Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng

Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng nông nghiệp, cung cấp lương th

MỞ ĐẦU

Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt vớithách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo Vấn đề làm sao để tăng sản lượngnông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặcbiệt của nhiều quốc gia trên thế giới Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổbiến ở nhiều nơi Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa đượccoi trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côntrùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng Theo thốngkê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêmtrọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sảnlượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%.Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biệnpháp bảo vệ

Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòngtrừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sứckhoẻ con người, vật nuôi Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng nhữngkỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch,bền vững Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically ModifiedCrops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạodòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụngthực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nôngnghiệp Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sửdụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống,nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái.Bằng các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mangnhững đặc tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực.Đến nay hàng loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen

kháng côn trùng) như gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các

chất ức chế proteaza và ỏ-amylaza… được chuyển vào thực vật nhờ các phươngpháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh.

Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiêncứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xungđiện Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất

là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens.

Với ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phươngpháp này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1].Nhiều nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêngvà gen có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang làcông cụ hỗ trợ chính trong chọn giống thực vật Ở nước ta, nghiên cứu chuyển genthực vật mới chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệSinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Côngnghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằngsông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) Hầu hết cácnghiên cứu sử dụng gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiếtkế sẵn Tuy nhiên, phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhàsáng chế và công ty/ cơ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hoặccác giải pháp hữu ích Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗithành phần trong vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với cácnhà sáng chế, cơ quan hoặc công ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyênliệu (Material Transfer Agreement, MTA) Qua các hợp đồng này, chúng ta thườngchỉ được sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc vềkhía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao Rõ ràng, để cóđược những vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnhnhững chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn phức tạp trong chuyển giao nguyên liệuvà công nghệ Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế đượccác vectơ chuyển gen thực vật nói chung và vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để

điều khiển biểu hiện gen khỏng cụn trựng nhằm mục đớch chuyển và biểu hiện cỏcgen này trong cỏc đối tượng cõy trồng ở nước ta

Trờn cơ sở ý nghĩa lý luận và thực tiễn của hướng nghiờn cứu này, chỳng tụi

đó tiến hành đề tài: “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen

khỏng cụn trựng để chuyển vào cõy trồng”, với cỏc mục đớch và nội dung nghiờn

cứu chớnh sau đõy:

Mục đích nghiên cứu

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ gen để nghiên cứu các đoạnkhởi động đặc hiệu thực vật và gen có hoạt tính kháng côn trùng Trên cơ sở đó, thiết kế

các vectơ Ti-plasmit và tạo chủng A tumefaciens phục vụ công nghệ chuyển gen nhằm

mục đích nâng cao tính kháng sâu bệnh của cây trồng.

Nội dung nghiên cứu

 Su tập và phân lập các đoạn khởi động đặc hiệu thực vật và gen có hoạt tínhkháng côn trùng.

 Thiết kế các vectơ Ti-plasmit mang gen kháng côn trùng dới sự điều khiển của

đoạn khởi động cơ định hoặc đoạn khởi động đặc hiệu thực vật trong tế bào E coli.

 Tạo các chủng A tumefaciens mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn

trùng để chuyển vào cây trồng.

 Thiết kế vectơ và biểu hiện gen kháng côn trùng trong tế bào E coli.

 Tạo kháng thể kháng protein có hoạt tính diệt côn trùng phục vụ cho nghiên cứuvà giám định cây chuyển gen.

Những đóng góp mới của luận án

Bản luận án này có những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn nh sau:

1 Đã nhân, tạo dòng và đọc trình tự đoạn khởi động của gen mã hoá sucrozasynthaza (sucrose synthase) ở giống lúa C71 có khả năng điều khiển sự biểu hiệngen đặc hiệu ở bó mạch Đây là đoạn khởi động gen đầu tiên đợc phân lập và đọctrình tự từ một giống lúa Việt Nam Trình tự của đoạn khởi động này đã đợcđăng ký trong các Ngân hàng trình tự gen quốc tế

2 Đã tạo đợc một kết cấu gen mới đó là gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn

khởi động đặc hiệu bó mạch C71S-P nhằm mục đích chuyển vào các giống lúaViệt Nam tạo khả năng kháng sâu đục thân lúa.

3 Đã thiết kế thành công 4 vectơ Ti-plasmit mới, cung cấp nguyên liệu cho cácnghiên cứu chuyển gen vào cây trồng và nghiên cứu đoạn khởi động Trong đó,

gen cryIA(c) dới sự điều khiển của đoạn khởi động Ubiquitin hoặc đoạn khởi

động của gen mã hoá sucroza synthaza ở giống lúa C71 đã đợc đa vào vectơ plasmit cải tiến và vectơ chuyển gen thế hệ mới nhất sử dụng hệ thống chọn lọctích cực (Positive Selection System)

Ti-4 Đã hoàn thiện và sử dụng phơng pháp xung điện và phơng pháp phối ba bố mẹ

để tạo 4 chủng A tumefaciens mới, trên cơ sở các chủng LBA4404 và EHA105,

mang các vectơ Ti-plasmit chứa gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng.5 Lần đầu tiên trong điều kiện Việt Nam đã thành công trong việc biểu hiện gen

cryIA(c) tổng hợp hoá học bằng vi khuẩn E coli Protein CryIA(c) tái tổ hợp sau

khi tinh chế đã đợc dùng để sản xuất kháng thể kháng CryIA(c) nhằm mục đích

sử dụng làm công cụ kiểm tra sự có mặt của sản phẩm gen cryIA(c) ở các cây

trồng đợc chuyển gen

6 Các vectơ Ti-plasmit mới đã và đang đợc Viện Công nghệ Sinh học chuyển vào

lúa và các loại cây trồng quan trọng khác Ngoài ra, 2 chủng A tumefaciens mới

cũng đã đợc chuyển giao cho Viện Nghiên cứu Ngô (thuộc Bộ Nông nghiệp và

Phát triển Nông thôn) nhằm triển khai các nghiên cứu hợp tác chuyển gen cry

vào cây ngô Việt Nam.

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Vi khuẩn đất A tumefaciens và phơng pháp chuyển gen

vào cây trồng

1.1.1 A tumefaciens và hiện tợng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên

Những năm đầu thế kỷ 20, Smith và Townsend đã phát hiện ở một số cây hailá mầm xuất hiện những khối u và tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn đất

A tumefaciens Đến cuối những năm 1960, mối quan hệ giữa khối u và vật liệu ditruyền của loài vi khuẩn này đã đợc Braun và Schilperoort khám phá A tumefaciens

có khả năng xâm nhiễm thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết th ơng của

cây chủ Trong tự nhiên, A tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt

là nhóm thực vật có hoa Một vài loài cây một lá mầm thuộc họ hành tỏi và thuỷ tiên

mẫn cảm yếu với A tumefaciens [34]

Hoàn toàn khác với mô và tế bào thực vật bình thờng, khối u do A tumefaciens

sinh ra phát triển rất mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trởng (auxin và

cytokinin) Sở dĩ nh vậy vì A tumefaciens đã chuyển một đoạn ADN (Transfer DNA

- T-ADN) sang tế bào thực vật và T-ADN điều khiển quá trình sinh tổng hợp cáchợp chất đó Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp opin là các axit amin (aminoacid - aa) đặc biệt và các dẫn xuất của đờng Dạng opin đợc tổng hợp có thể lànopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin phụ thuộc vào từng chủng

Agrobacterium Trong đó, octopin và nopalin là hai dạng opin phổ biến Opin đợc vi

khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hoáopin trên plasmit gây khối u thực vật (Tumour inducing plasmid - Ti-plasmit) [44],[109].

Cơ chế phân tử của sự hình thành khối u đã đợc quan tâm nghiên cứu nhằm tìmra phơng thức phòng trừ bệnh cho cây Tuy nhiên, khi phát hiện ra Ti-plasmit và khảnăng tự chuyển T-ADN vào genom thực vật, ngời ta đã đặc biệt chú ý và khai tháckhả năng sử dụng chúng nh một vectơ tự nhiên để chuyển các gen quan tâm vào thựcvật nhằm tạo cây trồng mang những tính trạng mong muốn [34], [37], [54]

1.1.1.1Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmit

Zaenen & đtg, Đại học Ghent (Bỉ) là nhóm tác giả đầu tiên phát hiện A.tumefaciens mang một cấu trúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể chứa hầu hết các gen

liên quan đến sự hình thành khối u Tuy nhiên, họ nghĩ rằng đó là bản sao của mộtloại virut xâm nhiễm vi khuẩn Thực tế, yếu tố di truyền này chính là một plasmitkhổng lồ với kích thớc khoảng 200 kb Các chủng vi khuẩn có quan hệ gần gũi, nh

vi khuẩn tạo nốt sần ở rễ (Rhizobium trifolii) và ở lá (Phyllobacteriummyrsinacearum) cũng có khả năng hình thành khối u ở thực vật khi bị nhiễm Ti-

plasmit Điều đó khẳng định vai trò quan trọng của yếu tố lây nhiễm nằm trên plasmit đối với sự hình thành khối u ở cây chủ [54].

Ti-Ti-plasmit (hình 1.1) đợc tìm thấy ở tất cả các chủng A tumefaciens gây

nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dới 300C Đây là một phân tử ADN mạch vòng,sợi kép và tồn tại trong tế bào nh một đơn vị sao chép độc lập Phân tích di truyềncho thấy, Ti-plasmit dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, đều có4 vùng tơng đồng, trong đó vùng T-ADN và vùng gây độc (Virulence Region - vùngVIR), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật Hai vùng còn lại chứagen mã hoá cho việc sao chép plasmit (Origin of replication) và chuyển nạp(Conjugative transfer) [34]

Trên Ti-plasmit, chỉ có vùng T-ADN đợc chuyển từ vi khuẩn sang genom củacây bị bệnh và tồn tại bền vững ở đó [87] Tuy nhiên, vùng này lại không mã hoánhững sản phẩm làm trung gian cho quá trình chuyển T-ADN mà cần có sự trợ giúpđặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn

(chv genes) Vùng VIR dài khoảng 40 kb đảm nhận chức năng gây nhiễm ở

Ti-plasmit dạng octopin, vùng VIR chứa tới 24 gen gây độc Sản phẩm protein do cácgen này mã hoá đã kích thích sự tách biệt T-ADN, bao bọc che chở và giúp chúng

tiếp cận với genom của cây chủ Ngoài các gen vir, các gen trên nhiễm sắc thể củaA tumefaciens (nh chvA và chvB) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâmnhập của A tumefaciens vào thành tế bào thực vật [34], [109]

Hình 1.1 Bản đồ Ti-plasmit dạng octopin

1.1.1.2Cấu trúc và chức năng của đoạn T-ADN

Trong genom của cây bị khối u, số lợng bản sao của T-ADN dao động từ mộtvài đến hơn 10 Chúng có thể nằm trên cùng một locut hoặc tách rời và gắn với cácvùng khác nhau trên genom thực vật một cách ngẫu nhiên ở cà chua, 7 đoạn T-

ADN đã gắn vào 5 nhiễm sắc thể thực vật, trong khi ở Crepis capillaris, T-ADN chỉ

đợc tìm thấy trên 3 nhiễm sắc thể [109].

Kết quả phân tích trình tự gen trên T-ADN ở các Ti-plasmit khác nhau chothấy, T-ADN đợc giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần nh hoàn toàn từ khoảng25 bp và gọi là đoạn biên Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển và xâmnhập của T-ADN vào tế bào thực vật ở đoạn biên phải (Right Border - RB) có yếu

tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển TADN Đoạn biên trái (Left Border

-LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-ADN và là dấu hiệu để quá trình nàykết thúc bình thờng [147], [152] ở Ti-plasmit dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vàogenom thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb Trong khi, ở Ti-plasmit dạngoctopin, đoạn T-ADN này chỉ dài 13 kb ở một số mô thực vật, khối u lại chứa mộtđoạn ADN kích thớc 8 kb [208] T-ADN mang rất nhiều gen nh: (1) Các gen mã hoánhững enzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) Các gen gây khối u nh

tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin

và cytokinin [34], [109]

1.1.1.3Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật

Các tế bào cây bị tổn thơng sẽ tiết ra các hợp chất dẫn dụ hoá học vi khuẩn

nh acetosyringon, α-hydroxy-acetosyringon Dới tác dụng của các hợp chất này, A.tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bàothực vật Quá trình này đợc sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và đoạn biên phải,

trái [32], [34] Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen

vùng VIR hoạt động và tăng cờng biểu hiện Khi vi khuẩn xâm nhiễm tế bào thựcvật qua vết thơng, sản phẩm gen virA sẽ nhận biết sự có mặt và tơng tác với các phân

tử acetosyringon rồi truyền thông tin ngoại bào này vào trong tế bào dẫn đến sự hoạtđộng của các protein VirG Tiếp theo, VirG lại kích hoạt các gen gây độc khác nh

virB, virC, virD và virE cũng nh tăng cờng mức độ phiên mã của virG [34], [44],[144] Sau đó, virD hỗ trợ quá trình tách T-ADN thành hai sợi đơn Một sợi sẽ

chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5' đi trớc Sợi đơn còn lại sẽ làm khuôn để tổnghợp nên sợi ADN bổ sung mới Trong quá trình di chuyển, sợi ADN đơn đợc gắn với

protein VirE để chui qua rất nhiều màng trớc khi vào đợc đến nhân tế bào thực vật.

Protein VirB nằm trên màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-ADN

sợi đơn sang tế bào thực vật (hình 1.2) [209], [210] Quá trình chuyển T-ADN nàygần giống với quá trình tiếp hợp ở vi khuẩn, trong đó protein VirB tơng đơng với yếutố F, hoạt động nh một cầu nối chuyển gen Sau khi T-ADN qua màng tế bào, chúngđi thẳng vào nhân và kết hợp với genom thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên Tại đó,các gen trên T-ADN, nhờ sự điều khiển của gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sảnsinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bàolân cận dẫn đến sự hình thành khối u

Hình 1.2 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật [208]

1.1.2 Công nghệ gen thực vật và kỹ thuật chuyển gen nhờ A tumefaciens

1.1.2.1 Hệ thống chuyển gen nhờ A tumefaciens

Nhìn chung, hệ thống chuyển gen này bao gồm các giai đoạn: (i) Chuyểnvùng T-ADN vào genom thực vật; (ii) Biểu hiện gen quan tâm (Gene of Interest)trong tế bào thực vật; (iii) Tái sinh tế bào thực vật thành cây hoàn chỉnh Những yếu

tố quan trọng và cần thiết cho hệ thống chuyển gen này bao gồm: (1) Các gen vir;

(2) Đoạn biên phải và trái; (3) Vùng T-ADN: ngoài hai đoạn biên, hầu hết các gentrên T-ADN có thể đợc loại bỏ và thay thế bằng các gen quan tâm để chuyển vàocây trồng Đoạn T-ADN đợc cải biến di truyền này gọi là T-ADN bị vô hiệu hoá(disarmed T-DNA), mất chức năng gây khối u; (4) Vùng mang các yếu tố điều

khiển cis: nh đoạn khởi động và đoạn kết thúc hỗ trợ và điều khiển sự biểu hiện các

gen; (5) Các gen chỉ thị chọn lọc [71].

Các loại vectơ Ti-plasmit nhân tạo: Ti-plasmit tự nhiên có kích thớc quá lớnnên rất khó để sao chép ở mức phân tử cũng nh không đơn giản để tiến hành chuyểngen Mặt khác, chúng lại chứa các gen tổng hợp hoocmon sinh trởng thực vật vàopin không cần thiết và gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không đợc dùng trựctiếp làm vectơ Trên cơ sở này, Ti-plasmit đã đợc nghiên cứu cải biến nh cắt bỏ cácgen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng (MultiCloning Site - MCS) tạo hai hệ thống vectơ chuyển gen hiệu quả: vectơ liên hợp (co-integrate vector) và vectơ hai nguồn (binary vector) [197] Nhờ vậy, cây trồng đợcbiến nạp Ti-plasmit cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh vàphát triển bình thờng [66], [90]

a) Vectơ liên hợp: đợc xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tơng đồng

nằm trên plasmit vi khuẩn (nh vectơ của E coli) với vùng T-ADN trên Ti-plasmitcủa A tumefaciens Trong đó, ngời ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ vùng mã hoá chức

năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn ADN mới trong Ti-plasmit (hình 1.3).Nh vậy, có ba loại vectơ tham gia vào hệ thống vectơ liên hợp: (1) Ti-plasmit: cácgen gây khối u đã bị vô hiệu hoá bằng cách thay thế vào đó gen kháng kanamycincủa vi khuẩn (Hệ thống vectơ SEV) hoặc một đoạn trình tự của vectơ pBR322 (Hệthống vectơ pGV); (2) Vectơ trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thớc nhỏvà đợc sử dụng để bổ trợ chức năng không u việt của Ti-plasmit (kích thớc lớn và

thiếu vùng MCS) Chúng đợc nhân lên trong E coli và chuyển sang A tumefaciensnhờ quá trình tiếp hợp Do không thể sao chép trong A tumefaciens nên chúng mangnhững đoạn ADN tơng đồng với T-ADN (3) Vectơ trợ giúp: tồn tại trong E coli, có

kích thớc nhỏ, chứa các gen di động (mobilization) và gen chuyển (transfer) giúp

cho quá trình tiếp hợp và chuyển gen vào A tumefaciens [197]

Khi tiếp hợp, Ti-plasmit và vectơ trung gian đã xảy ra quá trình tái tổ hợp, gen

quan tâm đợc chuyển từ E coli sang vùng T-ADN của A tumefaciens để tạo ra cấu

trúc T-ADN liên hợp Nh vậy, vectơ liên hợp thờng bao gồm các thành phần chính:

(1) Các vị trí tạo dòng thích hợp; (2) Các gen vir; (3) Đoạn biên phải và trái; (4) Genquan tâm; (5) Chỉ thị chọn lọc vi khuẩn hoạt động trong E coli và A tumefaciens;(6) Chỉ thị chọn lọc thực vật; (7) Vùng sao chép trong E coli [186] Vectơ pGV3850

là một vectơ liên hợp điển hình do Zambryski & đtg [207] thiết kế Các gen gâykhối u trên Ti-plasmit dạng nopalin (C58) đã bị loại bỏ và thay thế bằng pBR322.Gen quan tâm đợc tạo dòng trong pBR322 và đợc đa vào vùng T-ADN của

pGV3850 thông qua quá trình tái tổ hợp với sự trợ giúp của pGJ28 và pR64drd11trong tế bào E coli GJ28 Ngoài pGV3850, hàng loạt vectơ liên hợp khác cũng đã đ-

ợc sử dụng nh pMON200, pMON273, pGV831

Mặc dù, vectơ liên hợp đợc thiết kế cho phép sự tái tổ hợp đặc hiệu vị trí dựa

trên hệ thống tái tổ hợp của phagơ P1 (nh thế hệ wP1/ oxP-Cre), nhng vectơ này ít

đ-ợc sử dụng, do:

(i) Những trình tự tơng đồng rất dài giữa Ti-plasmit và plasmit của E coli

gây khó khăn khi thao tác và sử dụng;

(ii) Hiệu quả chuyển gen thấp với số lợng bản sao của vectơ rất ít [197].

Hình 1.3 Sơ đồ vectơ liên hợp

b) Vectơ hai nguồn: Trên cơ sở phát hiện vùng VIR không cần nằm trên cùng một

plasmit với vùng T-ADN mà vẫn điều khiển đợc sự chuyển và xâm nhập của T-ADN vàogenom thực vật, ngời ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống chuyển gen thực vật nhờvectơ hai nguồn trong đó vùng T-ADN và vùng VIR nằm trên hai plasmit khác nhau nhng

trong cùng một chủng A tumefaciens Có hai loại vectơ đợc sử dụng trong hệ thống vectơ

hai nguồn: (1) Plasmit nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng chứa gen quan

tâm trên T-ADN, đoạn biên phải và trái, chỉ thị chọn lọc và sao chép trong E coli và A.tumefaciens, chỉ thị chọn lọc thực vật; (2) Ti-plasmit trợ giúp: nằm trong A tumefaciens,

với toàn bộ vùng VIR đợc giữ lại nhng loại bỏ hoàn toàn vùng T-ADN và đoạn biên phải,trái (hình 1.4) [104], [105]

Hình 1.4 Sơ đồ vectơ hai nguồn

Nhìn chung, quá trình biến nạp ở vectơ hai nguồn diễn ra nh sau: (i) Plasmit

nhỏ đợc nhân lên trong E coli, sau đó đợc chuyển trực tiếp hoặc qua quá trình tiếphợp vào tế bào A tumefaciens chứa sẵn Ti-plasmit trợ giúp; (ii) Tế bào thực vật đợcnuôi cấy đồng thời với A tumefaciens để chuyển T-ADN vào genom thực vật; (iii)

Chọn lọc tế bào thực vật trong những điều kiện thích hợp [37]

Thực tế cho thấy, plasmit với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững

trong E coli khi cả hai vùng này cùng hoạt động Tuy nhiên, vectơ hai nguồn có

một số u điểm nh: (i) Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmit; (ii) Kích

thớc vectơ khá nhỏ Nhờ vậy, hiệu quả quá trình chuyển gen từ E coli sang A.tumefaciens đã tăng lên Hiện nay, vectơ hai nguồn đợc sử dụng rộng rãi với rất

nhiều loại đợc thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen nh:

● Thế hệ vectơ pGA bao gồm: (1) Vùng sao chép trong E coli và A tumefaciens

có nguồn gốc từ RK2; (2) Yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình tiếp hợp; (3) Đoạn

biên phải và trái; (4) Gen mã hoá neomycin phosphotransferaza II (neomycin

phosphotransferase II gene - nptII) kháng kanamycin và G418 trong thực vật; (5)

Vùng MCS Một số vectơ đặc biệt trong thế hệ pGA nh pGA580, pGA581-583 đã

đ-ợc thiết kế với: (i) vùng sao chép ColE1 hoạt động trong E coli (nguồn gốc từpBR322), và một đoạn trình tự chứa vị trí cos của phagơ Lambda nhằm phân lập các

đoạn có kích thớc lớn tới 40kb; (ii) vùng MCS nằm kề gen mã hoá chloramphenicol

acetyltransferaza (chloramphenicol acetyltransferase gene - cat) khuyết đoạn khởi

động tạo điều kiện để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của đoạn khởi động; (iii) Cóvùng MCS nằm giữa đoạn khởi động thực vật và đoạn kết thúc để gắn và biểu hiệncác gen quan tâm [31].

● Hệ thống vectơ pCG với: (1) Vùng sao chép có nguồn gốc từ pRiHRI của A.

rhizogenes giúp pCG bền vững hơn trong A tumefaciens so với vùng sao chép từRK2; (2) Vùng ColE1 hoạt động trong E coli [140].

● Thế hệ vectơ pCIT: có chứa vùng MCS và chỉ thị chọn lọc thực vật, nh gen mã

hoá hygromycin phosphotransferaza (hygromycin phosphotransferase gene - hpt)kháng hygromycin ở vectơ pCIT30, hoặc nptII ở vectơ pCIT101-104 Các vectơkhác có vị trí Lambda cos cho phép phân lập các đoạn có kích thớc lớn tới 46 kb vàchứa các vùng cần thiết để chuyển gen nhờ A tumefaciens [137].

● pGPTV: chứa gen chọn lọc thực vật, nh nptII, hpt, gen mã hoá phosphinothricin

acetyl transferaza (phosphinothricin acetyl transferase gene - bar) nằm kề vị trí LB

nhằm tăng cờng khả năng chuyển gen quan tâm vào tế bào thực vật và biểu hiện genchỉ thị chọn lọc [37].

● pPZP: có kích thớc nhỏ và rất đa năng với các đặc tính: (1) Chứa đoạn biên phải và trái

của pTiT37; (2) Các vùng ColE1 và pVS1 để sao chép trong E coli và A tumefaciens; (3)

Chỉ thị chọn lọc vi khuẩn nh chloramphenicol (pPZP100) hoặc Spectinomycin (pPZP200);(4) Chỉ thị chọn lọc thực vật nh gen kháng kanamycin, gentamycin; (5) Ngoài ra, pPZP cònchứa đoạn lacZ với vùng MCS của pUC18 nằm giữa đoạn biên phải và gen chọn lọc thựcvật [90].

● pBECK2000: có chứa đoạn biên phải và trái tổng hợp nhân tạo và gen bar Hơn

nữa, chúng sử dụng hệ thống tái tổ hợp đặc hiệu vị trí phagơ P1 Cre/ lox P cho phép

quá trình chuyển và xâm nhập gen chọn lọc và gen quan tâm vào genom thực vật đợc

diễn ra đồng thời (trên cùng T-ADN) hoặc trên hai đoạn T-ADN khác nhau của A.tumefaciens Thế hệ vectơ này cũng cho phép cắt bỏ gen chọn lọc khỏi genom thực

vật ở những vị trí đặc hiệu sau khi chúng đã đợc biến nạp vào tế bào thực vật [142].

● Vectơ hai nguồn BAC (Binary-BAC: BiBAC): rất phù hợp để chuyển các phân

tử ADN có kích thớc lớn tới 150 kb vào genom thực vật BiBAC có chứa vùng sao

chép đơn trong E coli và A tumefaciens Plasmit trợ giúp mang nhiều bản sao củacác gen vir giúp cho T-ADN kích thớc rất lớn vẫn đợc chuyển nguyên vẹn vào

genom thực vật [93], [94]

● pGREEN: là plasmit kích thớc nhỏ với: (1) Vùng sao chép có phổ vật chủ rộng

ORI pSa và vùng ColE1 có nguồn gốc từ pUC; (2) Gen rep A mã hoá chức năng saochép trong E coli và A tumefaciens nằm trên plasmit tơng thích (pSoup) trong A.tumefaciens; (3) Vùng MCS từ pBlueScript cho phép sắp xếp các gen chọn lọc và

gen quan tâm theo ý muốn [96], [97]

1.1.2.2 Thành tựu chuyển gen vào cây trồng nhờ A tumefaciens

Một trong những thí nghiệm chuyển gen đầu tiên đã sử dụng A tumefaciensđể đa gen kháng kháng sinh vào cây thuốc lá [99] Sau đó, A tumefaciens đã đợc

chứng minh là một phơng tiện rất hiệu quả để đa gen quan tâm vào rất nhiều loàicây trồng quan trọng [57].

● Chuyển gen vào cây hai lá mầm: Đến nay, trên đối tợng cây hai lá mầm,

ph-ơng pháp chuyển gen nhờ A tumefaciens đợc đánh giá là hiệu quả nhất và đợc thực hiện

khá đơn giản với sự hỗ trợ của các chỉ thị chọn lọc Đầu những năm 1980, các cây thuốc lá

mang T-ADN với gen mã hoá alcohol dehydrogenaza (alcohol dehydrogenase - Adh) củanấm men và nptII đã đợc tái sinh [110] Firoozabady & đtg cũng đã thu đợc cây bôngchuyển gen khi sử dụng những mảnh lá mầm từ hạt nảy mầm 12 ngày tuổi nuôi cấy với A.tumefaciens mang Ti-plasmit có chứa gen nptII [78] Từ đó tới nay, rất nhiều loài cây đã đ-

ợc chuyển gen thành công, nh cà chua, khoai tây, cải, hớng dơng, da hấu, khoai lang [115],

[202] Trong những điều kiện đặc biệt, A tumefaciens cũng có thể chuyển đợc gen vào

genom của đậu tơng và nhiều loài cây hai lá mầm khác [155]

● Chuyển gen vào cây một lá mầm: Cho đến những năm gần đây, phơng

pháp này vẫn còn ít thành công trên cây một lá mầm Nguyên nhân có thể do cây một

lá mầm không mẫn cảm với sự xâm nhiễm của A tumefaciens Hiệu quả chuyển genthấp cũng có thể do sự cản trở trong quá trình biến nạp nh: sự dẫn dụ hoá học của A.tumefaciens với các tế bào thực vật bị tổn thơng, sự gắn kết của A tumefaciens vào tếbào thực vật, sự cảm ứng của những phân tử nhận biết ở thực vật với các gen vir, sự sao

chép T-ADN, sự chuyển và xâm nhập của T-ADN vào genom thực vật [192] Mặc dùvậy, rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu và chuyển genthành công vào ngô, lúa, lay-ơn, măng tây và các loài cây khác bằng cách chọn lựanguyên liệu ban đầu, kỹ thuật tái sinh cây, điều kiện nuôi cấy mô, vectơ và chủng vikhuẩn sử dụng thích hợp [49], [72], [147], [163] Trên đối tợng cây ngô, kỹ thuật táisinh cây sau biến nạp đã thành công khi sử dụng “siêu vectơ” hai nguồn (super binaryvector) trong đó phôi ngô cha trởng thành của các dòng ngô lai nh A188, Hi II đợc gây

nhiễm bởi các chủng A tumefaciens mang thêm các bản sao của virB, virC, và virG[152] Ishida & đtg đã đa ra phơng pháp nuôi cấy Agrobacterium mang vectơ hai

nguồn với phôi ngô cha trởng thành cho hiệu quả chuyển gen tăng từ 5% lên 30%[112] Năm 2002, sử dụng hệ thống vectơ hai nguồn chuẩn, Frame & đtg đã hoàn chỉnh

quy trình biến nạp gen vào ngô [80] ở lúa, Hiei & đtg đã sử dụng chủng A.tumefaciens gây độc và vectơ hai nguồn đặc biệt mang một vài gen vir Trong số rất

nhiều cây chuyển gen thu đợc, có khoảng 35% cây mang 1 bản sao của gen chuyển,còn lại mang từ 2 đến 4 bản sao [102] Vijayachandra & đtg đã tập trung nghiên cứu

khả năng cảm ứng của các mô lúa với các gen vir nhằm tìm ra loại mô thích hợp nhất

để chuyển gen vào lúa [192] Riazuddin & đtg đã sử dụng vectơ chứa gen cryIA(c) dớisự điều khiển của Ubi-P và gen hpt để chuyển vào lúa tạo khả năng kháng côn trùng ăn

lá [166] Komari & đtg đã sử dụng vectơ với 2 đoạn trình tự T-ADN mang 2 gen khácnhau để chuyển vào lúa và đã thu đợc rất nhiều thể biến nạp, trong đó đã chứng minh đ-ợc sự xâm nhiễm và phân ly của T-ADN ở thế hệ R0 và R1 [124].

Nhờ kỹ thuật chuyển gen hiệu quả này, gen quan tâm có thể dễ dàng đợc

chuyển vào genom thực vật và đợc điều khiển biểu hiện ở những mô, cơ quan đặcbiệt trong những giai đoạn phát triển nhất định Số lợng gen quan tâm đợc tạo dòng,đa vào vectơ thích hợp để chuyển vào cây trồng ngày một nhiều và sản phẩm củaquá trình chuyển gen là hàng loạt cây trồng mang những tính trạng mong muốn

1 2thiết kế vectơ mang gen mã hoá protein có hoạt tính diệtcôn trùng để chuyển vào cây trồng nhờ a tumefaciens

Hàng năm chi phí cho hoá chất nông nghiệp toàn cầu chiếm khoảng 7,8 tỷ đôla Mỹ [154] Hơn nữa, sử dụng thuốc trừ sâu hoá học còn ảnh hởng nghiêm trọngđến môi trờng sinh thái Mặc dù lợng hoá chất đợc sử dụng rất nhiều, thiệt hại docôn trùng gây hại thực vật vẫn chiếm hơn 10% tổng sản lợng hàng năm [35] Ngoàira, quần thể sâu hại có khả năng kháng thuốc trừ sâu hoá học đã tăng lên hơn 500loài [126] Vì vậy, hớng chiến lợc thiết kế vectơ mang gen kháng côn trùng đã mở ratriển vọng mới trong công nghệ chuyển gen nhằm tạo cây trồng tự kháng sâu bệnh.Rất nhiều loài cây trồng đã nhận đợc gen kháng côn trùng và hình thành khả năngdiệt côn trùng gây hại.

1.2.1 Các loại vectơ chính

Hiện nay có khá nhiều loại vectơ, nh plasmit, cosmit, phagơ, nhiễm sắc thểnhân tạo của vi khuẩn và nấm men Plasmit rất thông dụng Các loại vectơ khác th-ờng đợc sử dụng cho các mục đích đặc hiệu hơn Việc nghiên cứu, ứng dụng genquan tâm cũng nh các gen kháng côn trùng thờng bắt đầu bằng kỹ thuật thiết kế cácvectơ plasmit này Tiến bộ đáng kể đạt đợc khi hệ thống vectơ chuyển gen thực vậtthế hệ mới ra đời giúp tăng năng suất, chất lợng cây trồng và cải thiện môi trờngsinh thái.

1.2.1.1 Vectơ tạo dòng

Đây là các plasmit nằm ngoài nhiễm sắc thể có kích thớc nhỏ và chứa genchọn lọc đợc sử dụng để tạo dòng các đoạn ADN Chúng đợc phát hiện đầu tiên ở vikhuẩn, sau đó không ngừng đợc cải tiến với nhiều đặc tính quý: (1) Plasmit thế hệthứ nhất nh ColE1, pSC101 nguồn gốc tự nhiên có rất ít các đặc tính cần thiết; (2)

Plasmit thế hệ thứ hai nh pBR322 đợc thiết kế nhân tạo trên cơ sở tập trung các tính

trạng quý của plasmit tự nhiên và đợc sử dụng để biến nạp gen quan tâm vào E colinhằm tạo dòng và nhân lên với lợng lớn Chúng thờng chứa vùng sao chép trong E.coli, chỉ thị chọn lọc vi khuẩn và vùng MCS Plasmit pBR322 và các thế hệ vectơ

biểu hiện có nguồn gốc từ pBR322 khá bền, tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thếhệ nuôi cấy ngay trong điều kiện không có kháng sinh chọn lọc Tuy nhiên, trongmột vài trờng hợp, plasmit có thể không bền vững khi protein tái tổ hợp có hoạt tínhđộc ảnh hởng đến sinh trởng của tế bào chủ [27]; (3) Plasmit thế hệ thứ ba: nh pUC,pSP, pBluescript có kích thớc nhỏ nên sao chép rất nhanh trong tế bào vi khuẩn.

1.2.1.2Vectơ biểu hiện

Đây là phơng tiện để biểu hiện các gen quan tâm đã đợc tạo dòng Một trongnhững hệ thống vectơ mạnh đợc sử dụng rộng rãi để tạo dòng và biểu hiện các

protein tái tổ hợp trong tế bào E coli là hệ thống vectơ pET [183] Dới sự điều khiển

của các tín hiệu phiên mã và dịch mã có nguồn gốc từ phagơ T7, gen quan tâm đợctạo dòng trong pET, sau đó đợc chuyển sang hệ thống tế bào biểu hiện mang T7ARN polymeraza (T7 RNA polymerase) dới sự điều khiển của lacUV5 và sự biểuhiện đợc cảm ứng bởi Isopropylthio-β-D-galactosit (Isopropylthio-β-D-galactoside -IPTG) Trong giai đoạn tạo dòng gen quan tâm, các tế bào chủ không chứa gen mãhoá T7 ARN polymeraza nên khả năng sản xuất các protein có hoạt tính độc đối vớitế bào chủ không xảy ra Nhờ vậy, plasmit đợc duy trì bền vững hơn Đặc biệt, thếhệ pET mới bao gồm vectơ phiên mã và dịch mã do Công ty Novagen thiết kế vớinhững đặc tính tăng cờng cho quá trình tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein: (i)Vectơ phiên mã dùng để biểu hiện gen quan tâm của tế bào nhân sơ đã mang vị trígắn ribosom và mã khởi đầu ATG; (ii) Vectơ dịch mã mang vị trí gắn ribosom hiệuquả của protein vỏ phagơ T7 để biểu hiện gen quan tâm của tế bào nhân thật

ở thực vật, vectơ biểu hiện đợc thiết kế phù hợp với phơng pháp chuyển gen.

Trên cơ sở Ti-plasmit nhân tạo và phơng pháp chuyển gen nhờ A tumefaciens, rất

nhiều vectơ biểu hiện thực vật đã đợc thiết kế và đa vào ứng dụng Bevan đã tạo ra

vectơ hai nguồn mang vùng T-ADN cải biến với đoạn biên phải, trái, gen nptII và

vùng MCS từ M13mp19 giúp gắn gen quan tâm dễ dàng [39] Velten & Schell đãthiết kế hàng loạt vectơ có thể hoạt động trong nhiều đối tợng cây trồng với đặc tínhvừa mang gen chỉ thị chọn lọc, vừa mang đoạn khởi động điều khiển biểu hiện gen

quan tâm [191] An đã thiết kế vectơ biểu hiện pGA492 mang gen cat khuyết đoạn

khởi động nhằm nghiên cứu chức năng của các yếu tố điều khiển trong tế bào thựcvật [30] Cho tới nay, rất nhiều Ti-plasmit thế hệ mới đợc thiết kế và sử dụng với các

u điểm nh dễ tạo dòng gen quan tâm, dễ chuyển từ tế bào E coli sang A.tumefaciens và sang các mô cây bị tổn thơng

1.2.2 Các thành phần chính của vectơ

Các vectơ sử dụng trong công nghệ gen thực vật thờng là các plasmit đơn giảnvới một số đặc tính nh: (1) Có khả năng tự sao chép độc lập và tích cực trong tế bàochủ; (2) Có kích thớc nhỏ, dễ nhận gen quan tâm, dễ xâm nhập và dễ đợc sao chép;(3) Mang chỉ thị chọn lọc giúp phát hiện dễ dàng tế bào chứa plasmit; (4) Tồn tại bềnvững trong tế bào chủ; Các đặc tính này là cơ sở quyết định các thành phần chính củaplasmit với: (1) Gen quan tâm đợc gắn thêm đoạn khởi động và đoạn kết thúc gen; (2)Gen chỉ thị chọn lọc; (3) Các thành phần khác nh vùng khởi đầu sao chép và vùngMCS

1.2.2.1 Đoạn khởi động gen

Các gen kháng côn trùng có thể biểu hiện đợc thành protein cần phải có mặtcác tín hiệu điều khiển thích hợp ở những vị trí nhất định Những tín hiệu tham giatích cực vào quá trình điều khiển biểu hiện gen bao gồm đoạn khởi động gen vàđoạn kết thúc gen Ngoài ra, những yếu tố điều khiển phía trên nằm trớc gen cấutrúc cũng tham gia vào quá trình kiểm soát biểu hiện gen về số lợng, thời gian vàkhông gian Hơn nữa, các trình tự trên gen cấu trúc cần thiết cho quá trình xử lýARN cũng có vai trò quan trọng [130], [189], [194]

Đoạn khởi động bao gồm trình tự nucleotit phía trên đầu 5’ của gen cấu trúc.Nó đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhậnbiết cho enzym ARN polymeraza, cho các yếu tố hoạt hoá và khởi động [ 25] Đoạn

khởi động chứa những trình tự ADN đặc biệt gọi là các yếu tố cis ở các đoạn khởiđộng gen thực vật, các yếu tố cis có thể chia làm hai loại: (1) Các yếu tố cis chuẩn

quyết định sự khởi đầu phiên mã của bất kỳ gen nào, bao gồm hộp CAAT, cung cấpvị trí gắn cho ARN polymeraza và hộp TATA giúp cho quá trình gắn ARNpolymeraza chính xác vào vị trí khởi đầu phiên mã Các hộp TATA và CAAT rất

bảo thủ và nằm gần gen cấu trúc; (2) Các yếu tố cis khác có liên quan đến sự điều

khiển biểu hiện gen mang tính đặc hiệu [27], [167] Nh vậy, các đoạn khởi động cóthể đợc chia làm hai loại chính: đoạn khởi động không đặc hiệu hay còn gọi là đoạnkhởi động cơ định (constitutive promoter) và đoạn khởi động đặc hiệu với các yếu tố

cis chuyên biệt.

Đoạn khởi động có vai trò chính trong quá trình biểu hiện gen Gen thiếuđoạn khởi động giống nh ô tô không có động cơ [167] Gần đây, Laporte & đtg đãnghiên cứu và chứng tỏ ảnh hởng quan trọng của đoạn khởi động khi biểu hiện gen

mã hoá sucroza phosphat synthaza (sucrose phosphate synthase) ở cà chua Sản lợngcà chua tăng tới 80% khi sử dụng đoạn khởi động 35S tách từ virut khảm súp lơ(Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter - CaMV35S-P) để điều khiển biểu hiệngen này [129] Trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật, CaMV35S-P đợc sử dụngrộng rãi nhờ khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô cây hai lá mầm [29], [47],[139] Trên cơ sở CaMV35S-P, rất nhiều đoạn khởi động lai hoặc kết hợp có khảnăng tăng cờng mức độ biểu hiện gen đã đợc thiết kế nh đoạn khởi động 35S kép,đoạn khởi động lai với vùng trung tâm của CaMV19S-P và vùng tăng cờng phía trêncủa CaMV35S [122], [196] Ngoài CaMV35S-P, các đoạn khởi động chính hoạtđộng trong thực vật bao gồm Adh-P, Ubi-P, đoạn khởi động của gen tổng hợpnopalin (nopaline synthase promoter - NOS-P) [62], [143], [176] Đối với lúa,đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza (Rice sucrose synthase promoter -

Rsuc-P) cũng đợc quan tâm nghiên cứu và sử dụng [163], [206]

1.2.2.2Đoạn kết thúc gen

Các đoạn kết thúc này thờng chứa đuôi polyA nh AATTAA, hoặc AACCAAgiúp bảo vệ các phân tử ARN thông tin đợc bền vững hơn và tránh khỏi sự phân huỷ.Hai đoạn kết thúc đợc sử dụng nhiều trong công nghệ gen thực vật là đoạn kết thúccủa CaMV35S (có mặt trong 7 sản phẩm chuyển gen hiện nay) và đoạn kết NOS (cómặt trong ít nhất 16-28 sản phẩm) [98].

1.2.2.3Gen chỉ thị

Việc thiết kế các gen chỉ thị có thể hoạt động đợc trong tế bào thực vật đãnâng cao hiệu quả của kỹ thuật tạo cây trồng chuyển gen Nhờ các quá trình chọnlọc ở tế bào vi khuẩn hoặc sàng lọc ở các mô tái sinh, các thể biến nạp đợc nhận biếtvà chọn lọc dễ dàng [195] Các chỉ thị di truyền sử dụng trong biến nạp gen thực vậtthờng có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc thực vật với hai loại chính:

● Chỉ thị chọn lọc (selectable markers) kháng lại một áp lực chọn lọc nhất định,

cho phép chọn lọc các tế bào biến nạp nhờ khả năng sinh trởng đợc trên môi trờngchứa chất kháng sinh/ diệt cỏ Ngoài ra, chúng là cơ sở để theo dõi sự di truyền quacác thế hệ của gen ngoại lai trong quần thể thực vật đang phân ly [202] Một trongnhững chỉ thị chọn lọc đợc sử dụng rộng rãi là kết cấu gen mang đoạn khởi động

NOS điều khiển biểu hiện gen nptII Ngoài gen nptII, các gen kháng kháng sinhkhác nh β-lactamaza (β-lactamase - bla), nptIII cũng có mặt trong genom của một

số cây trồng biến đổi di truyền Trong một số trờng hợp, các gen này không đợcthiết kế nh những chỉ thị chọn lọc thực vật mà vẫn chịu sự điều khiển của đoạn khởiđộng vi khuẩn ban đầu [82], [83].

● Chỉ thị sàng lọc (screenable markers) mã hoá cho các sản phẩm của gen với hoạt

tính enzym rất dễ phân tích Chỉ thị sàng lọc không chỉ giúp nhận biết các thể biến nạpmà còn dự đoán đợc mức độ biểu hiện của gen quan tâm trong mô thực vật đợc chuyểngen Các chỉ thị nh β-glucuronidaza (β-glucuronidase - GUS), β-galactosidaza cho phépsàng lọc hoạt tính của enzym dễ dàng trên cơ sở kỹ thuật xét nghiệm huỳnh quang,nhuộm hoá tế bào Chúng đợc ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu đặc tính của tế bàocũng nh sự biểu hiện của các gen điều chỉnh [119], [175], [202]

Thông thờng, các gen chỉ thị đợc gắn với những đoạn khởi động tách từ mầmbệnh thực vật hoặc virut gây bệnh thực vật do các nhà thiết kế cho rằng các đoạnkhởi động này sẽ hoạt động tốt trong thực vật Tuy nhiên, ngày càng có nhiều bằngchứng cho thấy mức độ biểu hiện của gen đợc điều khiển trực tiếp bởi các đoạn khởiđộng này có thể đợc điều chỉnh tăng đến một mức độ nào đó nhờ một số yếu tố pháttriển hoạt động trong các cây nguyên vẹn không bị bệnh.

Vấn đề có an toàn hay không khi sử dụng gen chỉ thị trong chọn lọc các thểbiến nạp còn gây nhiều tranh cãi Những điểm chính bao gồm vai trò quan trọng củakanamycin, neomycin trong chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn ở ngời và sự phát triểnrộng khắp của quần thể vi khuẩn kháng chất kháng sinh Tuy nhiên, sự an toàn của

các gen kháng kháng sinh nh nptII dới sự điều khiển của các đoạn khởi động đặc hiệu

thực vật của Calgene đã đợc nghiên cứu chứng minh và đợc Cơ quan Quản lý Thựcphẩm và Dợc phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration - FDA) chấp thuận [82],[83] Cũng cần nhấn mạnh rằng, sở dĩ các gen chọn lọc có mặt trong các cây trồng

chuyển gen là do: (i) Gen quan tâm đầu tiên đợc thiết kế trong vectơ vi khuẩn (nh E.coli) có chứa gen kháng kháng sinh, sau đó nhờ các phơng pháp biến nạp, vectơ hoàn

chỉnh đợc sử dụng để đa gen quan tâm vào cây trồng; (ii) Gen kháng kháng sinh chọn

lọc vi khuẩn nằm trong vùng T-ADN sẽ đợc chuyển đồng thời vào cây nhờ A.tumefaciens Các gen này rõ ràng là không đợc sử dụng trực tiếp để chọn lọc cây

trồng chuyển gen nên không cần thiết phải có mặt trong sản phẩm cuối cùng, nhất làkhi các cây trồng đợc sử dụng làm thực phẩm [82] Ngoài ra, trong khi các thể biếnnạp thu đợc nhờ khả năng sống sót và sinh trởng trên môi trờng có chất chọn lọc nhkháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ, các tế bào không nhận đợc gen chuyển thì bị ảnh hởngbởi tác động của các chất ức chế sinh trởng này Nhằm tránh sử dụng các gen khángkháng sinh chọn lọc trong vi khuẩn, ngời ta đã sử dụng các gen chỉ thị chọn lọc thay

thế nh hệ thống Cre/ lox cho phép loại bỏ các chỉ thị chọn lọc sau biến nạp vào tế bào

thực vật [60], [132] Gần đây, Công ty Novartis (hiện nay là Syngenta) công bố khôngsử dụng các gen kháng kháng sinh để chọn lọc Ngoài ra, một hớng chiến lợc khác

cũng đang đợc sử dụng trong phơng pháp chuyển gen nhờ A tumefaciens, đó là hệ

thống biến nạp đồng thời gen quan tâm và gen chọn lọc, sau đó tiến hành tách riêng[82]

1.2.3 Vectơ mang gen kháng côn trùng

Các vectơ này đợc thiết kế để biến nạp vào cây trồng các gen kháng côntrùng có giá trị phân lập từ động vật, thực vật, vi sinh vật hoặc tổng hợp nhân tạo

1.2.3.1Nguồn gen kháng côn trùng

a) Gen cry m hoá protein độc tố của ã hoá protein độc tố của Bacillus thuringiensis

Trong nguồn gen kháng côn trùng, gen cry mã hoá protein tinh thể độc cóhoạt tính diệt côn trùng (Insecticidal Crystal Proteins - ICPs) của Bt đợc sử dụng phổ

biến nhất để chuyển và biểu hiện ở hàng loạt cây trồng quan trọng

● Sơ lợc về Bt: Bt là vi khuẩn hiếu khí, hình que, gram dơng, có khả năng hình

thành bào tử trong điều kiện môi trờng bất lợi và sản sinh protein tinh thể độc ởdạng ngoại bào (α, β, γ exotoxin) và nội bào (δ-endotoxin) Trong đó, δ-endotoxin là

một họ protein tinh thể độc chính do hơn 140 gen cry mã hoá đợc sản sinh trong quá

trình hình thành bào tử Chúng gây độc hệ tiêu hoá của côn trùng mẫn cảm và thờng

đợc sử dụng để khống chế côn trùng Bộ Cánh vảy (Lepidoptera), Hai cánh(Diptera), Cánh cứng (Coleoptera) và tuyến trùng (Nematoda) [23], [65] Chế phẩmsinh học Bt diệt côn trùng đợc sử dụng rộng rãi nhất, chiếm tới 90% thị trờng thuốc

trừ sâu sinh học và 2% thị trờng thuốc trừ sâu toàn cầu [4], [5], [121]

Mặc dù đợc coi là thuốc trừ sâu vi sinh hiệu quả, một số hạn chế nhất địnhvề phơng diện sinh học nh thời gian ảnh hởng ngắn, không tiếp xúc đợc với côn

trùng ẩn sâu dới lá, đất đã phần nào giảm mức độ sử dụng chế phẩm Bt [126].Những điểm bất lợi này hoàn toàn bị loại trừ khi chuyển và biểu hiện gen cry vào

cây trồng [169]

● Cấu trúc phân tử và cơ chế hoạt động của protein tinh thể độc:

Protein tinh thể độc thờng tồn tại ở dạng tiền độc tố với cấu trúc gồm hai phần:phần đầu N mang độc tính và phần đầu C Cơ chế tác dụng của tiền độc tố lêncôn trùng đích đã đợc nghiên cứu khá sâu Đầu tiên tinh thể xâm nhập vào cơ thểcôn trùng theo thức ăn qua đờng miệng Sau đó dới tác động của môi trờng có độpH > 10 ở ruột giữa của sâu cùng với sự hoạt động của proteaza ruột sâu, t ơng tựtrypsin, các tiền độc tố đã đợc hoạt hoá Tiền độc tố CryI và CryIV với kích th ớc130-140 kDa khi đợc hoạt hoá đã hình thành độc tố, kích thớc 65-75 kDa có hoạttính và bền vững Trong khi tiền độc tố CryII và III (70-75 kDa) sau quá trình

biến đổi đã tạo ra độc tố kích thớc 60-65 kDa Sau khi đợc hoạt hoá, protein tinhthể độc đã liên kết ái lực mạnh với các chất nhận glycoprotein tại những vị trí đặchiệu nằm trên các vi nhung mao của tế bào biểu mô ruột giữa của ấu trùng Chínhmối liên kết của các độc tố với các chất nhận ở vi nhung mao này đã quyết địnhtính đặc hiệu của độc tố ở những côn trùng không mẫn cảm, mối liên kết này rấtlỏng lẻo Hiện nay, ngời ta đã xác định đợc ba nhóm vị trí gắn Một số vị trí cóthể liên kết với một loại độc tố, một số vị trí khác có thể liên kết với hai haynhiều loại Nh vậy, một độc tố đặc thù có thể liên kết với nhiều vị trí nhận trongruột của côn trùng Sau khi gắn kết, protein tinh thể độc tố đính trên bề mặt tếbào biểu mô ruột giữa, gây tổn thơng và phá huỷ tế bào, tiêu diệt côn trùng mẫncảm [123]

Protein tinh thể độc có cấu trúc đặc thù Các nghiên cứu về cấu trúc củachúng thờng bắt đầu bằng những điều tra về chức năng của những vùng cấu trúcnày Đặc điểm điển hình trong cấu trúc của protein tinh thể độc là có các vùng bảothủ nằm xen kẽ những vùng biến đổi Các vùng bảo thủ này đóng vai trò quan trọngvề mặt cấu trúc và chức năng Cấu trúc của δ-endotoxin vẫn cha đợc làm sáng tỏ chođến khi cấu trúc tinh thể của CryIIIA và CryIA(a) đợc công bố [89], [134] Kết quảnghiên cứu cấu trúc cho thấy protein tinh thể độc nhóm CryI và CryIII có 3 vùngkhác biệt: vùng đầu N bảo thủ cao (chứa 28-282 aa), vùng siêu biến ở giữa (283-461aa) và vùng đầu C bảo thủ không hoàn toàn (462-610 aa) Về chức năng, vùng 1 củaCryIIIB2 và CryIA(c) liên quan đến hoạt động của kênh ion, bớc khởi đầu của quátrình hình thành protein [198] Vùng 2, 3 liên quan đến việc gắn thụ thể và quyếtđịnh tính đặc hiệu côn trùng [161] Tuy nhiên, ở một số độc tố, vùng 3 cũng thamgia vào hoạt động của kênh ion [200]

● Gen m hoá protein tinh thể độc:ã hoá protein độc tố của Gen cry tự nhiên thờng nằm trên

plasmit cỡ lớn kích thớc khoảng 3 kb, trong đó chỉ có đoạn khoảng 2 kb mã hoá

protein tinh thể độc Các plasmit này có mặt trong hầu hết các chủng Bt với số lợngdao động từ 2 đến 12 bản sao Ngoài ra, các gen cry cũng có thể nằm trên nhiễm sắcthể ở một số chủng Bt nh chủng kurstaki HD-1, entomocidus, aizawai 7.29 Mộtchủng vi khuẩn có thể mang đồng thời nhiều gen cry nh chủng aizawai và kurstakiHD-1 tự nhiên chứa 5 gen cry nằm trên các vị trí tách biệt nhau; Chủng Bt var.israelensis có 4 gen cry mã hoá protein diệt đặc hiệu côn trùng Bộ Hai cánh và một

gen mã hoá Cytolysin nằm trên cùng một plasmit [162]

● Phân loại gen cry và protein tinh thể độc của Bt: Dựa trên khả năng

diệt côn trùng đặc hiệu và những trình tự tơng đồng, gen cry và protein tinh thể độc

Ẽùc chia thẾnh 4 nhọm chÝnh: (1) Gen cryI m· hoÌ cho protein CryI 130-140 kDaẼờc Ẽội vợi cẬn trủng Bờ CÌnh vảy; (2) Gen cryII m· hoÌ cho protein CryII kÝch th-ợc 66 kDa Ẽờc Ẽội vợi cẬn trủng Bờ CÌnh vảy vẾ Hai cÌnh; (3) Gen cryIII m· hoÌprotein CryIII 73 kDa Ẽờc Ẽội vợi cẬn trủng Bờ CÌnh cựng; (4) Gen cryIV Ẽùc phẪnlập tử chũng israelensis m· hoÌ cho protein CryIV kÝch thợc 135, 128, 74 vẾ 72 kDa

Ẽờc Ẽội vợi cẬn trủng Bờ Hai cÌnh [107] Dỳa tràn Ẽờ tÈng Ẽổng cũa cÌc trỨnh tỳ aa,protein tinh thể Ẽờc Ẽùc chia tiếp thẾnh cÌc nhọm phừ Tuy nhiàn, việc phẪn loỈi nẾychì lẾ tÈng Ẽội CryI chì nhọm protein tinh thể Ẽờc cọ hoỈt tÝnh diệt cẬn trủng BờCÌnh vảy, nhng CryIAb lỈi Ẽùc cẬng bộ cọ khả nẨng khÌng lỈi ấu trủng muối CryIIcọ hoỈt tÝnh kÐp (diệt Ẽổng thởi cẬn trủng Bờ CÌnh vảy vẾ Hai cÌnh) trong khiCryIIB chì diệt cẬn trủng Bờ CÌnh vảy [156]

b) CÌc gen m hoÌ protein khÌc cọ hoỈt tÝnh diệt cẬn trủng· hoÌ protein Ẽờc tộ cũa

Mờt sộ loẾi thỳc vật cọ khả nẨng tỳ vệ trợc sỳ tấn cẬng cũa cẬn trủng nhở tỈo

ra protein lẾ cÌc chất ực chế tÌc Ẽờng vẾo hệ tiàu hoÌ cũa cẬn trủng Khai thÌc tÝnhẼặc hiệu cũa cÌc protein nẾy Ẽ· mỡ ra khả nẨng rất hấp dẫn trong chồn tỈo giộngcẪy trổng Hiện nay, rất nhiều protein thỳc vật cọ Ẽờc tÝnh ảnh hỡng Ẽến trao Ẽỗichất cũa cẬn trủng Ẽang lẾ Ẽội tùng quan tẪm cũa cÌc nhẾ cẬng nghệ gen thỳc vật(bảng 1.1) [103], [178].

Bảng 1.1 Protein cọ hoỈt tÝnh diệt cẬn trủng vẾ phỗ hoỈt Ẽờng cũa chụng

Protein Ẽờc tộ

CẬn trủng

Tuyến trủng

NấmườngvậtBờ CÌnh

Protein bất hoỈt hoÌ

Protein tinh thể Ẽờc: CryI

-● Các chất ức chế proteaza (Protease Inhibitor): là các proteaza ngoại bàodạng tự do hoặc gắn màng có khả năng ức chế quá trình tiêu hoá protein của côntrùng nhờ ngăn cản sự hoạt động của các proteaza - những enzym phân huỷ protein.Hầu hết chất ức chế proteaza của thực vật không gây ảnh hởng đến proteaza của bảnthân chúng mà chỉ ức chế hoạt động proteaza của vi khuẩn và động vật Rất có thểđây là cơ chế tự nhiên của thực vật nhằm bảo vệ mô tế bào khỏi bị tổn thơng do côntrùng gây hại và mầm bệnh tấn công Các chất ức chế đối với proteaza dạng serin vàcystein có rất nhiều trong hạt và các mô dự trữ của thực vật Chúng có khả năng diệt

nhiều loài sâu hại nh sâu ăn rễ ngô (Diabrotica spp.), tuyến trùng và một số loài sâukhông chịu tác động của độc tố Bt [73], [165] Một trong những chất ức chế proteaza

dạng serin có giá trị đặc biệt là chất ức chế trypsin của cây đậu đũa (TrypsinInhibitor from Cowpea) Chúng không độc đối với động vật và hoàn toàn không gâyhại côn trùng có ích trong khi rất nhiều chất ức chế dạng serin gây độc ong mật

(Apis mellifera) [138] Các thử nghiệm sinh học cho thấy protein này đã kìm hãmsinh trởng và làm tăng tỷ lệ tử vong của sâu róm đục chồi thuốc lá (Heliothisvirescens) cũng nh sâu xanh hại bắp ngô (Heliothis zea) [106] Các dòng lúa chuyển

gen mã hoá chất ức chế proteaza của cây đậu đũa và cây khoai tây có khả năngkháng côn trùng Bộ Cánh vảy rõ rệt [72], [203], dâu tây biểu hiện chất ức chếproteaza thể hiện hoạt tính kháng mọt hại nho [88] Tuy nhiên, không phải tất cảchất ức chế proteaza đều có hoạt tính diệt côn trùng [84], [85] Ngoài ra, khá nhiềubằng chứng cho thấy côn trùng có khả năng thích ứng với việc xuất hiện chất ức chếproteaza trong đờng tiêu hoá Côn trùng Bộ Cánh vảy và Cánh cứng có thể tăng cờngbiểu hiện các proteaza hoặc sản sinh enzym mới không mẫn cảm với chất ức chếproteaza và giảm những ảnh hởng có hại của chất ức chế proteaza trong hệ tiêu hoácủa chúng Nhằm tránh những khả năng thích ứng này, các loại chất ức chế proteazacó thể đợc biểu hiện đồng thời hoặc đợc cải tiến cho phù hợp với proteaza của côntrùng đích [85], [146]

● Các chất ức chế  - amylaza (α - Amylase Inhibitor - -AI): nhằm vào quá

trình chuyển hoá hydrat cacbon của sâu hại Chúng có mặt trong hạt cây đậu chi

Phaseolus Đặc biệt, trong cây đậu cô ve (P vulgaris) có một họ protein bảo vệ thực

vật bao gồm chất ức chế -amylaza, arcelin và phytohemagglutinin đều đợc mã hoábởi một locut đơn trong genom và cùng bảo vệ hạt trớc sự tấn công của côn trùnggây hại nhng với phơng thức hoạt động hoàn toàn khác nhau [77] Trong đó, chất ứcchế -amylaza thờng có tác dụng ức chế -amylaza của côn trùng, bọ cánh cứng màkhông ức chế -amylaza của thực vật và vi sinh vật [148]

● Lectin: là nhóm protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, đợc tìm thấy chủyếu ở thực vật Chúng là nhóm protein liên kết đờng có chức năng bảo vệ cây trồngchống lại một số tác nhân nhất định, đặc biệt là côn trùng Bộ Cánh giống Cơ chếthực vật tiết chất độc kháng côn trùng (và động vật bậc cao) vẫn cha rõ ràng Tuynhiên, hoạt tính của lectin phụ thuộc vào khả năng gắn với chuỗi bên hydrat cacbontrên glycoprotein, đặc biệt là các tế bào nằm trong thành ruột Sự gắn kết này có thểgây ra những ảnh hởng đến mức độ thấm, sự sinh trởng, phát triển của thành ruột vàsau đó ảnh hởng đến toàn bộ các cơ quan [85]

● Protein bất hoạt hoá ribosom (Ribosome Inactivating Protein): sản sinh bởi

nhiều loài thực vật bậc cao Dựa trên cấu trúc phân tử, protein này đợc phân loạithành hai nhóm: nhóm I với độc tính tơng đối thấp (gồm một chuỗi polypeptit A vớiphân tử lợng khoảng 23-32 kDa) và nhóm II rất độc (gồm chuỗi polypeptit A liênkết với chuỗi polypeptit B qua các cầu nối disulphit) [113] Ngoài hoạt tính khángnấm, trong một số trờng hợp protein bất hoạt hoá ribosom có hoạt tính kháng côntrùng, nh Ricin và saporin-S6 gây độc côn trùng Bộ Cánh cứng [35]

● Enzym: Rất nhiều enzym đã đợc quan tâm khai thác nhằm nâng cao tính kháng

sâu bệnh của cây trồng Cholesterol oxidaza là một họ protein diệt côn trùng mới có

nguồn gốc từ các chủng xạ khuẩn Streptomyces với hoạt tính độc rất cao Đây là

nguồn nguyên liệu lý tởng để chuyển vào bông [160]

● Protein độc tố có nguồn gốc vi sinh vật: Ngoài protein tinh thể độc của

Bt, một số vi sinh vật có khả năng tiết các protein độc tố diệt sâu hại Bacilluscereus sản sinh protein Vip1 và Vip2 gây độc sâu ăn rễ ngô Một số chủng Bt sảnsinh protein Vip3A gây độc sâu róm Agrotis và Spodoptera [75] Ngoài ra, proteinCyt (cytolytic) đợc tìm thấy ở các chủng Bt đặc hiệu côn trùng Bộ Hai cánh [53],

[86] Tuy nhiên, cho đến nay cha có những công bố về hoạt tính kháng sâu của cáccây chuyển gen mã hoá các độc tố này.

● Protein độc tố có nguồn gốc từ động vật ăn thịt: Một số loài côn trùng

ăn thịt nh nhện và bọ cạp sản sinh chuỗi peptit có hoạt tính gây độc thần kinh cựcmạnh đối với côn trùng Nguồn gen liên quan đến các peptit này đã đợc chuyển vàocây trồng Tuy nhiên, nghiên cứu của Barton & Miller cho thấy độc tố của bọ cạptrong cây chuyển gen đồng thời gây độc nhiều loài côn trùng có ích [36].

● Chất trao đổi thứ cấp: Một số chất trao đổi thứ cấp nh alkaloit, cyanogenic

glycosit, glucosinolat, saponin cũng có hoạt tính kháng sâu Quá trình nghiên cứuchuyển các gen liên quan vào thực vật mới chỉ bắt đầu [91]

1.2.3.2Thiết kế vectơ mang gen kháng côn trùng thế hệ mới

Vectơ thế hệ mới có thể tăng cờng khả năng biểu hiện của gen quan tâm,nâng cao chất lợng protein ngoại lai trong cây trồng Thông thờng, các cải biến tậptrung vào trình tự mang mã của gen quan tâm, đoạn khởi động, trình tự tăng cờng,intron

a) Sử dụng đoạn khởi động/ gen đặc hiệu

Tìm kiếm và phân lập gen cũng nh đoạn khởi động đặc hiệu các loại mô và tếbào (nh đặc hiệu hạt phấn, bó mạch, vỏ, lá) cũng nh đặc hiệu về thời gian biểuhiện là một trong những hớng chính trong tạo giống cây trồng biến đổi di truyền.Đối với gen kháng côn trùng, nhằm tăng khả năng biểu hiện của gen cũng nh giảmảnh hởng của protein độc tố đến côn trùng có ích, rất nhiều nghiên cứu tập trung tìmkiếm nguồn gen và đoạn khởi động đặc hiệu để thiết kế vectơ [174] Nhờ các đoạnkhởi động này, độc tố đợc biểu hiện ở những loại mô nhất định, ở những giai đoạnphát triển nhất định của cây, dới sự tác động của từng điều kiện môi trờng hoặc chỉbiểu hiện ở nơi bị tổn thơng khi côn trùng tấn công Chẳng hạn, ngời ta thờng sửdụng đoạn khởi động Ubi hoặc Actin để điều khiển biểu hiện gen trong cây một lámầm [62], đoạn khởi động của gen mã hoá sucroza synthaza để điều khiển gen biểu

hiện đặc hiệu bó mạch [204] Để diệt bọ cánh cứng Colorado (Leptinotarsadecemlineata) hại khoai tây, đoạn khởi động đặc hiệu lá đã đợc sử dụng thay đoạn

khởi động đặc hiệu củ [120] Hiện nay, ngoài việc phân lập gen quan tâm và tìmkiếm đoạn khởi động đặc hiệu, các nghiên cứu điều khiển hoạt động gen thông quacác đoạn khởi động này cũng là mục tiêu nghiên cứu của nhiều phòng thí nghiệmtrên thế giới ở nớc ta, những vấn đề này cũng đang bắt đầu đợc tiếp cận nghiên cứunhằm chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình thiết kế vectơ để chuyển vào cây trồng [2],[9].

b) Cải biến vùng mang m của gen kháng côn trùng nhằm tăng hiệuã hoá protein độc tố của

quả biểu hiện trong thực vật

Hầu hết gen kháng côn trùng đợc sử dụng trong công nghệ gen thực vật cónguồn gốc từ vi khuẩn Thời kỳ đầu chúng thờng đợc đa vào cây trồng ở dạngnguyên vẹn [181] Mặc dù cây trồng biến đổi di truyền có khả năng kháng côn trùngđặc hiệu, nhng ngay sau đó ngời ta nhận thấy mức độ biểu hiện các gen tự nhiên củavi khuẩn trong thực vật thờng rất thấp, không đủ để bảo vệ cây trồng chống lại mộtsố loài sâu hại chính [25], [64] Một trong những nguyên nhân là gen ở vi sinh vật

nói chung và ở vi khuẩn Bt nói riêng có tỉ lệ Adenin/ Timin (Adenyl/ Thymin) khá

cao, trong khi mã giàu Adenin/ Timin rất hiếm gặp ở thực vật Do vậy, thực vật

không có nhiều ARN vận chuyển phù hợp với mã di truyền của gen vi khuẩn Ngoài

ra, các gen cry tự nhiên còn mang các đoạn tơng tự đuôi polyA trong vùng mang mã,

dấu hiệu dừng đối với ARN polymeraza II cũng nh các đặc tính khác nên không thíchhợp để biểu hiện trong thực vật Khi thực vật dịch mã một gen ngoại lai giàu Adenin/Timin thờng xảy ra hiện tợng ngừng trong bộ máy ribosom làm cho sinh tổng hợpprotein bị kết thúc sớm do vậy khả năng dịch mã bị giảm [1], [64], [75], [174].

Để tăng cờng sự biểu hiện của gen kháng côn trùng, ngời ta đã sử dụng đoạn

khởi động mạnh để điều khiển gen, cắt bớt gen và biến đổi mã di truyền của chúngcho phù hợp với mã thực vật Nhiều nhóm nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp nhântạo một phần hoặc toàn phần gen kháng côn trùng và sử dụng các mã di truyền phùhợp với từng loài cây trồng nhất định [25], [28], [64], [126], [158], [174], [185].Ngoài ra, các trình tự nh đuôi polyA, trình tự ATTTA, vùng giàu Adenin/ Timinnhiều khi cũng đợc loại bỏ để tăng cờng biểu hiện gen Với những cải biến di truyềnnày, mức độ biểu hiện của hàng loạt gen kháng côn trùng trong cây chuyển gen đãtăng lên rất nhiều lần so với gen tự nhiên Hoạt tính độc của protein tinh thể độc cảibiến có thể cao gấp 100 lần so với hoạt tính của protein tự nhiên [52], [166], [201].Điển hình của hớng nghiên cứu cải biến gen tự nhiên, Perlak & đtg đã tiến hành thay

thế các trình tự Adenin/ Timin của gen cryIA(b) và cryIA(c) bằng các trình tự

Guanin/ Xytonin (Guanin/ Cytonin) mà vẫn giữ nguyên trình tự aa của protein [157],[158] Các gen cải biến này, dới sự điều khiển của đoạn khởi động mạnh, đã đợc

chuyển vào giống bông Coker 312 với mức độ biểu hiện protein tăng 100 lần [157].Tơng tự nh vậy, gen mã hoá CryIIIA phân lập từ chủng Bt tenebrionis đợc chuyển

vào cây khoai tây tạo khả năng kháng bọ cánh cứng Colorado giảm thiệt hại đáng kể

do bệnh này gây ra Biểu hiện của cryIIIA đợc tăng cờng nhờ trình tự Guanin/

Xytonin từ 36% đợc nâng lên 44% [25] Voisey & đtg cũng đã thành công trong

việc biến đổi gen cryIB tăng hàm lợng protein CryIB [193] Những thành công này

chủ yếu thu đợc trên đối tợng cây hai lá mầm [180] Đối với cây một lá mầm, Koziel

& đtg đã tổng hợp nhân tạo đoạn gen cryIA(b) mã hoá trình tự aa từ 1-648 của gencryIA(b) nguyên vẹn chủng Bt kurstaki HD-1 Gen này đợc thiết kế lại dựa trên cơ

sở một số mã di truyền của vi khuẩn đợc thay bằng mã di truyền của ngô với trình tựGuanin/ Xytonin tăng từ 37 lên 65% Sau đó chúng đợc chuyển vào ngô và đợc cácđoạn khởi động đặc hiệu khác nhau điều khiển biểu hiện sản sinh protein CryIA(b) ởnhững mô đặc hiệu là nguồn thức ăn của sâu hại Các thử nghiệm đồng ruộng chothấy ngô chuyển gen có khả năng tự vệ đối với sự tấn công của sâu đục thân ngô

Châu Âu (Ostrinia nubilalis) ngay trong trờng hợp thử nghiệm 2000 ấu trùng/ cây[125] Cheng & đtg đã thiết kế vectơ mang gen cry cải biến hoàn toàn (cryIA(c) vàcryIA(b)), gen hpt và gen gus để chọn lọc các thể biến nạp Các gen này đợc điều

khiển bởi CaMV35S-P, Ubi-P và có hiệu quả biểu hiện khá cao [52] Nayak & đtg

cũng đã tổng hợp gen cryIA(c), thiết kế kết cấu gen Ubi1P mang đoạn intron 1 cryIA(c) - NOST để chuyển vào phôi giống lúa Indica IR64 và thu đợc 6 dòng lúacó khả năng kháng sâu đục thân Scirpophaga incertulas nhờ chứa gen cryIA(c) tồn

-tại bền vững ở thế hệ T2 [151].

c) Gắn intron tăng cờng vào gen quan tâm

Ngoài trình tự mã hoá protein, đoạn khởi động và đoạn kết thúc, các introncũng là một trong những yếu tố có khả năng làm tăng mức độ biểu hiện gen [ 42],[50], [159], [168] Nghiên cứu của Last & Rose cho thấy cây trồng đợc chuyển kết

cấu gen gus mang intron có phổ nhuộm huỳnh quang rộng và đậm hơn so với cấu

trúc thiếu các thành phần này [131] Tuy nhiên, các đoạn intron chỉ có mặt trong rấtít gen chỉ thị nhằm nghiên cứu chức năng biểu hiện của gen và trợ giúp quá trìnhbiểu hiện một số gen nhất định Nghiên cứu của Callis & đtg trên các vectơ pACI1I8,9A và pAI1 CI8,9A (trong đó A chỉ Adh1, IX chỉ các intron số X và C chỉ gen

cat), cho thấy vị trí của đoạn intron 1 của gen mã hoá Adh1 của ngô trong gen cat

có ảnh hởng quan trọng đến mức độ biểu hiện của gen Nếu intron 1 nằm ở phía trớc

gen cat, mức độ biểu hiện tăng 110 lần so với trờng hợp thiếu intron 1 (ở vectơpACI8,9A), gấp 21 lần so với trờng hợp đoạn intron 1 nằm sau gen cat (ở vectơ

pACI1 I8,9 A) [46] ở rất nhiều gen thực vật, intron đã có ảnh hởng tích cực đếnquá trình biểu hiện gen nhờ khả năng làm tăng quá trình tích luỹ ARN thông tin[46], [70] Tuy nhiên, không phải tất cả intron đều có khả năng này Một số genthực vật không thay đổi mức độ biểu hiện khi có hoặc không có mặt intron Trongmột số trờng hợp, cấu trúc và chiều dài của đoạn intron không ảnh hởng đến khảnăng biểu hiện gen [58].

Mặc dù rất nhiều ví dụ cho thấy intron tăng cờng quá trình biểu hiện gen, ời ta vẫn cha rõ cơ chế của quá trình tăng cờng này Một số giả thuyết đã đợc đa ra:(i) Có thể intron chứa yếu tố tăng cờng tham gia vào quá trình dịch mã; (ii) Hoặcquá trình cắt ARN có thể ảnh hởng đến sự bền vững của ARN thông tin Một sốintron làm tăng quá trình tích luỹ ARN thông tin nhờ cơ chế liên quan đến sự phâncắt intron Trong những trờng hợp này, intron nằm trong vùng mang mã của gentheo hớng thích hợp giúp tăng quá trình biểu hiện Nghiên cứu đột biến cho thấy,trên intron, những trình tự cần thiết cho quá trình phân cắt gen và tăng cờng biểuhiện gen định vị trên cùng một vị trí [135], [136] Các trình tự bên trong intron cóthể thay đổi mà không ảnh hởng đến khả năng tăng cờng này chỉ cần chúng đợc duytrì khả năng phân cắt hiệu quả Nhìn chung, intron không đợc sử dụng phổ biến đểbiểu hiện các gen quan tâm do: (i) khó khăn trong việc phân lập và chuyển intron từ

ng-gen này vào ng-gen kia mà không đồng thời đa vào các trình tự mã hoá cho các aakhông mong muốn; (ii) intron làm thay đổi đoạn khởi động ảnh hởng đến quá trìnhbiểu hiện gen; (iii) hơn nữa, intron có mặt trong gen không đảm bảo gen đó đợc tăngcờng biểu hiện Hiện nay, vấn đề intron nào sẽ tăng cờng tối đa mức độ biểu hiệncủa từng gen đặc biệt trong những loài mong muốn vẫn đang tiếp tục đợc nghiên cứu[81] Ngoài intron, các yếu tố tăng cờng thực vật khác cũng đóng vai trò quan trọngtrong biểu hiện gen Odell & đtg đã tiến hành đa đoạn trình tự 338 bp nằm trớc hộpTATA ở CaMV35S-P vào các đoạn khởi động yếu tăng mức độ biểu hiện của gen nhkhi đợc điều khiển bằng CaMV35S-P nguyên vẹn [153]

d) Thiết kế cấu trúc gen kép

Hoạt tính kháng côn trùng nhiều khi đã tăng lên khi cây đợc chuyển đồng thờinhiều gen với các cơ chế kháng sâu khác nhau Thử nghiệm các dòng bông không chứa,

chứa 1 hoặc 2 gen cry cho thấy, cây bông có hoạt tính độc mạnh nhất đối với sâu hạikhi đợc chuyển và biểu hiện đồng thời gen cryIA(c) và cryIIA(b) [182] Kết quả tơng

tự nhận đợc khi biểu hiện operon với 3 gen mã hoá CryIIA trong lục lạp [63]

e) Sử dụng hệ thống vectơ chọn lọc tích cực

Hệ thống này hoàn toàn không sử dụng các gen kháng kháng sinh hoặc thuốcdiệt cỏ, cho phép phát hiện và chọn lọc dễ dàng và hiệu quả các tế bào mang genquan tâm mà không gây ảnh hởng hoặc tiêu diệt các tế bào bình thờng ở đây, genđơn đã đợc sử dụng đồng thời làm gen chỉ thị và chọn lọc Nhờ vậy, việc thiết kếvectơ đơn giản hơn và cấu trúc vectơ ổn định hơn với gen quan tâm và một trình tựnucleotit khác mã hoá cho protein liên quan đến sự trao đổi chất của mannoza hoặcxyloza Hai gen này đợc đa đồng thời vào genom của tế bào Do vậy, khi tiến hànhchọn lọc các thể biến nạp, môi trờng nuôi cấy cần đợc bổ sung mannoza hoặcxyloza Cần nhấn mạnh rằng, protein liên quan đề cập ở trên có thể là enzym chịutrách nhiệm trực tiếp hoặc gián tiếp cho quá trình sản xuất hoặc tổng hợp hợp chấtđa vào môi trờng [33], [68].

1.3 Chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng1.3.1 Tình hình nghiên cứu ở nớc ngoài

1.3.1.1Thử nghiệm các cây trồng biến đổi di truyền

Năm 1984, cây trồng đầu tiên trên thế giới đã đợc chuyển gen cry Đến nay, vấn

đề cải biến giống cây trồng đã phát triển vợt bậc nhờ sử dụng kỹ thuật hiện đại này.Danh sách các cây trồng đợc biến đổi di truyền ngày một nhiều Theo thông báo tóm tắtcủa Tổ chức Dịch vụ Quốc tế về Thu thập các ứng dụng Công nghệ Sinh học Nôngnghiệp (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications -

ISAAA), trong giai đoạn từ 1986-1997 trên toàn cầu có tới 25000 các thử nghiệm đồngruộng đối với các cây trồng biến đổi di truyền Trong đó, 72% các cuộc thử nghiệm đợctiến hành ở Mỹ, tiếp đến là Canada, châu Âu, châu Mỹ La tinh và châu á Các thửnghiệm này tập trung vào 10 loại tính trạng trên đối tợng là 60 loài cây trồng nôngnghiệp [115] Trong hàng loạt các tính trạng quan trọng đợc cải biến của cây trồng, tínhtrạng kháng côn trùng đợc đặc biệt quan tâm (hình 1.5) [114]

Hình 1.5 Các nhóm tính trạng chính đợc thử nghiệm chuyển gen trên

toàn cầu giai đoạn 1986-1995

Những nguồn gen kháng côn trùng có ích đợc nhiều nhà khoa học trên thế giới

quan tâm nghiên cứu khai thác và chuyển vào thực vật Trong đó, gen cry tự nhiên

cũng nh cải biến đợc chuyển và biểu hiện trong hàng loạt cây trồng: thuốc lá, càchua (1987); ngô (1989); lúa (1990); khoai tây (1992); ngô và cải bông (1993); cảidầu và đậu tơng (1994); thông và cây dơng (1995); mía và táo (1996); lạc, đậu và cỏ

linh lăng (1997) [79], [120], [177] Ngô, bông mang gen cry là những cây chuyển

gen đầu tiên đợc trồng đại trà và thơng mại hoá ở Mỹ [127] Bảng 1.2 cho thấy các

cây trồng chuyển gen cry có hoạt tính diệt côn trùng

Bảng 1.2 Chuyển gen cry vào cây trồng [26], [45], [120]

Thuốc lá cryIA(a), cryIA(b)cryIA(b), cryIA(c) WTPM Manduca sexta M sexta LL

cryIA(c) WT Heliothis virescens, H zea,

Cây trồngGenLoạiCôn trùng đíchLoàiBộ

Bông cryIA(b), cryIA(c) S H zea, H virescens L

cryIIIA S Leptinotarsa decemlineata CCải cryIA(c) S Plutella xylostella, H zea

Trichoplusiani, S exigua L

Psedoplusia includens L

Lúa cryIA(b), cryIA(c ) S Chilo suppreessali Scirpophaga incertulas,Snaphalocrosis medinalis

* L: Lepidoptera - Bộ Cánh vảy ; C: Coleoptera- Bộ Cánh cứng; WT: Gen tự nhiên (Native gene); PM: Gen biến đổi một phần (Partly modified); S: Gen tổng hợp nhân tạo (Synthesized gene).

Ngoài gen cry, các gen mã hoá protein kháng sâu khác đã và đang đợc

chuyển vào nhiều loài cây trồng Lectin liên kết glucoza/ mannoza tách từ cây đậuHà Lan với u điểm không gây độc đối với động vật, mặc dù có hoạt tính diệt côntrùng tơng đối thấp nhng vẫn đợc chuyển vào thuốc lá tạo khả năng kháng sâu rómđục chồi Ngoài ra, gen mã hoá cholesterol oxidaza tự nhiên giàu Guanin/ Xytonin

đã đợc chuyển vào thuốc lá [75] Gen mã hoá chitinaza của M sexta cũng đợc

chuyển vào thuốc lá giúp cây kháng lại côn trùng thuộc Bộ Cánh vảy [69] Tuy

nhiên trong hàng loạt các thử nghiệm đồng ruộng nhằm biểu hiện gen cry nói riêng

và các gen kháng côn trùng nói chung đã tiến hành, một số thử nghiệm không thu

đ-ợc kết quả mong muốn ở úc, cây bông đđ-ợc chuyển gen cry không có khả năng tiêudiệt Bớm đêm (Helicoverpa armigera) Năm 1996, 2 triệu mẫu Anh (chiếm 13%tổng diện tích đất trồng bông ở Mỹ) đợc gieo hạt bông mang gen cry do công ty

Monsanto cung cấp Kết quả, số bông trồng trên diện tích khoảng 20.000 mẫu Anhở bang Texas không có khả năng diệt sâu xanh [120] Thử nghiệm đồng ruộng cáccây trồng biến đổi di truyền đòi hỏi những quá trình đánh giá rủi ro và kiểm nghiệmkỹ lỡng.

1.3.1.2Thơng mại hoá các cây trồng biến đổi di truyền

Giai đoạn 1996 - 2000, diện tích đất trồng cây trồng biến đổi di truyền thơngmại trên toàn cầu đã tăng tới 25 lần, từ 1,7 triệu hecta (ha)/ 1996 lên 44,2 triệu ha/2000 Trong đó, 85% diện tích này tập trung ở các nớc phát triển Cần nhấn mạnhrằng, diện tích đất trồng cây chuyển gen ở các nớc đang phát triển tăng 51% từ 7,1triệu ha (1999) lên 10,7 ha (2000) Trong khi, tỷ lệ này chỉ đạt 2% ở các n ớc pháttriển: 32,8 triệu ha lên 33,5 triệu ha Từ năm 2000 đến 2001, diện tích đất trồng cây

chuyển gen tăng tới 19% [117] Đặc biệt, cũng ở giai đoạn 1996 - 2000, số lợngquốc gia trồng cây chuyển gen đã tăng hơn hai lần: từ 6 quốc gia (1996) lên 9 quốcgia (1998), 12 (1999) và 13 quốc gia vào năm 2000 Những con số này phần nàokhẳng định sự quan tâm của toàn cầu đến công nghệ gen nói chung và cây trồngbiến đổi di truyền nói riêng Các cây trồng biến đổi di truyền có mặt ở cả 6 châu lục(Nam Mỹ, châu Mỹ La Tinh, châu á, châu Âu, châu Phi và châu Đại Dơng) và chủyếu bao gồm: đậu tơng, bông, cải, ngô và khoai tây Cũng theo thống kê của James,trong giai đoạn 1996 - 2000 cây trồng thơng mại chủ yếu đợc chuyển gen nhằm tạotính kháng chất diệt cỏ và kháng côn trùng [116] Các loài cây trồng có hoạt tínhdiệt côn trùng bao gồm: thuốc lá, cà chua, khoai tây, bông, ngô, óc chó, mía và lúa[100] Năm 1995, những cây trồng biến đổi di truyền đầu tiên nh ngô biểu hiện gen

cryIA(b) (Maximizer của Novartis), bông sản sinh protein độc tố CryIA(c)

(BollgardTM của Monsanto) và khoai tây biểu hiện CryIIIA (NewleafTM củaMonsanto) đợc đa vào thị trờng Mỹ Năm 1996, diện tích đất trồng cây chuyển gen

cry ở Mỹ chiếm tới 1,2 triệu ha Hầu hết các giống này cũng đợc trồng đại trà ở cácquốc gia khác nh Argentina và úc [127] Năm 2000, cây bông mang gen cry đợc

trồng trên 6,8 triệu ha ở 6 quốc gia, tơng ứng 15% diện tích đất trồng cây chuyển

gen toàn cầu Bảng 1.3 là diện tích đất trồng cây chuyển gen cry theo công nghệ của

Công ty Monsanto Thơng mại hoá cây trồng biến đổi di truyền có sức đề khángsinh vật gây hại đặc biệt là côn trùng không chỉ tăng năng suất, góp phần ổn định l-ơng thực mà còn giảm việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học, tránh ô nhiễm môi trờng

Bảng 1.3 Diện tích đất trồng cây chuyển gen cry theo công nghệ của Monsanto

+: Số liệu bông năm 1997, 1998 ở Mỹ gồm một phần diện tích đất trồng bông kháng thuốc diệt cỏ

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nớc

Rất nhiều quốc gia đã và đang tham gia mạnh mẽ vào lĩnh vực tạo và thơngmại hoá cây trồng biến đổi di truyền Một số nớc Đông Nam á nh Thái Lan, Phi-lip-pin, Malaysia cũng đang nhập cuộc ở Việt Nam, lĩnh vực chuyển gen tạo sinh vậtbiến đổi di truyền còn rất chậm phát triển so với thế giới Do điều kiện còn hạn chếnên các công trình nghiên cứu về chuyển gen còn ít Gần đây, với sự đầu t của nhànớc trong xây dựng tiềm lực cán bộ và phòng thí nghiệm, chúng ta đã làm chủ đ ợccác kỹ thuật cơ bản và triển khai đợc một số nghiên cứu làm cơ sở để tạo sinh vậtbiến đổi di truyền

Trong lĩnh vực tạo cây trồng biến đổi di truyền, nghiên cứu chuyển genkháng côn trùng vào cây trồng cũng bắt đầu với mong muốn tạo ra và đ a vào ứngdụng các giống cây trồng lý tởng có khả năng tự chống chịu sâu bệnh Tại ViệnCông nghệ Sinh học, nhiều gen quý nh gen mã hoá lectin và -AI ở đậu cô ve đã đ-ợc phân lập và tạo dòng [8], gen mã hoá protein bất hoạt hoá ribosom cũng đợc phânlập và biểu hiện thành công trong vi khuẩn, nấm men [6], [7], [10] Các gen có giá trịnày đã và đang đợc nghiên cứu để chuyển vào cây trồng Đặc biệt, phơng pháp chuyển

gen nhờ Agrobacterium cũng đợc sử dụng ở một số phòng thí nghiệm về công nghệ gen

và thu đợc những kết quả khả quan trên các đối tợng cây trồng quan trọng nh lúa, cảixanh, cải bắp, bông, đu đủ, khoai tây, khoai lang [3], [11], [15], [16], [17], [22], [24].Tuy nhiên, các công trình chuyển gen thờng đợc triển khai sử dụng các vectơ mang genchỉ thị để hoàn thiện các quy trình chuyển gen vào một số cây trồng quan trọng làm cơsở cho bớc chuyển gen có giá trị vào các đối tợng cây trồng này

1.3.3 Những vấn đề nan giải và giải pháp cần thiết1.3.3.1 Khía cạnh sở hữu trí tuệ

Thế giới với hàng triệu ngời bị đói do thiếu lơng thực, gần 800 triệu ngời suydinh dỡng trở thành mối quan tâm của toàn nhân loại [76] Làm sao để tăng sản lợngvà chất lợng lơng thực khi công nghệ sinh học cải biến cây trồng chỉ tập trung ở mộtsố công ty chính? Các công ty này đầu t kinh phí đáng kể để nghiên cứu, tạo ra côngnghệ và đăng ký sở hữu trí tuệ Rất nhiều sáng chế liên quan đến phơng pháp biếnnạp gen, biểu hiện gen, gen đặc hiệu, chỉ thị chọn lọc và đoạn khởi động đã đợccông nhận [160] Hiện nay, các công nghệ liên quan đến việc tăng hiệu quả trồngtrọt, hạn chế rủi ro, giảm ảnh hởng có hại của môi trờng đối với sản xuất nôngnghiệp nh công nghệ tạo giống cây trồng có khả năng sinh trởng nhanh, cho sản l-ợng cao và chống chịu đợc điều kiện bất lợi; công nghệ tạo thực phẩm chất lợngtốt thờng do các công ty chính nắm quyền kiểm soát (về mặt kỹ thuật và sở hữu trítuệ) Do vậy, hầu hết các công nghệ này không đợc công bố rộng rãi và nông dân

nghèo ở khắp nơi trên thế giới thờng không phải là đối tợng đợc tiếp nhận công nghệ[100], [101] Chỉ một số ít công ty đã tự nguyện hỗ trợ và chuyển giao công nghệcho các nớc đang phát triển Đến nay, một số công nghệ đã đợc tiếp nhận và đa vàoứng dụng.

1.3.3.2Khía cạnh kỹ thuật

Hiện nay, vấn đề một số loài côn trùng và sâu hại có khả năng kháng lạithuốc trừ sâu hoá học cũng nh protein độc tố là một thách thức lớn Nghiên cứu củaTabashnik đã khẳng định sự hình thành quần thể sâu hại kháng lại protein tinh thể

độc đang ở mức báo động [185] Đối phó với hiện tợng này, các nhà khoa học đã đa

ra một giải pháp hữu hiệu khi chuyển nhiều gen với các cơ chế kháng sâu khác nhau

vào cùng một đối tợng cây trồng [41], [51] Chủng Bt chủ EG4923-4 thờng đợc sửdụng để chuyển các gen cryIC tự nhiên cũng nh đột biến nhằm tăng hiệu quả diệtcôn trùng EG4923-4 đợc thiết kế mang đồng thời 3 gen cryIA(c) và 1 gen cryIIA

trên các plasmit tự nhiên [171] Gần đây, độc tố CryIA(c) và CryIF đợc biểu hiện

đồng thời trong cây trồng nhằm tăng hiệu quả diệt H armigera [48] Gen cryIA(b)và cryIA(c) đợc chuyển vào lúa tạo protein có hoạt tính độc mạnh đối với sâu đục

thân bớm hai chấm và sâu đục thân năm vạch [52] Để tăng khả năng kháng ấutrùng sâu róm đục chồi thuốc lá, gen mã hoá chất ức chế proteaza dạng serin vàlectin tách từ đậu đã đợc chuyển đồng thời vào cây thuốc lá [40] Tuy vậy, mức độtăng cờng không nhiều khi cơ chế kháng sâu của các gen này không tơng hợp.Trong khi đoạn trình tự nhân tạo mã hoá cho chất ức chế trypsin ở cây bí dài 29 aa

đợc chuyển cùng với gen cryIA(c) cải biến vào cây thuốc lá lại làm tăng hoạt tínhdiệt ấu trùng H virescens lên 6 lần Kết quả nhận đợc tơng tự khi biểu hiện đồng

thời protein tinh thể độc và nọc độc bọ cạp trong cùng một loài cây [36] Ngoài ra,hiện nay có một số quan điểm cho rằng những gen kháng sâu bệnh khi đợc đa vàocây trồng cũng có thể tiêu diệt côn trùng có ích, gây độc con ngời, vật nuôi hoặc gâydị ứng cho những ngời mẫn cảm do cây trồng biến đổi di truyền có khả năng sản tạora protein kháng sâu với nồng độ cao Tuy nhiên, cây trồng biến đổi di truyền thờngđợc đánh giá, kiểm tra chặt chẽ trớc khi sản xuất đại trà nhằm giảm tối đa nhữngảnh hởng bất lợi Với những giám sát này, trong 15 năm qua, thực tế không có mộttrờng hợp nào các cây trồng này gây hại động vật, sức khoẻ con ngời, và ảnh hởngmôi trờng Theo kết quả đánh giá của Cơ quan Kiểm dịch Động Thực vật - Bộ Nôngnghiệp Mỹ (APHIS), cây trồng biến đổi di truyền thậm chí còn an toàn hơn nhữngloài cây trồng thông thờng vốn không đợc các nhà quản lý kiểm nghiệm kỹ lỡng.

Những cây trồng chuyển gen cry không gây ảnh hởng bất lợi đến môi trờng trong

hơn 30 năm sản xuất đại trà [145] Tranh cãi về những điểm mạnh yếu của cây trồng

biến đổi di truyền cũng nh cây trồng có khả năng kháng sâu vẫn cha kết thúc Tuynhiên, doanh thu hàng năm từ việc sản xuất, kinh doanh cây trồng tự kháng sâu bệnhvẫn tăng không ngừng Theo số liệu gần đây, chỉ tính riêng ở Mỹ, cây bông, ngô và

khoai tây mang gen cry đợc đa vào sản xuất từ 1995/ 1996 đã đem lại lợi nhuận

hàng trăm triệu đô la Mỹ mỗi năm Các gen kháng côn trùng mới vẫn tiếp tục đợckhám phá và ứng dụng nhằm mở rộng phạm vi ảnh hởng của protein độc tố đếnnhững loài côn trùng gây hại khác, đặc biệt đối với những loài không mẫn cảm vớicác loại độc tố đã biết

Đến nay, hàng loạt cây trồng có khả năng kháng côn trùng đã đợc trồng đạitrà cho mục đích thơng mại, một số khác đang đợc thử nghiệm ở quy mô phòng thínghiệm hay đồng ruộng Các cây trồng này có mặt ở khá nhiều nớc phát triển, đợckiểm tra, phân tích, thử nghiệm và quản lý kỹ lỡng Nhờ sự hỗ trợ và chuyển giao,một số nớc đang phát triển đã nhận đợc những công nghệ tạo cây trồng biến đổi ditruyền Với nỗ lực của toàn nhân loại, tơng lai của vấn đề phòng chống sâu bệnh chocây trồng chứa đựng nhiều hứa hẹn.

Các plasmit và chủng vi khuẩn đã sử dụng đợc trình bày trên bảng 2.4 và 2.5.

Bảng 2.4. Các plasmit đã sử dụng trong nghiên cứu

pBluescript KS(-) 2961 Ampr, lacZ-P Stratagene, Mỹ

pNOV2819 7599 Spectinomycinr Syngenta, Thuỵ Sĩ

Các vật liệu khác: (1) Cặp mồi nhân C71S-P do chúng tôi thiết kế đợc đặt

tổng hợp tại hãng GENSET (Singapore Biotech Pte, Ltd.) (2) Kháng thể khángCryIA(c) do GS Supat Attathom, Trung tâm Kỹ thuật Di truyền Thực vật, Trờng Đạihọc Kasetsart, Thái Lan cung cấp (3) Kháng nguyên CryIA(b), kháng thể chuẩnkháng CryIA(c) nhận đợc từ TS Nguyễn Thị Lộc, Bộ môn Sinh thái Côn trùng vàPhòng trừ Sinh học, Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long; Kháng nguyên CryIA(c) doTS Võ Thị Thứ, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

LoàiChủngNơi cung cấp

A tumefaciens GS K Muntz, Viện Di truyền Thực vật và Nghiên cứu cây trồng Gatersleben, Đức

2.1.2 Hoá chất và thiết bị máy móc

Các loại hoá chất: ALFExpressTMAutoCycleTMSequencing Kit, ReproGelTMLongRead Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển); enzym hạn chế (RestrictionEnzymes), T4 ADN ligaza, thang ADN (New England Biolabs, Mỹ); Taq ADNpolymeraza (Perkin Elmer Cetus, Mỹ); Agaroza (Gibco BRL Life Technologies, Mỹ);Tris base, EDTA (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển) và các hoá chất thôngdụng khác đợc mua của các hãng New England Biolabs, Perkin Elmer Cetus, Merk/BDH Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ).

Các loại thiết bị máy móc: Máy xác định trình tự nucleotit tự động - ALFExpress, máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển); Máy quangphổ tử ngoại - Diode Array Spectrophotometer 8452 A (Hewlett Parkard, Mỹ); Máyly tâm AvantiTM30 (Beckman, Mỹ); Máy ly tâm 5415 C (Eppendorf, Đức); MáyPCR - PTC 100 (MJ Research- Mỹ); Máy điện di Power Pac 300, máy biến nạpxung điện Gene Pulser, máy soi ADN (Bio-Rad, Mỹ); Máy đo pH Meter Delta 320(Mettler Toledo, Thuỵ Sĩ); Máy hút chân không - Speed Vac Sc 110A (Savant, Mỹ).

2.2.1 Nuôi cấy và lu giữ các chủng vi khuẩn

2.2.1.1Nuôi cấy vi khuẩn: Chuyển một khuẩn lạc từ đĩa môi trờng thạch (có

kháng sinh chọn lọc) sang 5 ml môi trờng lỏng đã bổ sung kháng sinh tơng ứng,nuôi cấy lắc 160 vòng/ phút (v/ p) từ 8 - 16 giờ ở 370C trên môi trờng LB (đối với E.coli), 20 - 48 giờ ở 280C trên môi trờng YEP (đối với A tumefaciens).

2.2.1.2 Cấy ria tạo khuẩn lạc đơn: Nhúng que cấy vô trùng vào dịch nuôi cấy

vi khuẩn, cấy ria trên đĩa petri chứa môi trờng thạch có kháng sinh, nuôi cấy ở nhiệtđộ và thời gian thích hợp, sau đó giữ ở 40C và sử dụng trong vòng một tháng

2.2.1.3 Giữ giống: Bổ sung glyxerol vô trùng đến nồng độ cuối cùng 15% vào

0,5 - 1 ml môi trờng lỏng đã nuôi cấy vi khuẩn qua đêm và giữ ở -800C Theo phơngpháp này giống có thể duy trì đợc trong vài năm

2.2.1.4 Môi trờng chọn lọc vi khuẩn: Các chất chọn lọc cần đợc bổ sung vào

môi trờng nuôi cấy khi nhiệt độ môi trờng khoảng 500C, giữ đĩa ở 40C và sử dụng

trong vài ngày đến vài tuần tuỳ vào độ bền của các chất chọn lọc Môi trờng nuôicấy các chủng vi khuẩn đợc trình bày trên bảng 2.6.

Bảng 2 6 Môi trờng nuôi cấy [52], [71], [170]

KCl: 2,5 mM; MgSO4: 10 mM; MgCl2: 10 mM; Glucoza: 20 mM

2.2.2 Tách chiết và tinh sạch ADN plasmit, ADN genom

2.2.2.1 Tách chiết ADN plasmit của vi khuẩn E coli và A tumefaciens

Tế bào vi khuẩn đợc nuôi cấy và nhân lên đến giai đoạn giữa pha log Thànhtế bào đợc phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh có trong dung dịch I và dung dịchII ADN nhiễm sắc thể và protein trong tế bào đợc loại ra nhờ dung dịch III vàphenol, chloroform, isoamylalcohol ADN plasmit đợc kết tủa bằng ethanol và thulại nhờ ly tâm với tốc độ 14000 v/ p ADN đợc hòa trong TE (Tris.Cl + EDTA) vàtiến hành loại ARN Hoá chất tách chiết ADN plasmit bao gồm: (1) Dung dịch I: 50mM glucoza; 25 mM Tris.Cl pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0 Khử trùng, giữ ở - 40C;(2) Dung dịch II: 0,2 N NaOH; 1% SDS (Sodium dodecyl sulfate) Pha mới trớc khisử dụng; (3) Dung dịch III: 60 ml axetat K 5 M; 11,5 ml axit axetic; 28,5 ml H2O; (4)Dung môi loại protein: phenol; hỗn hợp phenol : chloroform : isoamylalcohol (25:24:1); chloroform : isoamylalcohol (24:1); (5) 0,01M TE pH 8,0: 0,1 mM Tris.Cl pH8,0; 0,01 mM EDTA pH 8,0.

● Quy trình tách chiết ADN plasmit của E coli: (1) Nuôi cấy lắc qua đêm tế

bào E coli trong 3 ml môi trờng LB với kháng sinh thích hợp ở 370C, 200 v/ p; (2)Ly tâm 1,5 ml dịch nuôi cấy trên ở 6000 v/ p, 8 phút; (3) Hoà cặn tế bào vi khuẩntrong 100 l dung dịch I để lạnh, giữ trong đá 5 phút; (4) Bổ sung 200 l dung dịchII pha mới, đảo đầu ống eppendorf nhẹ nhàng và giữ trên đá 10 phút; (5) Thêm 150l dung dịch III để lạnh, đảo nhẹ và ủ trong đá từ 3-5 phút; (6) Thêm 550 l phenol :chloroform, đảo đầu ống eppendorf và ly tâm ở 14000 v/ p, 15 phút; Hút dịch phatrên sang ống eppendorf mới và chiết tiếp bằng chloroform : isoamylalcohol; (7) Bổsung 1 ml cồn tuyệt đối và 10 l 3M axetat Na, để lạnh -200C trong 3 giờ và ly tâm14000 v/ p, 8 phút thu ADN; (8) Rửa cặn bằng 0,2 ml cồn 70%, ly tâm 14000 v/p, 3

phút, làm khô và hoà cặn trong 40 l 0,01 M TE, giữ ở -20 0C; (9) Bổ sung RNazavào mẫu ADN đến nồng độ cuối cùng là 100 μg/ ml,ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ, chiếtbằng phenol : chloroform, chloroform : isoamylalcohol và tủa lại ADN bằng ethanol;(10) nồng độ và độ sạch của ADN đợc xác định bằng phổ hấp thụ trên máy quangphổ tử ngoại và điện di trên gel agaroza 0,8% [170].

● Tách chiết ADN plasmit của A tumefaciens: (1) Nuôi cấy lắc tế bào ở

280C, 36 giờ trên môi trờng YEP có bổ sung kháng sinh; (2) Ly tâm 1,5 ml dịchnuôi cấy trên ở 12000 v/ p trong 10 phút, hoà cặn tế bào nhẹ nhàng trong 1 ml dungdịch rửa pH 8,0 (0,5 M NaCl; 50 mM Tris.Cl; 20 mM EDTA; 0,1 % sarcosyl), sauđó ly tâm ở 12000 v/ p, 40C, trong 1 phút; (3) Hoà cặn trong 100 μl dung dịch GTE(50 mM glucoza; 25 mM Tris.Cl; 10 mM EDTA pH 8,0), thêm 25 μl lysozym 40mg/ ml pha trong GTE, trộn đều và ủ ở 370C trong 15 phút; (4) Bổ sung 200 μl dungdịch II pha mới, đảo nhẹ đầu ống eppendorf, ủ 10 phút ở 370C Nếu mẫu khôngtrong, ủ ở 500C, 5 phút; (5) Bổ sung 150 μl dung dịch 3M axetat Na pH 5,2; lắc, giữ10 phút ở nhiệt độ phòng; (6) Ly tâm ở 12000 v/ p trong 5 phút, chuyển dịch phatrên sang eppendorf mới, bổ sung 550 μl phenol : chloroform, ly tâm 15 phút và tiếptục chuyển pha trên sang eppendorf mới Bổ sung 1 ml cồn tuyệt đối và giữ ở -200Ctrong 1-2 giờ; (7) Ly tâm ở 12000 v/ p trong 5 phút để thu ADN/ ARN, rửa cặn bằngcồn 70% và hoà cặn trong 50 μl TE [197].

2.2.2.2 Tách chiết ADN genom thực vật

Phơng pháp tách chiết ADN genom từ mô thực vật đợc tiến hành theo Murray& Thompson [150] với các bớc: (1) Nghiền 2g lá bằng cối chày sứ (đã vô trùng vàđợc giữ ở -700C) trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn; bọc cối, chày bằnggiấy bạc và giữ ở -200C trong 30 phút; (2) Hòa tan mẫu trong 15 ml dung dịch đệmchiết CTAB có thành phần: 700 mM NaCl, 50 mM Tris.Cl pH 8,0; 10 mM EDTApH 8,0; 2-3% CTAB; (3) Ngâm mẫu trong bể ổn nhiệt ở 600C, 40-60 phút; (4) Thêm10 ml chloroform : isoamylalcohol, lắc nhẹ 5 phút để loại protein và tạp chất; (5) Lytâm mẫu 10 phút, 4000 v/ p ở 40C, chuyển dịch pha trên sang ống ly tâm mới cóchứa sẵn 5 ml isopropanol, thêm từ từ 10 ml isopropanol, giữ mẫu trong đá từ 20 - 40phút; (6) Dùng móc lấy ADN cho vào ống eppendorf chứa cồn 70%, ly tâm 14000 v/ p,5 phút ở 40C, loại dịch, làm khô mẫu và hòa tan ADN trong 0,01 M TE.

2.2.3 Thiết kế và tổng hợp đoạn mồi

Thiết kế trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để nhân gen đợc tiến hành nhờ chơngtrình PC GENE với một số điểm chú ý: (1) Trình tự mồi liên quan đến hiệu quả củaquá trình nhân gen; (2) Trình tự Guanin/ Xytonin ít, tỷ lệ Guanin : Xytonin cân đối,không nên có ≥ 4 nucleotit cùng loại liên tiếp; (3) Nhiệt độ của mồi cần cao hơn500C để đảm bảo tính đặc hiệu của PCR [1]

2.2.4 Phản ứng dây chuyền polymeraza (Polymerase Chain Reaction- PCR)

Nhờ sự xúc tác của enzym ADN polymeraza chịu nhiệt, các đoạn ADN mớiđã đợc tổng hợp từ ADN khuôn trong môi trờng d thừa các deoxyribonucleotit(dNTP) và cặp mồi đặc hiệu PCR cho phép nhân nhanh một số lợng lớn không hạnchế nguyên bản một đoạn ADN trong thời gian ngắn nhất Các thành phần tham giaPCR: đoạn ADN khuôn, hai đoạn mồi đặc hiệu có chiều dài 15 -30 nucleotit, bốnloại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), ADN polymeraza PCR bao gồm các giaiđoạn: (1) Giai đoạn biến tính ADN từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn nhờ nângnhiệt độ lên 940C-950C trong vòng 30 giây đến vài phút; (2) Giai đoạn bắt cặp củamồi: Hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ gắn với đoạn ADN tơng đồng ở hai đầu đoạnADN cần nhân theo nguyên tắc bổ sung khi hạ nhiệt độ xuống dới nhiệt độ Tm tơngứng của các đoạn mồi (37 - 650C); (3) Giai đoạn kéo dài chuỗi: Phản ứng tổng hợpphân tử ADN kéo dài từ đoạn mồi, thực hiện ở 720C nhằm tránh hiện tợng gắnkhông đặc hiệu

Chu trình nhiệt để tiến hành PCR nhân C71S-P: 950C - 30 giây, 950C - 1 phút,540C - 1 phút, 720C - 1 phút 20 giây, 35 chu kỳ (từ bớc 2 đến bớc 4), 720C - 8 phút,kết thúc ở 40C Sản phẩm PCR đợc kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza, gắn vàovectơ và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng và xác định trình tự

2.2.5 Ly tâm tinh chế ADN từ bản gel agaroza

Phơng pháp tinh chế ADN từ bản gel agaroza đợc tiến hành theo Sambrook &đtg [170] với một vài cải biến nhỏ cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Cácbớc tinh chế ADN: (1) Đặt lên máy soi ADN bản gel đã đợc điện di và cắt phần gelchứa đoạn ADN cần tinh chế bằng một phiến dao mỏng đã khử trùng; (2) Dùng kimchâm một lỗ thủng ở đáy của ống eppendorf 0,5 ml trong có đặt một ít bông khôngthấm nớc và đặt ống eppendorf này vào trong một ống eppendorf 1,5 ml đã cắt bỏnắp và đem khử trùng; (3) Tiến hành chuyển mẫu gel mang ADN vào ống eppendorf0,5 ml, cắt lát chúng thành nhiều mảnh nhỏ hơn và ly tâm 5 phút ở 10000 v/ p; (4)Thêm một lợng phenol : chloroform cân bằng với thể tích mẫu và ly tâm 14000 v/ p,15 phút; Lặp lại bớc chiết với chloroform : isoamylalcohol; (5) Dùng 1/ 10 thể tích

của 3M axetat Na và 2 thể tích của cồn tuyệt đối để tủa ADN từ dịch ly tâm thu đ ợctrong 3 giờ ở -200C; (6) Ly tâm thu ADN ở 14000 v/ p, 5 phút và hoà trong TE.

2.2.6 Phản ứng cắt ADN với enzym hạn chế

Enzym hạn chế là nucleaza nội bào có khả năng nhận biết các đoạn ADN vớicác trình tự nucleotit nhất định, bám vào đoạn ADN đó và cắt cả hai sợi của phân tử

ADN Các enzym hạn chế thờng đợc sử dụng để cắt ADN: (i) Tạo đầu bằng, nh SmaI, EcoR V cắt hai sợi ADN tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng không có khả năngtự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính nh EcoR I, Sac I cắt theo vị trí lệch nhau trên hai

sợi tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại

Phản ứng cắt ADN với enzym hạn chế có sự tham gia của các thành phần: 1μl dung dịch đệm; 2 μl ADN (~20 ng); 0,25 μl enzym hạn chế; 6,75 μl H2O khử ionvô trùng Hỗn hợp phản ứng đợc trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (thờngở 370C, 2 giờ) Sản phẩm phản ứng đợc kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza ởnồng độ thích hợp.

2.2.7 Điện di

2.2.7.1Điện di ADN trên gel agaroza

Các đoạn ADN có khối lợng và điện tích khác nhau đợc tách ra khi di chuyểntừ cực âm sang cực dơng của máy điện di trong một điện trờng có điện thế và cờngđộ thích hợp Hoá chất điện di: agaroza 0,8-1,4% (phụ thuộc vào kích thớc phân tửADN), dung dịch đệm TBE 5X (Tris base: 54 g, axit boric: 27,5 g, EDTA 0,5 M pH8,0: 20 ml), bromit ethidium (ethidium bromide - EtBr): 10 mg/ ml, đệm tra mẫu(Loading buffer - 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml glyxerol 100% và dẫn bằngnớc đến 1 ml) Quy trình điện di nh sau:

(1) Chuẩn bị gel agaroza: cho 0,8 - 1 g agaroza vào 100 ml dung dịch TBE1X, đun cho agaroza tan hoàn toàn, để nguội xuống khoảng 50-600C, đổ dung dịchagaroza vào khay gel điện di có cài sẵn răng lợc Sau 30-60 phút, khi gel đã đôngcứng, đặt vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X ngập cách mặt gel từ 1-2 mm, gỡ lợc ra

(2) Mẫu ADN đợc trộn với 3 l đệm tra mẫu và đợc tra vào các giếng nhỏ trêngel, chạy điện di (30-40 V, 60-80 mA) cùng chỉ thị phân tử ADN chuẩn (bảng 2.7) đểxác định trọng lợng phân tử, quan sát sự di chuyển màu để ngừng quá trình điện di

(3) Bản gel đợc lấy nhẹ ra khỏi khuôn, ngâm 30 - 45 phút trong dung dịch ớc có EtBr nồng độ 0,5 g/ ml trên một máy lắc nhẹ, rửa bằng H2O, quan sát dớiánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi ADN và chụp ảnh.

n-Bảng 2.7 Chỉ thị phân tử ADN chuẩn 1 kb và ADN/ EcoR I + Hind III

ADN 21,2265,1484,9734,2683,5302,0271,9041,5841,3750,9470,8310,554

2.2.7.2 Điện di protein trên gel polyacrylamit

Điện di đợc tiến hành theo Laemmli [128] trên bộ điện di chuẩn của hãng Rad Chúng tôi sử dụng gel 4% (0,125M Tris, pH 6,8) để cô mẫu trong gel khi chạy điệndi Gel phân tách protein (0,375M Tris, pH 8,8) đợc sử dụng ở nồng độ 7,5%, 10%,12,5%, 15%, hoặc 17,5% (bảng 2.8) Các dung dịch mẹ để chuẩn bị gel: acrylamit/ bis-acrylamit (100:3): 30%; 0,5M Tris.Cl pH 6,8; 1,5M Tris.Cl pH 8,8; 10% SDS; 10% APS(Ammonium persulfate); TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine) nguyênchất Điện di đợc tiến hành trong dung dịch đệm Tris-Glycin có chứa 1% SDS pH 8,3,điện áp 130-170V trong 1 giờ Sau điện di, gel đợc cố định bằng dung dịch 7% axittrichloroaxetic và nhuộm bằng Coomassie R-250 Bộ protein khối lợng chuẩn bao gồm:phosphorylase b (94 kDa); albumin (67 kDa); ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase(30 kDa); trypsin inhibitor (20,1 kDa); -lactalbumin (14,4 kDa).

Bio-Bảng 2.8 Công thức pha dung dịch gel polyacrylamit (5 ml)

2.2.8 Loại bỏ nhóm 5' photphat của vectơ

Nhằm tránh hiện tợng tự đóng vòng, vectơ sau khi cắt hoàn toàn bằng enzymhạn chế thờng đợc loại nhóm photphat ở đầu 5' theo các bớc: (1) Chiết bằng phenol :chloroform mẫu ADN plasmit (10 - 20 g) và tủa bằng hai thể tích cồn tuyệt đốitrong 15 phút ở 00C; (2) Ly tâm thu ADN ở 40C, 12000 v/ p, 10 phút; (3) Hoà cặnADN trong 90 l 10 mM Tris.Cl (pH 8,3), điện di kiểm tra và giữ mẫu còn lại ở -200C; (4) Thêm 10 l dung dịch đệm dùng cho CIP (enzym photphataza kiềm đợc táchtừ ruột bê - calf intestinal alkaline phosphatase) cùng một lợng enzym CIP thích hợpvà ủ ở điều kiện tơng ứng (Lợng enzym cần dùng và điều kiện ủ phụ thuộc vào đoạncắt ADN mang đầu dính hay đầu bằng); (5) Sau khi ủ, thêm SDS và EDTA (pH 8,0)vào mẫu đến nồng độ cuối cùng tơng ứng là 0,5 % và 5 mM, trộn đều và thêm