình tự (5’-3’) mồi (bp) F2 21 GCGACTTCACATCTATTAGGT R2 22 GCCATCTTTTTTCTTTTTCTCT gattcgtacatagaaggatccTATGTTGGT F1+Nr 42 CCCATTAACTCT cctaggaagatacatgcttagCGATTGTAT R1+N 45 TGCTATTATCGTCAA 3.1.2 PCR khuếch đại gen mecA Đại học Nguyễn Tất Thành Hình Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F1+Nr/ R1+N (M) Ladder 100 bp; (-) đối chứng âm; (1) ATCC 33592 Kết đem giải trình tự sản phẩm PCR với cặp mồi F1+Nr/R1+N mẫu ATCC 33592 cho kích thước đoạn gen 166 bp Hình ảnh phổ đọc kết giải trình tự phần mềm Bioedit cho thấy peak không bị xếp chồng lên nhau, trừ số nucleotide hai đầu Điều cho thấy tín hiệu khơng bị nhiễu, kết giải trình tự tốt Các trình tự giống cột thẳng hàng SeaView cho thấy kết giải trình tự hồn tồn trùng khớp với trình tự gen mecA NCBI dùng để thiết kế mồi Trình tự sau hiệu chỉnh so sánh với trình tự GenBank chương trình Blast cho thấy kết giải trình tự có độ tương đồng 100 % với trình tự gen mecA S aureus, chứng tỏ trình tự sản phẩm PCR mẫu ATCC 33592 trình tự gen mecA Như vậy, khẳng định cặp mồi F1+Nr/R1+N khuếch đại thành công gen mecA S aureus Đồng thời độ đặc hiệu cặp mồi thiết kế kiểm tra chéo với chủng vi khuẩn khác bao gồm Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella sp Kết cho thấy mồi đoạn mồi thiết kế bắt cặp đặc hiệu khuếch đại gen mecA MRSA (Hình 2) Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 14 C 60 phút Kết Hình 4a cho thấy có thay đổi màu ống số 2, ứng với mẫu dương tính ATCC 33592 ATCC 06292 Mẫu âm tính ATCC 29213 đối chứng âm ống số 3, giữ nguyên màu hồng Đồng thời, kết điện di Hình 4b cho thấy giếng số 1, xuất vệt bôi với dải có kích thước khác Quan sát giếng số 3, khơng xuất dải Từ kết trên, chứng tỏ phản ứng PSR thực thành cơng Hình Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi F1+Nr/R1+N (M) Ladder 100 bp, (+) ATCC 33592, (1) Streptococcus pyogenes, (2) Salmonella sp, (3) Pseudomonas aeruginosa, (4) Vibrio parahaemolyticus, (5) Bacillus subtilis, (6) Vibrio cholera, (7) Enterococcus faecalis, (8) Escherichia coli, (-) đối chứng âm Phản ứng PCR với cặp mồi F2/R2 thực nhằm mục tiêu kiểm tra khả phát gen mecA mồi F2/R2 Thí nghiệm tiến hành đồng loạt với 12 mẫu DNA tách chiết từ chủng S aureus, với đối chứng dương mẫu DNA có mang gen mecA (ATCC 33592) đối chứng âm nước khử ion Kết điện di sản phẩm PCR Hình cho thấy giếng đối chứng dương xuất dải sáng có kích thước tương đương với kích thước dự đốn (khoảng 222 bp) Đồng thời, giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 có xuất dải sáng, rõ với kích thước đối chứng dương Điều chứng tỏ mẫu có chứa trình tự gen mecA Ở giếng 7, 11, 12 đối chứng âm không xuất dải, chứng tỏ mẫu khơng chứa trình tự gen mecA Kết thu được hoàn toàn phù hợp với kết kiểm tra sinh hóa dịng S aureus trước Do đó, thí nghiệm chứng minh cặp mồi F2/R2 phát thành cơng gen mecA nghiên cứu Hình Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F2/R2 (M) Ladder kb; (+) đối chứng dương; (1) 07088; (2) 07088 VR1; (3) 07088 VR2; (4) 06949; (5) 06292; (6) 42335; (7) 50426; (8) 90217; (9) 80274; (10) 57218; (11) 04772; (12) ATCC 29213; (-) đối chứng âm 3.1.3 Thiết lập phản ứng PSR Phản ứng PSR thiết lập để kiểm tra mồi thành phần phản ứng Phản ứng thực 65 Hình Kết kiểm tra thành phần phản ứng PSR a) Quan sát mắt thường, b) Quan sát điện di gel agarose Trong đó: (1) ATCC 33592; (2) 06292; (3) ATCC 29213; (4) đối chứng âm; (M) Ladder 25 bp 3.1.4 Tối ưu hóa phản ứng PSR Nhiệt độ phản ứng PSR khảo sát khoảng nhiệt độ (55 - 68) 0C, khoảng cách 0C Hỗn hợp phản ứng đặt máy PCR (Cole-Parmer Ltd – UK) thiết lập mức nhiệt độ tương ứng ủ thời gian 60 phút Kết quan sát trực tiếp mắt thường cho thấy khoảng nhiệt độ (64 - 68) 0C có thay đổi màu sắc so với đối chứng âm, màu phản ứng chuyển từ màu hồng sang màu vàng (Hình 5a)., chứng tỏ có diện DNA mạch đơi với số lượng lớn sau phản ứng Hình Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng PSR a) Quan sát mắt thường, b) Quan sát ánh sáng xanh có bổ sung SYBR Green, c) Quan sát điện di gel agarose Trong đó: (M) Ladder kb; (55 - 68) sản phẩm PSR nhiệt độ (55 - 68) 0C; (-) đối chứng âm Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 10 Kết điện di gel agarose 1,5 % Hình 5b cho kết tương tự, chứng tỏ khoảng nhiệt độ (64 - 68) 0C phản ứng có xảy khuếch đại gen mục tiêu Đặc biệt, nhiệt độ 65 0C cho dải sáng rõ nhất, cho thấy nhiệt độ khuếch đại đạt hiệu suất cao Thời gian phản ứng PSR khảo sát khoảng (30 – 65) phút, khoảng cách phút Hỗn hợp phản ứng đặt máy ủ nhiệt nhiệt độ 65 0C Khi quan sát mắt thường thấy có thay đổi màu sắc rõ ràng từ 45 phút trở (Hình 6a) Quan sát kết điện di sản phẩm PSR Hình 6b, cho thấy sau 30 phút, 35 phút xuất vệt bôi mờ, chứng tỏ phản ứng xảy chưa hoàn toàn nên số lượng sản phẩm khuếch đại cịn Từ (40 - 65) phút xuất vệt bôi với dải sáng rõ Đặc biệt, kết điện di sau 50 phút cho kết dải điện di rõ ràng, cho thấy 50 phút thời gian ngắn mà khuếch đại đạt hiệu suất cao Hình Kết khảo sát thời gian phản ứng PSR a) Quan sát mắt thường, b) Quan sát điện di gel agarose Trong đó: (M) Ladder 100 bp; (30 - 65) sản phẩm PSR sau (30 – 65) phút; (-) đối chứng âm Cặp mồi F1+Nr/R1+N khảo sát khoảng nồng độ (0,4 - 3,2) µM, cặp mồi F2/R2 khảo sát khoảng nồng độ (0,05 - 0,4) µM Phản ứng ủ nhiệt độ 65 0C 50 phút Từ kết Hình 7, 25 nghiệm thức cho kết màu phản ứng nghiệm thức tương ứng với nồng độ mồi F2/R2 0,1 µM nồng độ mồi F1+Nr/R1+N 1,6 µM có thay đổi màu sắc rõ ràng nhất, chứng tỏ phản ứng khuếch đại đạt hiệu Vì vậy, mồi F2/R2 có nồng độ 0,1 µM mồi F1+Nr/R1+N có nồng độ 1,6 µM nồng độ mồi tối ưu phản ứng PSR Đại học Nguyễn Tất Thành Hình Kết khảo sát nồng độ mồi quan sát mắt thường Trong đó: (1 - 25) sản phẩm PSR tương ứng với nghiệm thức Bảng 3.1.5 Giới hạn phát phản ứng PSR Nồng độ DNA mẫu ATCC 33592 pha loãng theo bậc 10 liên tiếp nồng độ (1 - 10-5) ng/µL dùng để khảo sát giới hạn phát DNA tách chiết với điều kiện tối ưu Kết quan sát trực tiếp mắt thường Hình 8a cho thấy thay đổi màu sắc diễn nồng độ (1, 10-1, 10-2 10-3) ng/µL Tại nồng độ DNA 10-4 ng/µL, 10-5 ng/µL màu sắc phản ứng khơng thay đổi, giữ nguyên màu hồng Từ kết trên, chứng tỏ từ nồng độ DNA 10-4 trở không xảy khuếch đại sản phẩm Từ kết luận nồng độ DNA 10-3 ng/µL nồng độ DNA thấp phát gen mục tiêu Hình Kết khảo sát giới hạn phát DNA tách chiết Trong đó: (-) đối chứng âm; (1 - 10-5) sản phẩm PSR tương ứng với nồng độ DNA pha loãng (1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 10-5) ng/µL Khảo sát giới hạn phát tế bào vi khuẩn phản ứng PSR nồng độ tế bào vi khuẩn pha loãng theo bậc 10 liên tiếp từ (5 x 105 - 1) tế bào/µL Kết quan sát trực tiếp mắt thường Hình 9a cho thấy có thay đổi màu sắc phản ứng xảy nồng độ pha loãng (5 x 105 – 5) tế bào/µL, thực phản ứng với tế bào/µL màu sắc phản ứng giữ nguyên màu hồng Từ đó, kết luận tế bào/µL nồng độ tế bào vi khuẩn thấp mà phương pháp PSR phát gen mecA Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 Hình Kết khảo sát giới hạn phát tế bào vi khuẩn (-) đối chứng âm; (5 x 105 - 1) sản phẩm PSR tương ứng với nồng độ tế bào vi khuẩn (5 x 105 - 1) tế bào/µL 3.2 Thảo luận Đặc trưng phương pháp PSR khuếch đại DNA điều kiện đẳng nhiệt, nhiệt độ phù hợp cho phản ứng dao động từ (50 - 70) 0C Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng PSR cho thấy nhiệt độ 65 0C khuếch đại đạt hiệu suất cao Đây nhiệt độ thích hợp để mồi gắn vào mạch khuôn, đồng thời nhiệt độ mà enzyme Bst DNA polymerase hoạt động tốt Trong nghiên cứu Ji cộng (2019), nhiệt độ tối ưu cho việc khuếch đại PCV3 phản ứng PSR 62 C [8] Điều cho thấy chênh lệch lớn so với nhiệt độ tối ưu khuếch đại gen mecA nghiên cứu Phương pháp PSR khuếch đại gen mục tiêu nhiệt độ nhất, khác với phương pháp PCR phải trải qua giai đoạn nhiệt độ khác Trong điều kiện sở vật chất vùng sâu, vùng xa phương pháp PSR lựa chọn phù hợp cho việc phát tác nhân gây bệnh Thời gian tối ưu nghiên cứu 50 phút, thời gian ngắn mà khuếch đại đạt hiệu suất cao Trong đó, thí nghiệm khuếch đại gen mecA phương pháp PCR truyền thống khoảng (90 - 120) phút Ngoài ra, thời gian tối ưu để khuếch đại gen mecA phương pháp LAMP 60 phút [9], [10] Từ đó, cho thấy thời gian phát gen mục tiêu phương pháp PSR nghiên cứu ngắn so với phương pháp khác Trong phản ứng PSR, mồi không hoạt động riêng lẻ phản ứng PCR mà chúng kết hợp với để bắt cặp với đoạn gen mục tiêu khuếch tạo Do đó, thay đổi nồng độ hay tỉ lệ cặp mồi có ảnh hưởng đến khả khuếch đại sản phẩm phản ứng Phương pháp PSR sử dụng (2 - 4) mồi, phương pháp LAMP phải sử dụng (4 - 6) mồi nên việc thiết kế mồi cho phản ứng PSR đơn giản Đồng thời, phương pháp PSR hạn chế xảy trường hợp primer-dimer phản ứng LAMP 11 Giới hạn phát tế bào vi khuẩn phản ứng PSR tế bào/µL, nồng độ tế bào vi khuẩn thấp mà phản ứng PSR phát gen mục tiêu Đối với DNA tách chiết, giới hạn phát phản ứng PSR 10-3 ng/µL (ứng với pg/µL) Trong đó, giới hạn phát phản ứng LAMP cho gen mecA 10 pg/µL [9] 14,7 pg/µL [10] Điều cho thấy phản ứng PSR phát gen mục tiêu nghiên cứu ngưỡng thấp ngưỡng phát phản ứng LAMP Việc phát gen mecA S aureus phương pháp PSR có nhiều ưu điểm vượt trội so với phương pháp PCR phương pháp LAMP thời gian phát ngắn, quy trình đơn giản, độ nhạy độ đặc hiệu cao Trong điều kiện phịng xét nghiệm đơn giản, khơng có đầy đủ trang thiết bị xét nghiệm phương pháp PSR triển khai kết khả thi, bảo đảm phát nhanh, xác MRSA để lựa chọn kháng sinh phù hợp cho việc điều trị Kết luận Bộ mồi thiết kế hoạt động tốt, có tính đặc hiệu cao với gen mecA MRSA Kết nghiên cứu hồn thiện quy trình phát nhanh gen mecA S aureus kĩ thuật PSR, với điều kiện phản ứng nồng độ mồi tối ưu tóm tắt Bảng Bảng Nồng độ mồi tối ưu phản ứng PSR nhiệt độ 65 0C với thời gian phản ứng 50 phút Nồng độ mồi (µM) F1+Nr R1+N F2 R2 1,6 1,6 0,1 0,1 Giới hạn phát phương pháp PSR 103 ng/µL DNA tách chiết tế bào/µL tế bào vi khuẩn Phương pháp PSR đáp ứng yêu cầu phát nhanh xác gen mecA vi khuẩn S aureus, chọn làm công cụ để phát ca bệnh nhiễm trùng MRSA Lời cảm ơn Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành, đề tài mã số 2020.01.72 /HĐ-NCKH Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 14 12 Tài liệu tham khảo Gardam M.A Is methicillin-resistant Staphylococcus aureus an emerging community pathogen? A review of the literature (2000) Can J Infect Dis, 11(4), 202-211 Jevons M.P (1961) “Celbenin” - Resistant Staphylococci BMJ Publishing Group, 1, 124-125 Klevens R.M, Morrison M.A, Nadle J et al (2007) Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States J Am Med Assoc, 298(15), 1763-1771 Köck R, Becker K, Cookson B et al (2010) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): Burden of disease and control challenges in Europe Eurosurveillance, 15(41) Pillai M.M, Latha R, Sarkar G (2012) Detection of Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus by Polymerase Chain Reaction and Conventional Methods: A Comparative Study J Lab Physicians, 4(02), 83-88 Liu W, Dong D, Yang Z et al (2015) Polymerase Spiral Reaction (PSR): A novel isothermal nucleic acid amplification method Sci Rep, Minas K, Mcewan N.R, Newbold C.J, Scott K.P (2011) Optimization of a high-throughput CTAB-based protocol for the extraction of qPCR-grade DNA from rumen fluid, plant and bacterial pure cultures FEMS Microbiol Lett, 325(2), 162-169 Ji J, Xu X, Wang X, et al (2019) Novel polymerase spiral reaction assay for the visible molecular detection of porcine circovirus type BMC Vet Res, 15(1) Nawattanapaiboon K, Prombun P, Santanirand P et al (2016) Hemoculture and Direct Sputum Detection of mecA-Mediated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus by Loop-Mediated Isothermal Amplification in Combination With a Lateral-Flow Dipstick J Clin Lab Anal, 30(5), 760-767 10 Wang X.R, Wu L.F, Wang Y, Ma Y.Y, Chen F.H, Ou H.L (2014) Rapid Detection of Staphylococcus aureus by Loop-Mediated Isothermal Amplification Appl Biochem Biotechnol, 175(2), 882-891 Investigating polymerase spiral reaction conditions in detecting anti-methicillin resistant gene (MecA) of Staphylococcus aureus Vu Quang Hieu1*, Tran Thi Quynh Nhu2 Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University Biotechnology department, Nong Lam University, Ho Chi Minh City * vqhieu@ntt.edu.vn Abstract Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the most dangerous pathogens on human and pets, especially as they can withstand methicillin Identifying MRSA S aureus strains can help with choosing proper antibiotics for treatment The mecA gene that stipulates one of the methicillin resistant genetic combination is commonly used to detect MRSA in molecular biology techniques The PSR (Polymerase Spiral Reaction) technique allows the amplification of the target gene sequence under isothermal conditions which is suitable for detection of MRSA The results showed the optimal protocol of the PSR reaction at the temperature of 65 0C, duration of 50 minutes with the optimal primer concentration of 1,6 μM F1+Nr/R1+N and 0,1 μM F2/R2 The detection limit of extracted DNA is 10-3 ng/μL and the detection limit of bacterial cells is bacterial cells/μL The optimized PSR technique in this study was capable of detecting the mecA gene with a sensitivity and specificity of 100 % Keywords PSR (Polymerase Spiral Reaction), mecA gene Đại học Nguyễn Tất Thành ... (ứng với pg/µL) Trong đó, giới hạn phát phản ứng LAMP cho gen mecA 10 pg/µL [9] 14,7 pg/µL [10] Điều cho thấy phản ứng PSR phát gen mục tiêu nghiên cứu ngưỡng thấp ngưỡng phát phản ứng LAMP Việc. .. chứng âm 3.1.3 Thiết lập phản ứng PSR Phản ứng PSR thiết lập để kiểm tra mồi thành phần phản ứng Phản ứng thực 65 Hình Kết kiểm tra thành phần phản ứng PSR a) Quan sát mắt thường, b) Quan sát. .. primer-dimer phản ứng LAMP 11 Giới hạn phát tế bào vi khuẩn phản ứng PSR tế bào/µL, nồng độ tế bào vi khuẩn thấp mà phản ứng PSR phát gen mục tiêu Đối với DNA tách chiết, giới hạn phát phản ứng PSR