Thông tin tài liệu
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRỊNH LÊ ANH
NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CÁC HOẠT
CHẤT TRONG THUỐC TIÊM CGI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I
HÀ NỘI 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRỊNH LÊ ANH
NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CÁC HOẠT
CHẤT TRONG THUỐC TIÊM CGI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I
CHUYÊN NGÀNH: CNDP VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ:
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
Nơi thực hiện: Trường Đại Học Dược Hà Nội
Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa
Thời gian thực hiện: 20/01 – 20/5/2015
HÀ NỘI 2015
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp tôi đã nhận
được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ quý báu từ các thầy cô giáo
trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị đồng nghiệp của Trung tâm
kiểm nghiệm Thanh Hóa.
Nhân dịp này tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn
Thị Kiều Anh đã hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ những kiến thức quý báu
trong quá trình thực hiện luận văn cũng như trong quá trình học tập, công
tác.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, và tạo điều kiện để tôi hoàn thành
khóa học này.
Tôi xin phép được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng tập thể cán
bộ Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi
trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi trân thành cảm ơn và bày tỏ tình cảm sâu sắc tới những
người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Học viên Trịnh Lê Anh
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CGI
: Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection
ESI
: Chế độ ion hóa bằng phun điện tử
HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC
: Sắc ký lỏng
LC-MS/MS
: Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần
m/z
: Khối lượng/ điện tích
MeCN
: Acetonitril
MeOH
: Methanol
mM
: Milimol
MRM
: Chế độ bắt đa mảnh phổ
MS
: Khối phổ
PA
: Tinh khiết phân tích
PDA
: Detector photo diod array
Q
: Quadrupple tứ cực
R
: Hệ số tương quan tuyến tính
RSD
: Độ lệch chuẩn tương đối
SD, CV
: Độ lệch chuẩn tuyệt đối
SIM
: Chế độ bắt phổ chọn lọc
SRM
: Chế độ bắt một mảnh phổ
UPLC
: Sắc ký lỏng siêu cao áp
UV
Tia tử ngoại
MỤC LỤC
MỤC
TRANG
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN
3
1.1 THUỐC TIÊM COMPOUND GLYCYRRHIZIN
INJECTION (CGI).
1.1.1 Nguồn gốc và công thức bào chế của thuốc tiêm CGI.
1.1.2 Công thức cấu tạo và các tính chất hóa lý các thành phần hoạt
chất.
1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ định
thuốc tiêm CGI.
3
3
3
5
1.1.4 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI
7
1.2 SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS)
9
1.2.1.Khái niệm.
9
1.2.2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba [20], [18]
9
1.2.3 Ứng dụng
14
1.3 NỘI DUNG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
15
1.3.1. Tính đặc hiệu
15
1.3.2. Độ tuyến tính
15
1.3.3. Độ đúng
15
1.3.4. Độ chính xác
16
1.3.5. Độ vững
17
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGUYÊN CỨU
18
18
2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU
18
2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20
2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích
20
2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích
21
2.3.3 Xử lý kết quả
24
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
25
3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
25
3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ
25
3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký phân tích đồng thời các thành
phần của thuốc tiêm CGI.
29
3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
31
3.2.1 Độ chọn lọc của phương pháp
31
3.2.2 Độ tuyến tính của phương pháp
34
3.2.3 Độ chính xác
36
3.2.4 Độ đúng
41
3.2.5 Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích
45
Chương 4. BÀN LUẬN
46
4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
48
4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
52
KẾT LUẬN
52
KIẾN NGHỊ
53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
TÊN BẢNG
TRANG
Bảng 2.1. Thành phần công thức mẫu Placebo số 1.
19
Bảng 2.2. Thành phần công thức mẫu Placebo số 2.
19
Bảng 2.3. Thành phần công thức mẫu Placebo số 3.
19
Bảng 2.4. Thành phần công thức mẫu Placebo số 4.
20
Bảng 3.1 Các thông số khối phổ
25
Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phần
hoạt chất trong mẫu thuốc tiêm CGI.
31
Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chọn lọc của phương pháp
33
Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của phương pháp
35
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp
38
Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương
pháp
40
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng
đối với thành phần Glycin
42
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng
đối với thành phần Glycyrrhizin
43
Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng
đối với thành phần L-Cystein
44
Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của dược chất trong điều
kiện thí nghiệm.
45
DANH MỤC CÁC HÌNH
TÊN HÌNH
TRANG
Hình 1.1 – Công thức cấu tạo của Glycyrrhizin
3
Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của Glycine.
4
Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid
4
Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ.
9
Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESI
11
Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập ba
12
Hình 1.7 – Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực
12
Hình 3.1 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycin (m/z = 76) tạo ra
mảnh con (m/z = 29).
26
Hình 3.2 Phổ khối khi phân mảnh Glycin-H+ (m/z = 76).
26
Hình 3.3 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh glycyrrhizin (m/z = 840)
tạo ra mảnh con (m/z = 453)
27
Hình 3.4 Phổ khối khi phân mảnh Glycyrrhizin-H+ (m/z = 840).
27
Hình 3.5 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Cystein (m/z = 121) tạo
ra mảnh con (m/z = 58).
28
Hình 3.6 Phổ khối khi phân mảnh Cystein-H+ (m/z = 121).
28
Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycin và mẫu trắng.
32
Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycyrrhizin và mẫu trắng.
32
Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn L-Cystein và mẫu trắng.
33
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection (CGI) chứa ba thành
phần hoạt chất bao gồm: Glycyrrhizin 40mg; Glycin 400mg; L-Cystein
20mg, được dùng trong điều trị rối loạn chức năng gan, hỗ trợ điều trị viêm
gan C; hỗ trợ điều trị eczema [14], [15]. Thuốc có trong danh mục thuốc
thanh toán bảo hiểm y tế và danh mục thuốc thiết yếu của Việt Nam vì vậy
thuốc được sử dụng ngày càng nhiều trong điều trị nhất là điều trị nội trú,
bảo vệ gan trước sự tác động có hại của các loại thuốc khác.
Tại Việt Nam hiện nay đang tiến hành làm hồ sơ xin cấp phép lưu
hành [14]. Tại Nhật Bản thuốc có thành phần tương tự được sử dụng rộng
rãi trong điều trị [15].
Để xây dựng tiêu chuẩn của thuốc, một trong những chỉ tiêu quan
trọng nhất là phải xây dựng được phương pháp định tính và định lượng
được các hoạt chất đảm bảo tính đặc hiệu, ổn định và chính xác [5], [6].
Đối với hai thành phần acid amin L-Cystein, Glycin trong chế phẩm thuốc
Compound Glycyrrhizin Injection - là những hoạt chất không hấp thụ UV
nên không thể định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-VIS [12],
[18], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector
thông thường như: UV-VIS; PDA cũng không định lượng được các thành
phần hoạt chất này. Các hoạt chất này có thể phân tích được dựa vào phản
ứng dẫn xuất nhóm amin với thuốc thử thích hợp và phát hiện bằng HPLC
với detector huỳnh quang [17]. Quá trình dẫn xuất được thực hiện trước cột
hoặc sau cột khi phân tích bằng sắc ký, nhưng kết quả thường kém ổn định
và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai
lần (LC-MS/MS) là phương pháp phân tích hiện đại, có tính đặc hiệu và
lặp lại cao, có thể phân tích trực tiếp đồng thời các chất trong hỗn hợp ngay
cả khi các chất phân tích không tách rời nhau khi qua hệ thống sắc ký. Do
1
đó, kỹ thuật này được sử dụng ngày càng nhiều trong phân tích thuốc, đặc
biệt những phép phân tích khó như các thuốc có thành phần phức tạp, phân
tử lớn, hàm lượng thấp.
Để góp phần triển khai kỹ thuật phân tích mới tại trung tâm Kiểm
nghiệm thuốc Thanh Hóa và nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốc
lưu hành trên thị trường, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký
lỏng khối phổ” với mục tiêu cụ thể như sau:
1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích để định tính, định lượng
đồng thời Glycin, Glycyrrhizin, L-cystein bằng kỹ thuật LCMS/MS.
2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời Glycin,
Glycyrrhizin, L-cystein trong chế phẩm thuốc CGI, từ đó hoàn
thiện qui trình định tính, định lượng các thành phần hoạt chất
trong chế phẩm thuốc CGI bằng LC-MS/MS.
2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1 THUỐC TIÊM COMPOUND GLYCYRRHIZIN INJECTION
(CGI).
1.1.1 Nguồn gốc và công thức bào chế của thuốc tiêm CGI.
+ Nguồn gốc:
Thuốc tiêm CGI (Compound Glycyrhizin Injection) được sản xuất
bởi: Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd. No.7 Rongchang
East Street, BDA, Beijing, China.
+ Công thức bào chế 20 ml dung dịch tiêm CGI:
Monoamoni Glycyrrhizinate tương đương Acid Glycyrrhizin
40 mg
Glycin
400 mg
L-cystein hydrochlorid
20 mg
Tá dược: Natri sulfit khan, natri clorid, amoniac, nước cất vừa đủ 20 ml
[13].
Thuốc đóng trong lọ thủy tinh trung tính, màu trắng, dung dịch thuốc trong
suốt, không màu.
1.1.2 Công thức cấu tạo và các tính chất hóa lý các thành phần hoạt chất.
Monoamoni Glycyrrhizinat
COOH
H
O
H
O
NH4OOC
O
HO HO
H
O
HOOC
HO HO
O
OH
Hình 1.1 – Công thức cấu tạo của Glycyrrhizin
3
- Công thức phân tử: C42H62O16;
- Trọng lượng phân tử: 839,97 g/mol;
- Tên khoa học: Acid (3β,18α)-30-hydroxy-11,30-dioxoolean-12-en-3yl 2-O-β-D-glucopyranuronosyl-β-D-glucopyranosiduronic.
- Bột kết tinh màu trắng;
- Tan tốt trong nước; tan trong ethanol, khó tan trong methylen clorid,
không tan trong ether [14]
Glycin
O
OH
NH2
Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của Glycin
-
Công thức phân tử: C2H5NO2;
Công thức cấu tạo: H2N-CH2-COOH;
Trọng lượng phân tử: 75,07 g/mol;
Tên khoa học: Acid aminoacetic;
Bột kết tinh màu trắng, vị ngọt;
Tan tốt trong nước; tan trong cả môi trường acid và môi trường
kiềm, tan trong ethanol, không tan trong ether [4], [13], [18].
L – Cystein hydroclorid
O
OH . HCL
HS
NH2
Hình 1.3 – Công thức cấu tạo của L - Cystein hydroclorid.
-
Công thức phân tử: C2H5NO2;
Công thức cấu tạo: HSCH2CH(NH2)COOH . HCl;
Trọng lượng phân tử: 157,62 g/mol;
Tên khoa học: 2-Amino-3-sulfhydrypropanoic hydroclorid;
4
- Bột kết tinh màu trắng;
- Tan tốt trong nước; tan trong cả môi trường acid và môi trường
kiềm, tan trong ethanol, không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân
cực [4], [13], [18].
1.1.3 Tác dụng dược lý, dược động học, chỉ định, chống chỉ định thuốc
tiêm CGI
Dược lực học [15]
+ Tác dụng chống viêm: Ức chế các enzym chuyển hóa acid
arachidonic: Glycyrrhizin có thể liên kết với phospholipase A2 (enzym
hoạt hóa cho sự chuyển hóa acid arachidonic) và lipoxygenase (chất gây
ảnh hưởng đến acid arachidonic và là nguyên nhân sản xuất trung gian
viêm), thông qua đó ức chế chọn lọc sự phosphoryl hóa và gây ức chế sự
hoạt hóa các enzym.
+ Tác dụng ức chế sự tổn thương tế bào gan: Thử nghiệm nuôi cấy tế
bào gan chuột trong ống nghiệm, glycyrrhizin ức chế sự tổn thương tế bào
gan do tetracloromethan gây ra.
+ Ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tính của virus: Ở những chuột thí
nghiệm bị nhiễm viêm gan virus, điều trị với glycyrrhizin có thể kéo dài
thêm tuổi thọ. Ở thỏ thí nghiệm bị nhiễm virus bệnh đậu mùa, glycyrrhizin
có thể ức chế sự phát triển của virus. Trong các thử nghiệm in-vitro khác,
glycyrrhizin cũng thể hiện tác dụng ức chế sự sinh sản và làm mất hoạt tính
của virus. Glycin và cystein gây ức chế hoặc giảm chứng tăng aldosteron
giả do các bất thường trao đổi điện giải trong quá trình điều trị dài ngày với
glycyrrhizin.
Dược động học [15]
+ Hấp thu: Đối với người khỏe mạnh, nồng độ thuốc trong máu giảm
đáng kể sau 10 giờ tiêm 40 ml dung dịch Compound Glycyrrhizin Injection
(chứa 80 mg glycyrrhizin). Sau đó nồng độ thuốc giảm dần dần. Acid
glycyrrhizic, sản phẩm thủy phân của glycyrrhizin, xuất hiện sau 6 giờ tiêm
thuốc, đạt nồng độ đỉnh sau 24 giờ và bị thải trừ hoàn toàn khỏi cơ thể sau
48 giờ.
5
+ Thải trừ qua nước tiểu: Đối với người khỏe mạnh sau khi tiêm
glycyrrhizin, nồng độ thuốc trong nước tiểu giảm dần. Tốc độ thải trừ là
1,2% liều sau 27 giờ tiêm thuốc. Acid glycyrrhizic bắt đầu xuất hiện sau 6
giờ và đạt nồng độ đỉnh sau 22 -27 giờ tiêm thuốc.
Chỉ định [15]
+ Hỗ trợ điều trị viêm gan mạn tính và cải thiện rối loạn chức năng gan.
+ Hỗ trợ điều trị eczema, viêm da, nổi mày đay.
Liều lượng và cách sử dụng [15]
+ Thuốc dùng đường tiêm truyền tĩnh mạch. Dùng theo chỉ dẫn của bác
sĩ điều trị.
Người lớn: Liều thông thường: Tiêm 5-20 ml mỗi ngày một lần. Có thể
điều chỉnh liều lượng tùy thuộc vào tuổi và triệu chứng của bệnh nhân.
+ Bệnh nhân viêm gan: Tiêm hoặc truyền tĩnh mạch 40-60 ml mỗi ngày
một lần. Có thể điều chỉnh liều lượng tùy thuộc vào tuổi và triệu chứng của
bệnh nhân. Liều hàng ngày tối đa không được vượt quá 100 ml/ ngày.
+ Bệnh nhân nhi: Chưa có nghiên cứu đầy đủ. Không khuyến cáo dùng
cho nhóm đối tượng này.
+ Bệnh nhân cao tuổi: Bệnh nhân cao tuổi thường có khuynh hướng bị
hạ kali máu. Do đó, việc sử dụng thuốc của bệnh nhân cần được theo dõi
chặt chẽ.
+ Sử dụng cho phụ nữ có thai và cho con bú: Chưa có nghiên cứu đầy
đủ và được kiểm soát tốt trên bệnh nhân nhi. Không dùng cho nhóm đối
tượng này.
Chống chỉ định [15]
+ Quá mẫn cảm với bất kỳ thành phần nào của thuốc.
+ Tăng aldosteron, đau cơ hoặc hạ kali máu.
+ Phụ nữ có thai hoặc nuôi con bú.
6
1.1.4 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI
Trên thế giới đã có nhiều tài liệu công bố về các phương pháp định
tính, định lượng: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein khác nhau bằng các kỹ
thuật: sắc ký lỏng [11], [13], [16]; chuẩn độ thể tích [12], [13], [18]; sắc ký
lỏng khối phổ [19], [17], [22].
Tuy thuốc CGI đã được sản xuất tại Nhật Bản, Trung Quốc và sử
dụng tại nhiều nơi trên thế giới, xong chưa có quốc gia nào đưa chuyên
luận thuốc tiêm có chứa các thành phần nói trên vào Dược Điển của mình.
Cũng chưa tìm thấy tài liệu công bố phương pháp định lượng đồng thời ba
hoạt chất nói trên.
Đối với thành phần Glycin dạng nguyên liệu một số dược điển đã
xây dựng phương pháp định lượng bằng chuẩn độ môi trường khan, trong
đó chất phân tích được hòa tan trong acid actetic băng, hoặc hỗn hợp acid
acetic băng và acid formic rồi chuẩn độ bằng acid percloric 0,1N với chỉ thị
tím tinh thể hoặc xác định điểm tương đương bằng đo điện thế [13]; [16];
[18]. Với phương pháp này dựa vào tính kiềm của nhóm -NH2 trong phân
tử hoạt chất, phương pháp này sẽ bị hạn chế nếu có mặt của nước (là một
dung môi khá phổ biến của thuốc tiêm), làm cho chất phân tích vừa thể
hiện tính kiềm, vừa thể hiện tính acid nên dung dịch trở nên trung tính,
không chuẩn độ được.
Chuyên luận thuốc tiêm Glycin (Glycine Irrigation Solution) trong
một số dược điển của các nước tiên tiến đã sử dụng phương pháp trung hòa
[13]; [16]; [18]. Nguyên tắc của phương pháp này là trong môi trường
nước các acid amin vừa thể hiện tính base vừa thể hiện tính acid nên dung
dịch trung tính. Khi có mặt formol các nhóm –NH2 bị khóa lại nên tính acid
trội lên có thể định lượng được bằng một dung dịch base chuẩn. Cả hai
phương pháp định lượng hóa học dựa vào tính kiềm của nhóm –NH2; hoặc
tính acid của nhóm –COOH đều không đặc hiệu. Phương pháp có giới hạn
phát hiện cũng như giới hạn định lượng cao. Khi trong công thức có thêm
các thành phần tá dược có tác dụng đệm pH, nền mẫu phức tạp phương
pháp sẽ gặp sai số hoặc không tiến hành được.
7
Hoạt chất Cystein dạng nguyên liệu một số dược điển đã xây dựng
phương pháp định lượng bằng chuẩn độ oxy hóa khử, trong đó chất phân
tích được hòa tan trong nước rồi chuẩn độ bằng dung dịch iod 0,1N phương
pháp thừa trừ hoặc chuẩn độ trực tiếp với chỉ thị hồ tinh bột [13]; [16];
[18]. Phương pháp này dựa vào tính khử của nhóm -SH trong phân tử hoạt
chất, độ đặc hiệu kém và đôi khi bị ảnh hưởng của sự có mặt một số chất
oxy hóa, như oxy hòa tan trong dung dịch.
Chế phẩm thuốc chứa Cystein một số tài liệu đã sử dụng phương
pháp oxy hóa khử với dung dịch chuẩn độ iod 0,1N chuẩn độ bằng phương
pháp trực tiếp hay phương pháp thừa trừ; hoặc dùng dung dịch chuẩn độ là
dung dịch bromid, phương pháp thừa trừ. Các phương pháp trên đều có
chung nhược điểm như độ nhạy kém, và không đặc hiệu với thành phần
hoạt chất, phương pháp gặp phải sai số nhất định khi có một số tá dược
chất chống oxy hóa trong thuốc tiêm [12], [13], [18].
Một số tài liệu công bố phương pháp định lượng thành phần LCystein dạng nguyên liệu cũng như dạng chế phẩm bằng phương pháp
HPLC detetor huỳnh quang; sử dụng bộ Kit tạo dẫn xuất huỳnh quang, tuy
nhiên phương pháp này gặp phải một số khó khăn như bộ Kit đắt tiền và
không sẵn có [23].
Hoạt chất Glycyrrhizin trong chế phẩm thuốc tiêm CGI được xây
dựng phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector
UV bước sóng 252 nm; hoặc detector PDA với bước sóng lấy pic là 252
nm [12].
Krähenbühl S, Hasler F, Krapf R đã tiến hành định lượng acid
Glycyrrhizin và các chất chuyển hóa của Acid Glycyrrhizin bằng phương
pháp LC-MS/MS, ở khoảng nồng độ thấp khoảng 1-2 µg/ml [22].
8
1.2 SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ (LC-MS)
1.2.1 Khái niệm
Sắc ký lỏng khối phổ là một kỹ thuật phân tích có sự kết hợp giữa
khả năng phân tách của hệ thống sắc ký (HPLC) với khả năng phân tích
khối của hệ thống khối phổ.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một hệ thống có vai trò tách các chất
dựa trên sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng [4].
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của
ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu
dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một
điện trường hoặc một từ trường nhất định [18], [13].
1.2.2 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba
Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ loại tứ cực chập ba (Triple
Quadrupole) hay còn gọi là khối phổ hai lần (MS/MS) được sử dụng nhiều
trong công tác nghiên cứu, kiểm tra chất lượng thuốc, nhất là định lượng
thuốc trong dịch sinh học, nghiên cứu tương đương sinh học, nghiên cứu
định lượng các thuốc có thành phần phức tạp vì thiết bị có độ nhạy, độ
chọn lọc cao.
Trong các kiểu hình thành ion, kỹ thuật phun điện tử ESI
(Electrospray Ionazition – ESI) được sử dụng nhiều hơn cả. Trong nghiên
cứu này chúng tôi cũng sử dụng kiểu ion hóa theo kỹ thuật ESI vì vậy trong
phần tổng quan này chúng tôi sẽ trình bày về hệ Triple Quadrupole với
nguồn Ion hóa kiểu ESI [18], [20].
Hình 1.4 – Sơ đồ cấu tạo các bộ phận của máy khối phổ.
9
Một máy khối phổ tứ cực chập ba gồm có các bộ phận chính sau:
Bộ phận nạp mẫu, đưa mẫu vào (Inlet);
Bộ nguồn ion hóa (ion source);
Bộ phận phân tích khối lần 1 (Q1): phân tích mảnh mẹ;
Bộ phận buồng va chạm (Collision cell);
Bộ phận phân tích khối lần 2 (Q2): phân tích mảnh con;
Bộ phận phát hiện ion (Detector);
Bộ phận ghi nhận và xử lý số liệu (data system).
Bộ phận nạp mẫu
Bộ phận nạp mẫu để chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion
hóa của thiết bị khối phổ. Do quá trình nạp mẫu từ áp suất thường (760 mm
Hg) vào buồng chân không (10-5 – 10-8 Torr) phải không được ngắt chân
không của bộ phận phân tích khối (mass analyzer) và bộ phận phát hiện
(detector) nên bộ phận nạp mẫu của LC-MS có khác biệt:
Đầu ra của LC là dòng dung môi, nếu đưa trực tiếp và toàn bộ dòng
dung môi vào phổ kế sẽ làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy và
vận hành của thiết bị. Mặt khác khi các ion có trong thành phần của dung
môi dễ dàng va chạm với các phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướng
di chuyển và bị bơm chân không hút ra ngoài. Do đó quá trình nạp mẫu từ
LC vào MS thường phải qua giao diện ghép nối phù hợp.
Một ghép nối LC-MS cần có các đặc tính: cho phép chuyển mẫu hiệu
quả và chính xác từ LC sang MS mà không phá hủy hay làm mất chất phân
tích, loại bớt dung môi rửa giải, giảm pha loãng mẫu.
10
Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)
Hình 1.5 – Sơ đồ cấu tạo ion dương bằng nguồn ESI
Trong ESI, tại đầu mao quản dưới ảnh hưởng của điện thế cao, sự hỗ
trợ của khí mang và nhiệt độ mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ
mang điện tích bề mặt. Điều kiện nhiệt độ trong buồng phun cao làm cho
dung môi trong các hạt sương bốc hơi khi đó mật độ điện tích tại các bề mặt
hạt sương gia tăng đến một giá trị tới hạn và tiếp tục phân chia thành các hạt
sương nhỏ hơn vì lực đẩy tĩnh điện lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá
trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ
những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này các ion phân tích được chuyển
thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi từ đó đi vào bộ phận phân tích khối.
Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra ngoài bởi bơm chân không
của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc và hội tụ bởi một
điện thế, khi đi ra khỏi buồng ion hóa các phân tử có tốc độ đạt cao nhất rồi
đi vào phần phân tích khối là một dòng tập trung và đồng nhất.
Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải biến thành chất điện ly,
tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào dung môi
sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch.
Kỹ thuật ion hóa kiểu phun điện tử được áp dụng để phân tích những
chất phân cực hoặc bán phân cực, các chất có trọng lượng phân tử lớn và
các chất kém bền với nhiệt.
11
Bộ phận phân tích khối kiểu tứ cực chập 3
Q3
Q1
Q2 (Collision cell)
Hình 1.6 – Sơ đồ cấu tạo bộ phân tích khối kiểu tứ cực chập ba
Hình 1.7 – Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực
Bộ phận phân tích khối gồm ba tứ cực Q1; Q2; Q3. Các tứ cực này
được cấu tạo gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau tạo thành
hai cặp điện cực.
Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào
từng cặp đối diện của tứ cực. Dưới tác động của dòng điện từ trường trong
lòng ống điện cực, các ion di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào số
khối. ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại.
Q1 sẽ tách các ion cần quan tâm bằng cách các ion có tỷ số m/z xác
định đã lựa chọn sẽ đi thẳng đến tứ cực thứ 2 (Q2), những ion khác bị dập
tắt do va chạm với thành của tứ cực ở các bản điện cực trái dấu.
Tứ cực thứ 2 (Q2) còn gọi là buồng va chạm (Collision cell), bên
trong chứa khí trơ (Argon) thường được thiết kế cong để tăng sự va chạm.
Các ion di chuyển từ tứ cực Q1 vào Q2 có vận tốc lớn va chạm với các
12
phân tử khí trơ trong Q2, lúc này năng lượng động học của ion biến thành
nội năng nên các ion bị vỡ ra từng mảng tạo thành các ion con bé hơn.
Tứ cực thứ 3 (Q3) có cấu tạo giống Q1, các ion mới được hình thành
trong Q2 sẽ được di chuyển tiếp đến Q3. Q3 sẽ phân tích tách và bắt giữ tín
hiệu của các ion con đặc trưng cần quan tâm của chất phân tích và đưa đến
bộ phận phát hiện (Detector).
Bộ phận phát hiện (detector)
Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion sẽ được đưa tới bộ
phận nhận tín hiệu, phát hiện ion. Bộ phận tín hiệu cho phép khối phổ tạo
ra một tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được
đưa đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ.
Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ
Full-scan: Khi thao tác với chế độ full-scan, đầu dò sẽ nhận được tất
cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt
quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân
tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN
thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.
Chế độ chọn lọc ion: (Selected Ion Monitoring SIM): Trong chế
độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một mảnh ion đặc trưng cho chất
cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của ion đã được lựa chọn
trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện
có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa
chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple
Reaction Monitoring): Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai
lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử
dụng là SRM và MRM.
SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò
để phát hiện.
13
MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi
lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật
ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion
mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất
là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần
quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
1.2.3 Ứng dụng
Phương pháp phân tích khối phổ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau của khoa học và công nghệ như: thực phẩm – đồ uống; môi
trường; độc chất học; tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật; dược phẩm …
Trong ngành dược một số ứng dụng cơ bản của kỹ thuật này:
Xác định khối lượng phân tử, khối lượng nguyên tử;
Xét đoán cấu trúc phân tử;
Kiểm nghiệm thuốc: định tính, định lượng, kiểm tra độ tinh khiết
nguyên liệu, xác định tạp chất liên quan…;
Nghiên cứu phát triển hợp chất mới;
Phân tích thuốc trong dịch sinh học: nghiên cứu dược động học, sinh
khả dụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị…;
Một số trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh đã được trang bị thiết bị
này như: Hà Nội, Thanh Hóa, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Huế… nhưng chưa
triển khai được nhièu để phục vụ công tác kiểm nghiệm.
+ Nghiên cứu xác định tạp chất liên quan là lĩnh vực thế mạnh của
thiết bị khi các tạp chất có nồng độ thấp, độ nhạy của các thiết bị HPLC
thông thường không đủ đáp ứng, đặc biệt khi không có chất chuẩn, vẫn có
thể định tính và xác định được dựa thư viện phổ của các chất đã được lưu
giữ trong Detector khối phổ.
+ Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng một số nhóm
hoạt chất không hấp thụ quang như: bán thành phẩm kháng sinh nhóm
14
Aminoglycosid, phục vụ sản xuất mà trước đây không thực hiện được bằng
các phương pháp khác.
+ Phân tích dư lượng một số dung môi tồn dư trong nguyên liệu làm
thuốc, theo quy định của GMP.
1.3 NỘI DUNG THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
1.3.1. Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu là khả năng phân biệt rõ chất cần phân tích khi các thành
phần khác có thể tồn tại trong mẫu thử. Thông thường gồm: các tạp chất,
sản phẩm phân hủy, chất nền.
Trong LC-MS, tính đặc hiệu được thể hiện khi kết quả thu được trên
sắc ký đồ mẫu thử cho thấy pic của chất cần phân tích được phân tách và
nhận diện rõ ràng. Tỷ lệ đáp ứng của mẫu trắng tại vị trí các pic của chất
phân tích không được vượt quá 2%.
1.3.2. Độ tuyến tính
Độ tuyến tính của một qui trình phân tích diễn tả đáp ứng phân tích
thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích
trong mẫu thử.
Độ tuyến tính được xác định bằng cách quan sát đồ thị đáp ứng giữa
nồng độ hoặc hàm lượng của chất phân tích với giá trị đo được.
Như vậy khoảng tuyến tính phải phủ toàn bộ khoảng xác định.
Đường chuẩn phải có dạng đồ thị: Y = ax + b
Yêu cầu:
- Số điểm đường chuẩn n ≥ 5
- Hệ số tương quan r ≥ 0,998
1.3.3. Độ đúng
Độ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn mức độ gần nhau
giữa giá trị trung bình của dãy kết quả thực nghiệm với giá trị thực của chất
phân tích có trong mẫu thử hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận.
15
Thường tiến hành ở 3 mức nồng độ nằm trong khoảng xác định của
phương pháp (80% - 100% và 120%), mỗi mức nồng độ tối thiểu 3 mẫu
hoặc 6 mẫu ở mức nồng độ 100%.
Yêu cầu:
- Định lượng: Thu hồi 98,0 – 102,0 %; RSD ≤ 2,0%;
(Tỉ lệ thu hồi: lượng tìm thấy/ lượng lí thuyết)
1.3.4. Độ chính xác
Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả mức độ gần nhau
(mức độ phân tán) giữa một dãy kết quả thu được của các mẫu thử được
chuẩn bị từ một mẫu đồng nhất trong điều kiện đã đề ra.
Độ chính xác chia làm 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và
độ tái lặp.
Độ lặp lại
Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của quy trình phân tích tiến hành
trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại
biểu thị độ chính xác trong định lượng.
Thường được tiến hành trên 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ 3
lần (suy ra từ độ đúng). Cũng có thể 6 lần ở nồng độ 100%.
Yêu cầu:
- Định lượng: RSD ≤ 2,0%
- Độ hòa tan: RSD ≤ 3,0%
Độ chính xác trung gian
Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong
cùng một phòng thí nghiệm, nhưng được thực hiện: các ngày khác nhau,
kiểm nghiệm viên khác nhau, và hóa chất khác lô sản xuất.
16
Yêu cầu:
- Định lượng: RSD ≤ 2,0%
- Độ hòa tan: RSD ≤ 4,0%
- Tạp chất: RSD ≤ 10 -15%.
Độ tái lặp
Độ tái lặp diễn tả độ chính xác giữa các phòng thí nghiệm (Phối hợp
nghiên cứu giữa các phòng thí nghiệm thường được áp dụng để tiêu chuẩn
hoá phương pháp).
1.3.5 Độ vững
Đánh giá ảnh hưởng của các thay đổi nhỏ trong quy trình phân tích
đến kết quả phân tích và độ ổn định của kết quả. Trong nghiên cứu này
chúng tôi đánh giá độ ổn định theo thời gian của hoạt chất trong điều kiện
phân tích.
17
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU – ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGUYÊN CỨU
- Chất chuẩn:
+ Chất chuẩn: Glycin; nguồn gốc Viện Kiểm nghiệm thuốc TƯ, hàm
lượng 99,87% (nguyên trạng); SKS: WS010814.
+ Chuẩn L-Cystein: chuẩn nhà sản xuất; hàm lượng 98,04% (nguyên
trạng); SKS: C1276.
+ Chuẩn Monoamoni Glycyrrhizinat: chuẩn Sigma Aldrich, Mỹ;
hàm lượng 80,0% (nguyên trạng); SKS: SLBBG1855V.
- Dung môi hóa chất:
+ Methanol (MeOH), acetonitril (MeCN), nước cất đạt tiêu chuẩn
tinh khiết dùng cho sắc ký lỏng khối phổ LC/MS.
+ Các dung môi hóa chất khác: cloroform; acid formic; acid acetic;
acid tricloacetic, amoni acetat đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích
(PA).
- Thiết bị dụng cụ:
+ Tất cả các thiết bị đều được hiệu chuẩn theo quy định của ISO/IEC
17025 : 2005; và GLP, bao gồm:
+ Hệ thống sắc ký lỏng UPLC – MS/MS, nguồn ion kiểu ESI, hãng
Waters Acquity H (UPLC-Class); Detector Xevo TQD (Waters), Mỹ;
+ Cân phân tích Mettler Toledo MS240S (d=0,1 mg);
+ Các dụng cụ thủy tinh của phòng thí nghiệm cấp A;
2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU
- Mẫu Placebo: là các mẫu tự tạo có chứa các thành phần của công
thức thuốc và không chứa hoạt chất tương ứng. Trong nghiên cứu này
chúng tôi sử dụng 04 mẫu placebo. Công thức các mẫu Placebo được trình
bày cụ thể trong các bảng: 2.1, 2.2, 2.3, 2.4.
18
Bảng 2.1. Thành phần công thức mẫu Placebo số 1
STT
Thành phần
1
Natri sulfit khan
2
Natri clorid
3
Amoni hydroxyd
4
Nước cất
Hàm lượng
20 mg
180 mg
Điều chỉnh pH = 7,0
Vừa đủ 20 ml
Bảng 2.2. Thành phần công thức mẫu Placebo số 2
STT
Thành phần
Hàm lượng
1
Glycin
2
L-Cystein
20 mg
3
Natri sulfit khan
20 mg
4
Natri clorid
5
Amoni hydroxyd
6
Nước cất
400 mg
180 mg
Điều chỉnh pH = 7,0
Vừa đủ 20 ml
Bảng 2.3. Thành phần công thức mẫu Placebo số 3
STT
Thành phần
Hàm lượng
1
Glycyrrhizin
40 mg
2
L-Cystein
20 mg
3
Natri sulfit khan
20 mg
4
Natri clorid
5
Amoni hydroxyd
6
Nước cất
180 mg
Điều chỉnh pH = 7,0
Vừa đủ 20 ml
19
Bảng 2.4. Thành phần công thức mẫu Placebo số 4
STT
Thành phần
1
Glycyrrhizin
2
Glycin
3
Natri sulfit khan
4
Natri clorid
5
Amoni hydroxyd
6
Nước cất
Hàm lượng
40 mg
400 mg
20 mg
180 mg
Điều chỉnh pH = 7,0
Vừa đủ 20 ml
- Mẫu thử: Thuốc tiêm Compound Glycyrrhizin Injection; nhà sản
xuất: Beijing Kawin Technology Share-Holding Co., Ltd. China; SKS:
20140906/077; ngày sản xuất: 24/09/2014; hạn dùng: 23/09/2017.
- Mẫu chuẩn: là các dung dịch chuẩn được pha với nồng độ thích hợp
trong pha động.
2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích
Xác định các điều kiện khối phổ phân tích Glycyrrhizin; Glycin; LCystein
Sử dụng hệ thống khối phổ LC-MS/MS với nguồn ion hóa kiểu ESI,
tiến hành thực nghiệm như sau:
+ Glycyrrhizin được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với
nồng độ 2 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ
20µl/phút;
20
+ Glycin được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồng
độ 20 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ
20µl/phút;
+ Cystein được hòa tan trong hỗn hợp MeOH: Nước (1:1) với nồng
độ 1 µg/ml và được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ với tốc độ
20µl/phút.
Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ với các nội dung sau:
Xác định các ion mẹ;
Tối ưu hóa các điều kiện ở nguồn ion hóa, bộ phận thấu kính hội tụ
để lượng ion mẹ đi vào hệ thống khối phổ nhiều nhất và ổn định nhất;
Xác định các mảnh ion con bền, ổn định và xác định năng lượng phân
mảnh tối ưu nhất để lượng ion con tạo thành nhiều nhất và ổn định nhất.
Khảo sát điều kiện sắc ký
Qua tham khảo tài liệu, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên các
cột C18 (150 x 2 mm; 1,8 µm) và cột C18; C8 (100 x 2 mm; 1,8 µm); trên
các hệ pha động gồm Acetonitril; dung dịch đệm amoniacetat 0,5 mM
pH=3,0; dung dịch acid formic 0,01%; dung dịch acid tricloacetic 0,01%
theo các tỷ lệ khác nhau.
Từ kết quả khảo sát có thể chọn hệ sắc ký thích hợp để tiến hành
định lượng đồng thời 3 hoạt chất trong thuốc tiêm CGI trên hệ thống
UPLC-MS/MS.
2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng như sau:
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Chuẩn gốc Cystein: cân 0,0110 g chuẩn Cystein, pha trong nước vừa
đủ 100 ml.
21
Dung dịch chuẩn Cystein làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch
chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 100 ml được dung dịch có
nồng độ: 1,078 µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Chuẩn gốc Monoamoni glycyrrhizinat: cân 0,0165 g chuẩn
Glycyrrhizin, pha trong nước vừa đủ 100 ml.
Dung dịch chuẩn Monoamoni glycyrrhizinat làm việc: Hút chính
xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50
ml. Được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Glycyrhizin tương ứng:
2,0µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Chuẩn gốc Glycin: cân 0,0209g chuẩn Glycin, pha trong nước vừa
đủ 100 ml.
Dung dịch chuẩn Glycin làm việc: Hút chính xác 5,0 ml dung dịch
chuẩn gốc trên pha loãng bằng pha động vừa đủ 50 ml được dung dịch có
nồng độ: 20,873µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Chuẩn bị mẫu thử:
Hút chính xác 1,0 ml chế phẩm thêm nước vừa đủ 100 ml.
Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên thêm pha động vừa đủ 50 ml.
Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Mẫu trắng: Có chứa các thành phần tá dược, không chứa các thành
phần chất phân tích. Chuẩn bị như mẫu thử.
Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phương
pháp phân tích của Asean [3].
Tính chọn lọc
Tiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 lần phân
tích mẫu placebo tương ứng với từng thành phần của thuốc và thành phần
chuẩn đơn lẻ. Tiến hành ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng của mẫu
trắng với mẫu chuẩn tại vị trí thơi gian lưu của chuẩn [3].
22
Khoảng nồng độ tuyến tính
Pha một dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp ban thành phần có nồng
độ khác nhau tương ứng 50%; 75%; 100%; 125%; 150% nồng độ định
lượng. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồ
đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ hoạt chất và diện tích píc đáp
ứng [3].
Độ chính xác
- Độ lặp lại
Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong
cùng một ngày, cùng một kiểm nghiệm viên, cùng thiết bị. Tính toán kết
quả và đánh giá độ lặp lại của phương pháp [3].
- Độ chính xác trung gian
Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong
cùng ngày hôm sau, với kiểm nghiệm viên khác, sử dụng cột phân tích
khác. Tính toán kết quả và đánh giá độ chính xác trung gian của phương
pháp bằng cách so sánh kết quả phân tích của hai kiểm nghiệm viên trong
hai ngày [3].
Độ đúng
Độ đúng của phương pháp được tiến hành bằng cách phân tích mẫu
tự tạo bằng cách thêm chuẩn vào mẫu placebo số 1 ở ba khoảng nồng độ
80%; 100% và 120% nồng độ định lượng. Mỗi nồng độ được tiến hành độc
lập 03 mẫu. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, tính toán kết
quả. Độ đúng được đánh giá dựa trên tỷ lệ thu hồi hoạt chất định lượng
được so với nồng độ thực của mẫu [3].
Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích
Mẫu thử được chuẩn bị trong phần thẩm định độ lặp lại của phương
pháp được giữ lại bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ phân tích lại. So
23
sánh với kết quả ban đầu để đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong điều
kiện phân tích [3].
2.3.3 Xử lý kết quả
Các số liệu về diện tích pic, thời gian lưu, mảnh khối của các chất
phân tích trên sắc ký đồ, phổ đồ với phần mềm Maslyx của máy UPLCMS/MS Waters Acquity H (UPLC-Class); Detector Xevo TQD (Waters).
Các số liệu phân tích được xử lý thống kê bằng phần mềmMicrosoft
Excel.
Công thức tính toán hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm:
X (%)
St
100%
C C 1000
Sc
HL 1000000
Trong đó:
+ St; Sc: diện tích pic của mẫu thử; mẫu chuẩn.
+ Cc: nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml).
+ HL: lượng hoạt chất có trong 1 ml chế phẩm (theo nhãn).
24
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ
Pha các dung dịch chuẩn Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong hỗn
hợp MeOH: nước (1:1) có nồng độ lần lượt như sau: 2 µg/ml; 20 µg/ml; 1
µg/ml.
Tiêm các dung dịch chuẩn vào hệ thống khối phổ cùng với dòng pha
động sắc ký (tốc độ 0,3 ml/phút). Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ một
lần, quét toàn dải (Full scan MS); xác định các mảnh ion mẹ (parent ion)
của các chất Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein.
Kết quả xác định được các ion mẹ có số khối như sau: Glycin m/z =
76,332 Da; Glycyrrhizin m/z = 840,363 Da; L-Cystein m/z = 121,832 Da;
ứng với cấu trúc nhận một proton.
Sau khi xác định được các mảnh ion mẹ, tiến hành tối ưu điều kiện
nguồn ion hóa: điện thế đầu cone (Cone voltage); năng lượng bắn phá để
tạo ra mảnh ion con cường độ tín hiệu cao và bền nhất.
Từ kết quả thực nhiệm chúng tôi đã xác định được như sau:
Bảng 3.1 Các thông số khối phổ
Khối
lượng
phân
tử
Năng
Mảnh
Cone
Mảnh lượng
ion mẹ Voltage ion con bắn
phá
Glycin
75,07
76,32
16
29,83
22
ESI+
Glycyrrhizin
839,36
840,46
26
453,25
32
ESI+
Cystein
120,8
121,83
24
58,88
20
ESI+
Thành phần
25
Chế
độ
ion
Hình 3.1 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycin (m/z = 76,3) tạo
ra mảnh con (m/z = 29,8).
Hình 3.2 Phổ khối khi phân mảnh Glycin-H+ (m/z = 76,3).
26
Hình 3.3 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Glycyrrhizin
(m/z = 840,4) tạo ra mảnh con (m/z = 453,3).
Hình 3.4 Phổ khối khi phân mảnh Glycyrrhizin-H+ (m/z = 840,4).
27
Hình 3.5 Năng lượng tối ưu khi phân mảnh Cystein
(m/z = 121,8) tạo ra mảnh con (m/z = 58,9).
Hình 3.6 Phổ khối khi phân mảnh Cystein-H+ (m/z = 121,83).
28
Thực nghiệm cho thấy khi thực hiện chế độ Intellistart (chế độ tune
tự động) phân tử Glycin bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 29,8 Da;
Glycyrrhizin bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 453,3 Da; L-Cystein
bị bắn phá thành mảnh ion con có m/z = 29,8 Da là những mảnh ion con có
cường độ tín hiệu cao, bền vững và tín hiệu ổn định nhất.
3.1.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký phân tích đồng thời các thành phần
của thuốc tiêm CGI
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong pha động có nồng độ:
+ Glycyrrhizin: 2 µg/ml;
+ Glycin: 20 µg/ml;
+ Cystein: 1 µg/ml.
Cố định pha tĩnh là cột C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); Qua nghiên cứu
các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành khảo sát với các pha động:
+ Pha động 1: Methanol : dung dịch acid formic 0,1% (90:10);
+ Pha động 2: Acetonitril : dung dịch acid formic 0,1% (90:10);
+ Pha động 3: Methanol : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10);
+ Pha động 4: Acetonitril : dung dịch acid tricloacetic 0,01% (90 : 10);
+ Pha động 5: Methanol : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM pH=3,0
(90 : 10);
+ Pha động 6: Acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM
pH=3,0 (90 : 10);
Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy:
Đối với pha động số 1; số 2 có chứa thành phần acid formic thành
phần Cystein không ổn định trong pha động, bị phân hủy.
Đối với pha động số 3; số 4 có chứa thành phần acid tricloacetic ở
chế độ khối phổ của thành phần Cystein đường nền đáp ứng rất cao 105 vì
acid tricloacetic gây nhiễu đường nền ở mảnh con 58,9 Da; dẫn đến độ
nhạy thấp không đáp ứng yêu cầu.
29
Đối với pha động số 5; số 6 các thành phần hoạt chất ổn định trong pha
động, đường nền ổn định và giá trị S/N cao, phù hợp cho phép phân tích.
So sánh giữa pha động số 5 và số 6 chúng tôi thấy pha động số 6 các
pic cân đối và ít bị kéo chân hơn. Từ kết quả khảo sát sơ bộ chúng tôi chọn
pha động số 6 với thành phần acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5
mM pH=3,0.
Tiến hành khảo sát sâu hơn bằng cách thay đổi tỷ lệ thành phần của
pha động số 6. Nếu tăng thành phần acetonitril lên pic Glycyrrhizin sẽ ra
sớm hơn, thời gian lưu của Glycin và Cystein gần như không ảnh hưởng. Ở
tỷ lệ pha động acetonitril : dung dịch đệm amoni actetat 5mM pH=3,0 (35 :
65), các pic tách nhau rõ ràng, thời gian lưu của Glycyrrhizin 2,2 phút.
Giữ nguyên thành phần pha động thay đổi tốc độ dòng, khi tốc độ
dòng 0,2 ml/phút, pic Glycyrrhizin bị kéo chân; khi tốc độ dòng tăng lên
0,4 ml/phút pic Glycyrrhizin ra sớm hơn xong áp suất hệ thống tăng cao, vì
vậy chọn tốc độ dòng 0,3 ml/phút là phù hợp và đáp ứng yêu cầu.
Giữ nguyên tốc độ và thành phần pha động, khảo sát trên cột dài hơn
C18 (150 x 2 mm; 1,8 µm) pic Glycyrrhizin bị lưu giữ rất lâu tR = 7 – 8
phút, phải chạy chế độ Gradien tăng lượng acetonitril pic mới rửa giải ở tR
khoảng 4 - 6 phút.
Từ các kết quả khảo sát chúng tôi quyết định sử dụng hệ sắc ký khối
phổ với các điều kiện như sau để định lượng đồng thời các thành phần
trong thuốc tiêm CGI:
Điều kiện sắc ký.
Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm);
Pha động: Hỗn hợp acetonitril : dung dịch đệm amoni acetat 5 mM
pH = 3,0 (35:65);
Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút;
Thể tích tiêm: 10 µl;
30
Điều kiện khối phổ.
ion hóa bằng phun điện tử ion dương (ESI+);
Chọn chế độ phát hiện MRM với các thông số sau:
Bảng 3.2 Các thông số khối phổ định lượng đồng thời ba thành phần
hoạt chất trong mẫu thuốc tiêm CGI.
Mảnh mẹ
m/z
Cone
Voltage
(V)
Mảnh
con
m/z
Năng
lượng
bắn phá
(V)
Chế độ
ion hóa
Glycin
76,32
16
29,83
22
ESI+
Glycyrrhizin
840,46
26
453,25
32
ESI+
Cystein
121,83
24
58,88
20
ESI+
Thành phần
Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha động có nồng độ:
+ Glycyrrhizin 2 µg/ml;
+ Glycin 20 µg/ml;
+ Cystein 1 µg/ml.
Mẫu thử được pha trong pha động để có nồng độ các thành phần
tương đương với mẫu chuẩn.
3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Sau khi đã xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời các
thành phần của thuốc tiêm CGI, tiến hành thẩm định phương pháp phân
tích theo cách đã được trình bày ở mục 2.3.2 nhằm khẳng định phương
pháp phân tích đã xây dựng là tin cậy và phù hợp mục đích sử dụng.
3.2.1 Độ chọn lọc của phương pháp
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn đơn của từng hoạt chất pha trong pha
động để xác định thời gian lưu ứng với từng chất.
31
Phân tích các mẫu placebo tương ứng, các mẫu chuẩn tương ứng pha
trong pha động mục 2.3.2 theo phương pháp đã xây dựng. So sánh diện tích
pic thu được của từng chất trong mẫu chuẩn với diện tích pic thu được tại
thời gian lưu tương ứng của chất chuẩn trong mẫu placebo tương ứng.
Các sắc ký đồ được trình bày ở các hình 3.7; 3.8; 3.9. Kết quả tỷ lệ
đáp ứng pic được trình bày ở bảng 3.3.
Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycin và mẫu trắng.
Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Glycyrrhizin và mẫu trắng.
32
Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn L-Cystein và mẫu trắng.
Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ chọn lọc của phương pháp
Glycin
Glycyrrhizin
Cystein
TT
A
B
A
B
A
B
1
1622,728
10,518 128302,398
138,536 20181,395
6,212
2
1655,161
17,692 127433,203
97,439
20158,520
5,165
3
1725,132
12,321 129295,164
69,419
20001,854
7,113
4
1653,656
3,875
127898,143
60,057
20697,324
2,157
5
1722,254
2,090
128099,343
51,195
20562,162
5,879
6
1672,872
3,636
128861,127
54,439
20661,182
4,098
TB
1675,301
8,355
128314,896
78,514
20377,073
5,104
Tỷ lệ đáp ứng píc (%)
0,5%
-
0,06
-
0,03
A: Đáp ứng pic chất phân tích của mẫu chuẩn
B: Đáp ứng pic tại tR tương ứng với pic chất phân tích của mẫu trắng
Kết quả thực nghiệm cho thấy:
33
+ Trên sắc ký đồ mẫu trắng (hình 3.7; 3.8; 3.9) tại các thời gian lưu
tương ứng của chất phân tích không xuất hiện các pic có: mảnh phổ m/z =
76,33 -> 29,83 (đặc trưng cho Glycin); mảnh phổ m/z = 840,363 ->
453,338 (đặc trưng cho Glycyrrhizin); mảnh phổ m/z = 121,832 -> 58,88
(đặc trưng cho Cystein).
+ Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn (hình 3.7; 3.8; 3.9) các pic chất chuẩn
xuất hiện cân đối.
+ Tỷ lệ đáp ứng pic mẫu trắng so với mẫu chuẩn tại thời gian lưu
tương ứng lần lượt: Glycin 0,5%; Glycyrrhizin 0,06%; Cystein là 0,03%
(không quá 2%).
Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu
về độ chọn lọc để phân tích đồng thời các thành phần hoạt chất trong thuốc
tiêm CGI.
3.2.2 Độ tuyến tính của phương pháp
Từ dung dịch chuẩn gốc Glycin; Glycyrrhizin; L-Cystein mục 2.3.2
tiến hành pha loãng bằng pha động được một dãy các dung dịch chuẩn có
nồng độ khác nhau.
Tiến hành phân tích theo quy trình. Ghi lại sắc ký đồ và đánh giá sự
phụ thuộc tuyến tính của nồng độ và diện tích pic. Kết quả được trình bày ở
bảng 3.4.
34
Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của phương pháp
STT
% so với
nồng độ
định
lượng
Nồng độ
(µg/ml)
Diện tích pic
đáp ứng
Nồng độ
(µg/ml)
Diện tích pic
đáp ứng
Nồng độ
(µg/ml)
Diện tích pic
đáp ứng
1
50
10,436
1029,237
1,00
63987,199
0,539
10100,721
2
75
15,655
1293,753
1,50
96226,798
0,808
15572,046
3
100
20,873
1725,132
2,00
128302,398
1,078
20181,395
4
125
26,091
2155,562
2,50
160433,997
1,347
25226,743
5
150
31,309
2589,978
3,00
193009,970
1,617
30309,093
Glycin
Glycyrrizin
L-Cystein
Phương trình hồi
quy:
y = 80,17 x + 65,42
y = 64450,55 x – 509,02
y = 18579,21x + 253,33
Hệ số tương quan
tuyến tính
r = 0,9964
r = 1,000
r = 0,9997
35
Kết quả thực nghiệm cho thấy:
+ Khoảng tuyến tính của thành phần Glycin (bảng 3.6) từ: 10,4 –
31,3 µg/ml (tương đương từ 50% đến 150% nồng độ định lượng); với hệ số
tương quan tuyến tính r = 0,9964 và hệ số chắn b = 65,41(tương đương
3,79% đáp ứng tại nồng độ 100%) nằm trong khoảng từ -2,0 đến +5,0%.
+ Khoảng tuyến tính của thành phần Glycyrrhizin (bảng 3.6) từ: 1,0
– 3,0 µg/ml (tương đương từ 50% đến 150% nồng độ định lượng); với hệ
số tương quan tuyến tính r = 1,000 và hệ số chắn b = 509,02 (tương đương
0,4% đáp ứng tại nồng độ 100%) nằm trong khoảng từ -2,0 đến +5,0%.
+ Khoảng tuyến tính của thành phần L-Cystein (bảng 3.6) từ: 0,54 –
1,62 µg/ml (tương đương từ 50% đến 150% nồng độ định lượng); với hệ số
tương quan tuyến tính r = 0,9997 và hệ số chắn b = 253,32 (tương đương
1,2% đáp ứng tại nồng độ 100%) nằm trong khoảng từ -2,0 đến +5,0%.
Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu
về độ tuyến tính để phân tích các thành phần hoạt chất trong thuốc tiêm
CGI.
3.2.3 Độ chính xác
Tiến hành thẩm định 2 tiêu chí là độ lặp lại và độ chính xác trung
gian.
Độ lặp lại
Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích đã xây dựng. Tiến
hành phân tích độc lập mẫu thử 6 lần.
Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp như sau
Chuẩn gốc Cystein: cân 0,0110 g chuẩn Cystein, pha trong nước vừa
đủ 100 ml.
36
Chuẩn gốc Glycyrrhizin: cân 0,0125 g chuẩn Glycyrrhizin, pha
trong nước vừa đủ 100 ml.
Chuẩn gốc Glycin: cân 0,0209g chuẩn Glycin, pha trong nước vừa
đủ 100 ml.
Dung dịch chuẩn làm việc: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn
gốc Cystein; 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc Glycyrrhizin; và 10,0 ml dung
dịch chuẩn gốc Glycin vào bình định mức 100 ml, thêm pha động vừa đủ.
Lọc qua màng lọc 0,2 µm. Được dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ
tương ứng: Cystein1,08 µg/ml; Glycyrrhizin: 2,00 µg/ml; Glycin:
20,87µg/ml.
Chuẩn bị mẫu thử
Hút chính xác 1,0 ml chế phẩm thêm nước vừa đủ 100 ml.
Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên thêm pha động vừa đủ 50 ml.
Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
37
Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp
Glycin
Glycyrrhizin
L-Cystein
STT
Diện tích
pic
Hàm lượng %
so nhãn
Diện tích
pic
Hàm lượng %
so nhãn
Diện tích
pic
Hàm lượng % so
nhãn
Chuẩn
1675
-
133343
-
20181
-
1
1656
103,18
147800
108,52
18909
98,96
2
1599
99,63
147725
108,47
18933
99,08
3
1609
100,25
148405
108,96
18704
97,88
4
1649
102,75
148829
109,28
18999
99,43
5
1598
99,57
147836
108,55
18740
98,07
6
1645
102,50
147749
108,48
18678
97,75
Trung bình:
101,31
108,71
98,53
RSD (%):
1,65
0,31
0,72
38
Kết quả thực nghiệm cho thấy:
+ Định lượng lặp lại 6 lần độc lập đối với mẫu thử trong cùng một
ngày với cùng một kiểm nghiệm viên, tiến hành trong các điều kiện thử
nghiệm hoàn toàn giống nhau cho thấy các thành phần hoạt chất trong
thuốc CGI có độ lặp lại đáp ứng yêu cầu đặt ra:
+ Glycin: RSD = 1,65% < 2%;
+ Glycyrrhizin: RSD = 0,31% < 2%;
+ L-Cystein: RSD =0,72% < 2%;
Độ chính xác trung gian
Để đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp phân tích đã
xây dựng. Tiến hành phân tích độc lập mẫu thử 6 lần với kiểm nghiệm viên
khác, ngày phân tích khác.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
39
Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp
Glycin
STT
Diện tích pic
Glycyrrhizin
Hàm lượng %
so nhãn
Diện tích
pic
Hàm lượng
% so nhãn
132335
L-Cystein
Diện tích
pic
Hàm lượng % so
nhãn
Chuẩn
1689
20891
1
1599
98,80
155426
99,23
15652
98,80
2
1604
99,11
156273
99,78
15202
95,96
3
1628
100,60
156227
99,75
15658
98,84
4
1594
98,49
155101
99,03
15606
98,51
5
1589
98,19
156335
99,81
15652
98,80
6
1618
99,98
155303
99,16
15684
99,00
Trung bình:
99,20
99,46
98,32
RSD (%):
0,93
0,36
1,19
Trung bình (n = 12)
100,25
98,99
98,42
RSD (n = 12)
1,69
0,73
0,94
40
Kết quả thực nghiệm cho thấy:
+ Định lượng lặp lại 12 lần độc lập đối với mẫu thử trong hai ngày
khác nhau với hai kiểm nghiệm viên, tiến hành trên hai cột phân tích khác
nhau thấy các thành phần hoạt chất trong thuốc CGI có độ chính xác trung
gian đáp ứng yêu cầu đặt ra:
+ Glycin: RSD = 1,69% < 2%;
+ Glycyrrhizin: RSD = 0,73% < 2%;
+ L-Cystein: RSD = 0,94% < 2%;
3.2.4 Độ đúng
Độ đúng được đánh giá bằng cách thêm chuẩn vào mẫu Placebo số 1
sao cho nồng độ hoạt chất tương đương 80%; 100%; 120% nồng độ định
lượng, rồi tiến hành định lượng theo phương pháp đã xây dựng.
Chuẩn bị mẫu thử nghiệm:
Mẫu 80%: Cân chính xác 320,0 mg Glycin; 32,0 mg Glycyrhizin;
16,0 mg Cystein hòa tan trong 20 ml mẫu placebo.
Mẫu 100%: Cân chính xác 400,0 mg Glycin; 40,0 mg Glycyrhizin;
20,0 mg Cystein hòa tan trong 20 ml mẫu placebo.
Mẫu 120%: Cân chính xác 480,0 mg Glycin; 48,0 mg Glycyrhizin;
24,0mg Cystein hòa tan trong 20 ml mẫu placebo.
Xử lý mẫu như hướng dẫn trong quy trình phân tích đã quy định, tiến
hành phân tích. Đánh giá độ đúng thông qua tỷ lệ thu hồi hoạt chất. Mỗi
nồng độ tiến hành độc lập ba lần.
Kết quả được trình bày trong các bảng: 3.7; 3.8; 3.9.
41
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng
đối với Glycin
STT
Mẫu
Lượng hoạt
Lượng hoạt
chất thêm vào Diện tích pic chất tìm lại
(g)
(g)
Tỷ lệ thu
hồi (%)
1
Chuẩn
2
80%(1)
0,3210
1296
0,3162
98,52
3
80%(2)
0,3192
1292
0,3117
98,76
4
80%(3)
0,3205
1328
0,3239
101,07
5
100%(1)
0,4011
1615
0,3939
98,21
6
100%(2)
0,4054
1642
0,4007
98,84
7
100%(3)
0,4095
1677
0,4091
99,90
8
120%(1)
0,4896
1989
0,4852
99,10
9
120%(2)
0,4876
1989
0,4852
99,50
10
120%(3)
0,4856
1965
0,4793
98,71
1689
Trung bình
98,18
RSD (%):
0,88
42
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng
đối với Glycyrrhizin
STT
Mẫu
Lượng hoạt
chất thêm vào Diện tích pic
(g)
Lượng
hoạt chất
tìm lại (g)
Tỷ lệ thu
hồi (%)
1
Chuẩn
132335
2
80%(1)
0,0321
124340
0,0321
100,11
3
80%(2)
0,0322
123347
0,0319
99,00
4
80%(3)
0,0319
124330
0,0321
100,72
5
100%(1)
0,0410
156578
0,0405
98,70
6
100%(2)
0,0411
156067
0,0403
98,13
7
100%(3)
0,0409
155411
0,0402
98,20
8
120%(1)
0,0481
187665
0,0485
100,83
9
120%(2)
0,0479
188664
0,0488
101,79
10
120%(3)
0,0469
178933
0,0462
98,60
Trung bình
99,56
RSD (%):
1,33
43
Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng
đối với L-Cystein
STT
Mẫu
Lượng hoạt
chất thêm vào Diện tích pic
(g)
Lượng
hoạt chất
tìm lại (g)
Tỷ lệ thu
hồi (%)
1
Chuẩn
20891
2
80%(1)
0,0167
12754
0,0163
98,34
3
80%(2)
0,0164
12533
0,0161
98,40
4
80%(3)
0,0162
12509
0,0161
99,43
5
100%(1)
0,0202
15681
0,0202
99,96
6
100%(2)
0,0211
16349
0,0211
99,77
7
100%(3)
0,0214
16387
0,0211
98,60
8
120%(1)
0,0241
18614
0,0240
99,45
9
120%(2)
0,0242
18609
0,0240
99,01
10
120%(3)
0,0244
18860
0,0243
99,53
Trung bình
99,17
RSD (%):
0,61
Kết quả thực nghiệm cho thấy cả ba khoảng nồng độ 80%; 100%;
120% tỷ lệ thu hồi đối với từng thành phần như sau:
Đối với thành phần Glycin: trung bình: 98,18%; RSD = 0,88%;
Đối với thành phần Glycyrrhizin: trung bình: 99,56%; RSD = 1,33%;
Đối với thành phần L-Cystein: trung bình: 99,17%; RSD = 0,61%;
Từ kết quả thẩm định cho thấy ở cả ba khoảng nồng độ, tỷ lệ thu hồi
trung bình đạt từ 98,18% đến 99,56%, các giá trị RSD đều nhỏ hơn 2%. Do
đó phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng yêu cầu dùng cho phép thử
định lượng.
44
3.2.5 Độ ổn định của dược chất ở điều kiện phân tích
Mẫu thử được chuẩn bị trong phần đánh giá độ lặp lại của phương
pháp được giữ lại bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng và phân tích sau 24
giờ, so sánh với kết quả định lượng ban đầu, đánh giá sự ổn định của dược
chất trong điều kiện thí nghiệm.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của dược chất
trong điều kiện thí nghiệm.
Hoạt
Hàm lượng Glycin
chất
so nhãn (%)
Hàm lượng
Glycyrrhizin so
nhãn (%)
Hàm lượng
L-Cystein so nhãn
(%)
Lần 1
Sau 24h
Lần 1
Sau 24h
Lần 1
Sau 24h
1
103,18
101,89
108,52
105,09
98,96
100,02
2
99,63
100,07
108,47
106,91
99,08
98,05
3
100,25
99,87
108,96
108,92
97,88
98,09
4
102,75
99,93
109,28
109,01
99,43
100,06
5
99,57
100,02
108,55
109,45
98,07
98,83
6
102,50
101,23
108,48
107,63
97,75
98,26
Trung bình
101,31
100,50
108,71
107,84
98,53
98,89
1,67
0,85
0,33
1,65
0,71
0,94
STT
SD.
T-test
T table
1,25
1,52
0,68
2,57 (df=5; p = 0,05; 2 đuôi)
Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy, nồng độ hoạt chất trong mẫu phân tích
đã chuẩn bị trong điều kiện thí nghiệm bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng
sau 24 giờ so với kết quả định lượng ngay sau khi chuẩn bị mẫu khác nhau
không có ý nghĩa thống kê với mức tin cậy 95%. Như vậy mẫu phân tích ổn
định trong điều kiện thí nghiệm trong vòng 24 giờ đáp ứng yêu cầu cho
việc phân tích mẫu.
45
Chương 4. BÀN LUẬN
Theo thống kê mới nhất hội gan mật, hiện nay Việt Nam có khoảng
20 triệu người nhiễm virus viêm gan; khoảng 12-16 triệu người nhiễm virus
viêm gan B; 4,5 triệu người nhiễm virus viêm gan C.
Các nghiên cứu khoa học cho thấy virus viêm gan có thể gây bệnh
cho mọi lứa tuổi, không phân biệt giới tính, khả năng lây lan cũng không có
giới hạn, trong đó nguy hiểm nhất là virus viêm gan B và C. Hai loại virus
này thường có trong máu người bệnh, lây chủ yếu qua đường tiêm chích,
truyền máu, giao hợp, từ mẹ sang con lúc sinh nở.
Hiện nay, khoảng 5-10 % những người bị nhiễm virus viêm gan B,
khoảng 20 % những người nhiễm virus viêm gan C có nguy cơ biến chứng
sang xơ gan [6].
Các thuốc thuộc nhóm bệnh này chủ yếu gồm các acid amin như
Arginin, L-Ornithin aspartate, Biphenyl-dimethyl-Dicarboxylate
Chế phẩm thuốc CGI (Compound Glycyrrhizin Injection) do Công ty
TNHH xuất nhập khẩu y tế Delta phân phối có thành phần Glycyrrhizin 40
mg; L-Cystein 20 mg; Glycin 400 mg trong 20 ml có tác dụng chống viêm
và ức chế sự nhân lên của virus. Thuốc được chỉ định trong các trường hợp:
viêm gan mạn tính, cải thiện rối loạn chức năng gan; hỗ trợ điều trị eczema,
viêm da và nổi mày đay.
Tại Nhật Bản thuốc tiêm Minophagen của hãng Eisai với thành phần
tương tự với chỉ định điều trị viêm gan do virus viêm gan C. Thuốc có
được bán tại các quốc gia trên thế giới như: Singapore, Philippin, Hồng
Kông, Malaysia, Thái Lan, Việt Nam, Myanmar, Căm phu chia, Lào,
Brunei, Úc, các nước Trung Đông: (Jordan, Ả rập xê út, Yemen), Nga.
Trong nước nhu cầu về thuốc trên là rất lớn, do vậy các công ty sản
xuất dược phẩm trong nước cũng quan tâm đầu tư nghiên cứu để đăng ký
sản xuất thuốc trên. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu này
dựa trên các tài liệu tham khảo, các trang thiết bị hiện có tại phòng thí
nghiệm nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng thuốc và tiến tới có
46
thể chuyển giao cho các công ty đăng ký sản xuất thuốc cũng như áp dụng
kiểm tra chất lượng thuốc lưu hành trên thị trường. Chúng tôi đã xây dựng
được phương pháp định tính, định lượng đồng thời các hoạt chất có mặt
trong thuốc bằng phương pháp LC-MS/MS. Phương pháp được thẩm định
đầy đủ, theo quy định của Bộ Y tế đáp ứng yêu cầu của một phương pháp
dùng kiểm tra chất lượng thuốc.
Phương pháp UPLC-MS/MS là một trong những kỹ thuật phân tích
hiện đại vào hạng bậc nhất hiện nay tại Việt Nam. Phương pháp có thời
gian phân tích ngắn, tiết kiệm dung môi hóa chất và góp phần bảo vệ môi
trường. Độ nhạy phương pháp cao, có thể phát hiện và định tính, định
lượng được những hợp chất có nồng độ ppb (dạng vết) trong các nền mẫu
phức tạp. Đặc biệt thiết bị có khả năng phát hiện được sự có mặt của hoạt
chất không phụ thuộc vào đặc tính phân tử của chúng (có hấp thụ UV hay
không), khi được tích hợp ngân hàng phổ thiết bị có thể định tính chúng
không cần dùng chất đối chiếu, điều này giải quyết được khó khăn của các
phòng thí nghiệm Việt Nam hiện nay.
Tuy nhiên bên cạnh những mặt mạnh kỹ thuật UPLC-MS/MS cũng
có những hạn chế nhất định như: mức độ phổ biến của thiết bị hiện nay
chưa nhiều, giá thành thiết bị khá đắt.
Đối với Trung tâm Kiểm nghiệm Thanh Hóa là một đơn vị kiểm
nghiệm tuyến tỉnh đã đạt hai tiêu chuẩn GLP và ISO/IEC 17025:2005,
được trang bị thiết bị UPLC-MS/MS là một kỹ thuật cao, đòi hỏi kiểm
nghiệm viên phải có tay nghề vững, được đào tạo cơ bản và liên tục.
Thiết bị có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích khác
nhau như: thuốc, thực phẩm, môi trường… đã mở ra nhiều cơ hội phát triển
cho đơn vị.
So sánh với các phương pháp định tính định lượng các hoạt chất của
thuốc tiêm CGI nói trên, phương pháp chúng tôi xây dựa trên kỹ thuật
UPLC-MS/MS có nhiều ưu điểm như: độ nhạy cao, có khả năng định
lượng đồng thời các hoạt chất trong mẫu và thời gian phân tích ngắn.
Từ quá trình thực nghiệm chúng tôi có một số bàn luận như sau:
47
4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Phương pháp UPLC-MS/MS mới được đưa vào ứng dụng tại Việt
Nam với những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc và độ đặc hiệu.
Chính vì vậy phương pháp được ứng dụng ngày càng nhiều trong các
nghiên cứu như: định lượng thuốc và các chất chuyển hóa trong dịch sinh
học, theo dõi quá trình điều trị, nghiên cứu sinh dược học, đánh giá sinh
khả dụng, tương đương sinh học của thuốc.
Thuốc tiêm CGI trong 20 ml dung dịch chứa: Glycyrrhizin 40mg;
Glycin 400mg; L-Cystein 20 mg. Trên thế giới đã có nhiều tác giả công bố
phương pháp định lượng riêng lẻ từng thành phần của thuốc.
Đối với thành phần glycyrrhizin là một hoạt chất chiết từ cây cam
thảo có vị ngọt có tính chất của saponin. Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng
phương pháp định lượng glycyrrhizin bằng phương pháp HLPC với
detector UV-VIS [13]. Theo chuyên luận của Dược điển Châu Âu EP 5.0
xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất monoamoni glycyrhinat bằng
phương pháp chuẩn độ môi trường khan với mức chỉ tiêu chất lượng yêu
cầu từ 98,0% đến 102,0%, cũng trong tiêu chuẩn này quy định hàm lượng
tạp chất liên quan không được quá 17%. Điều này cho thấy phương pháp
định lượng hoạt chất mà EP 5.0 xây dựng không đảm bảo độ đặc hiệu dẫn
đến mâu thuẫn giữa hai chỉ tiêu chất lượng.
Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng Glycin bằng
phương pháp chuẩn độ trung hòa, phương pháp dùng formol để định lượng acid
amin. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản xong không đặc hiệu [13].
L-cystein là một acid amin có chứa nhóm -SH là nhóm mang tính
khử, Tiêu chuẩn cơ sở xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất này
bằng phương pháp chuẩn độ Bromid. Phương pháp này tiến hành dễ dàng,
48
đơn giản xong độ đặc hiệu không cao, có thể định lượng nhầm một số
thành phần khác có mặt trong công thức hoặc khi hoạt chất đã bị biến đổi
nhưng vẫn mang tính khử.
Hai thành phần acid amin trong công thức là glycin; L-cystein là
những chất không hấp thụ tia UV nên việc định lượng chúng trong các
thuốc gặp nhiều khó khăn, thông thường để định lượng các hoạt chất này
bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC người ta phải tạo dẫn chất của chúng
và sử dụng các detector huỳnh quang, hoặc detector UV. Có hai phương
pháp để tạo dẫn chất đó là: tạo dẫn chất trước cột, phương pháp này có độ
lặp lại và ổn định không cao; tạo dẫn chất sau cột phương pháp này ổn định
hơn xong lại cần thêm thiết bị phụ kiện và thuốc thử dùng cũng đắt tiền.
Với phương pháp HPLC thông thường để định lượng đồng thời hai
thành phần Glycin và L-Cystein phải dùng cột chuyên dùng để phân tích
các acid amin xong khả năng tách Glycin và L-cystein ra khỏi nhau là rất
khó, hai pic khó đạt yêu cầu về độ phân giải.
Với hệ thống UPLC chịu được áp suất cao, chúng tôi đã sử dụng cột
phân tích có khả năng phân tích tốt, cỡ hạt nhồi bé 1,8 µm xong hai pic
Glycin và L-Cystein vẫn không tách khỏi nhau, thời gian lưu trùng nhau
hoàn toàn 0,41 phút. Với sự hỗ trợ của detector khối phổ, chọn chế độ
MRM (Multi Reaction Monitoring) tín hiệu của pic Glycin và L-Cystein
được tách riêng và ghi thành hai kênh khác nhau nên vẫn có thể định lượng
riêng từng thành phần cho dù chúng không tách khỏi nhau khi đi qua hệ
thống sắc ký. Như vậy với phương pháp UPLC-MS/MS đã xây dựng có thể
tiến hành phân tích đồng thời, trực tiếp ba chất so với các điều kiện của các
tài liệu đã công bố khác rút ngắn thời gian phân tích, dơn giản hóa khâu
chuẩn bị mẫu.
49
Chúng tôi đã xây dựng được phương pháp LC-MS/MS dùng để định
tính và định lượng các thành phần Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong
thuốc tiêm CGI. Phương pháp xây dựng có độ tuyến tính rộng (từ 50% đến
150% nồng độ định lượng), thời gian phân tích ngăn, chi phí về dung môi
hóa chất thấp phù hợp về mặt kinh tế cho sản xuất, và góp phần bảo vệ môi
trường.
Phương pháp phân tích mà chúng tôi đã xây dựng việc chuẩn bị mẫu
đơn giản. Chúng tôi đã khảo sát và tìm được một hệ pha động đảm bảo tách
tốt các chất trong mẫu phân tích, các pic xuất hiện cân đối. Các thành phần
trong mẫu phân tích ổn định trong pha động và trong dung môi pha mẫu.
Kết quả từ quá trình thực nghiệm cho thấy: chúng tôi đã tiến hành
khảo sát pha mẫu trong một số loại pha động để xác định các điều kiện sắc
ký và các thông số của khối phổ xong rất khó để ổn định được cả ba thành
phần hoạt chất trong thuốc, nhất là thành phần L-Cystein rất nhạy cảm.
4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Phương pháp phân tích định tính, định lượng đồng thời các thành
phần hoạt chất: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong thuốc tiêm CGI đã
được thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích
của Asean. Các chỉ tiêu đã được thẩm định bao gồm: độ chọn lọc; độ tuyến
tính; độ lặp lại; độ chính xác trung gian; độ đúng; độ sai lệch thô.
Kết quả thẩm định cho thấy:
Độ chọn lọc (độ đặc hiệu) của phương pháp, nền mẫu và các thành
phần trong dung môi sắc ký không gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích
các thành phân hoạt chất trong thuốc. Kết quả đáp ứng của mẫu trắng tại
các vị trí thời gian lưu các thành phần giao động từ 0,03% đến 0,50% đáp
50
ứng của mẫu chuẩn, mẫu thử có nồng độ tương đương chứng tỏ phương
pháp có độ đặc hiệu (chọn lọc) phù hợp mục đích sử dụng.
Độ tuyến tính: tiến hành thẩm định độ tuyến tính của các thành phần
hoạt chất trong khoảng 50% đến 150% nồng độ định lượng có hệ số tương
quan tuyến tính từ 0,9994 đến 1,0000 đạt yêu cầu đề ra.
Độ lặp lại (độ chính xác trong ngày) n = 6 giá trị RSD từ 0,31% đến
1,60%; độ chính xác trung gian (độ chính xác khác ngày) n = 12 giá trị RSD
từ 0,73% đến 1,69% phù hợp với yêu cầu của phép phân tích định lượng.
Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi hoạt chất trung bình từ 98,70% đến 99,08%;
với RSD của tỷ lệ thu hồi từ 0,77% đến 1,34% phù hợp với yêu cầu của
phép phân tích định lượng.
Các hoạt chất bền vững trong pha động cũng là dung môi pha mẫu.
Sau 24 giờ bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng hàm lượng hoạt chất trong
dung dịch mẫu thử khác nhau không có ý nghĩa thống kê so với hàm lượng
ban đầu ở mức tin cậy 95%.
Đối chiếu với các yêu cầu quy định trong hướng dẫn thẩm định quy
trình phân tích của Asean đạt yêu cầu các chỉ tiêu đề ra. Có thể sử dụng để
triển khai phân tích mẫu thực chứa các thành phần này phục vụ tiêu chuẩn
hóa cũng như quản lý chất lượng thuốc lưu hành.
51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Sau quá trình thực nghiệm, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã xây dựng được phương pháp định tính, định lượng đồng thời
các thành phần hoạt chất Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein trong chế phẩm
thuốc tiêm CGI bằng phương pháp LC-MS/MS. Điều kiện cụ thể như sau:
Điều kiện sắc ký:
Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng;
Pha động: Hỗn hợp Acetonitril : dung dịch Đệm Amoni acetat 5,0
mM pH = 3,0 (35:65);
Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút;
Thể tích tiêm: 10 µl;
Nhiệt độ Autosampler: nhiệt độ phòng.
Phát hiện chế độ MRM với các thông số:
Cone
Voltage
(V)
Năng
lượng
bắn phá
(V)
Chế độ
ion hóa
Glycin
16
22
ESI+
76,32
29,83
Glycyrrhizin
26
32
ESI+
840,46
453,25
Cystein
24
20
ESI+
121,83
58,88
Chất phân
tích
Mảnh mẹ Mảnh con
Chuẩn bị mẫu.
Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha động
với các nồng độ: Glycyrrhizin 2 µg/ml; Glycin 20 µg/ml; Cystein 1 µg/ml.
Dung dịch mẫu thử: Lấy thuốc của 5 ống, trộn đều. Hút chính xác
2,0 ml dung dịch chế phẩm, pha loãng bằng nước cất vừa đủ 100 ml. Lắc
đều. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch trên, pha loãng bằng pha động vừa đủ
20 ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
52
Đánh giá kết quả định tính, định lượng.
+ Định tính: so sánh thời gian lưu, mảnh khối chất phân tích trong
sắc ký đồ/ phổ đồ của dung dịch thử với dung dịch mẫu chuẩn.
+ Định lượng: dưa vào diện tích pic của chất phân tích trong sắc ký
đồ dung dịch chuẩn, dung dịch thử, nồng độ chất phân tích trong mẫu
chuẩn, thể tích và độ pha loãng của dung dịch chế phẩm tính hàm lượng %
từng hoạt chất so với hàm lượng ghi trên nhãn.
2. Đã thẩm định phương pháp đầy đủ theo hướng dẫn thẩm định quy
trình phân tích của Asean và quy định của Bộ Y tế. Kết quả thẩm định cho
thấy: Phương pháp đã xây dựng có độ chọn lọc cao với các thành phần hoạt
chất, không bị ảnh hưởng của nền mẫu; khoảng tuyến tính rộng từ 50% đến
150% nồng độ định lượng với hệ số tương quan tuyến tính r > 0,997 đối
với cả ba chất; độ lặp lại tốt với giá trị CV nhỏ (dưới 2%); độ đúng cao (giá
trị trung bình của độ tìm lại 98,70 đến 99,08%); dung dịch mẫu đã chuẩn bị
ổn định ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ.
KIẾN NGHỊ
Sau khi thực hiện đề tài với những kết quả nghiên cứu thu được,
chúng tôi có một số kiến nghị sau:
+ Áp dụng phương pháp định tính, định lượng các thành phần hoạt
chất trong chế phẩm thuốc nói trên để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đăng
ký sản xuất, lưu thông tại Việt Nam.
+ Kỹ thuật LC-MS/MS là một kỹ thuật tiên tiến, hiện đại có những
ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc, thời gian phân tích ngăn. Do
vậy phương pháp này cần được cân nhắc xây dựng trong các chuyên luận
Dược điển trong các lần xuất bản tiếp theo.
53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt.
1. Trần Tử An và cs, 2010. Kiểm nghiệm dược phẩm, tập 2, tr 107 -121,
2950318, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
2. Hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của Asean (bản Tiếng
Việt).
3. Bộ Y tế, 2010. Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học.
4. Bộ Y tế, 2014. Thông tư 44/2014/TT-BYT ngày 25 tháng 11 năm
2014, Hướng dẫn đăng ký thuốc.
5. Bộ Y tế, 2011. Tạp chí Y học Thực hành số 09 (782/2011). Nhà xuất
bản Y Học.
6. Tào Duy Cần và cs, 2013. Thuốc và Biệt Dược, Nhà xuất bản Y học.
7. Trịnh Văn Lẩu, 2010. Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương
pháp kiểm nghiệm thuốc, Nhà xuất bản Y học.
8. Trần Cao Sơn và cs, 2010. Thẩm định phương pháp trong phân tích
hóa học & vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật.
9. Phan Thị Nghĩa, 2014. Nghiên cứu định lượng Atenolol trong huyết
tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Luận văn Thạc
sỹ dược học, trường Đại Học Dược Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh.
10. Amit K. De, Sripama Datta, and Arup Mukherjee. Quantitative
analysis of Glycyrrhizic acid from herbal preperation using liquid
chromatographic technique. Journal of advanced Pharmaceutical
Technolgy & Research. Oct – Dec 2012. Doi 10.4103/22314040.104711.
11. Bristish
Pharmacopoeia
commission
office,
2013.
Bristish
Pharmacopoiea 2013.
12. Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd No. 6, East
Rongjing Street, BDA, Beijing, 100176, P.R.China. Specification
and test Method of Compound Glycyrrhizin Injection 20 ml.
13. Celine A. coiffard, Laurence j coiffard Francoise M. Peigne and
Yannick
M
de
Roeck-Halthanre,
1998.
Monoamonium
Glycyrrhizinate stability in anqueous buffer solution. University of
Nance France (08/01/1998).
14. Eisai Enters; In-licensing Agreement with Minophagen
Pharmaceutical. For Liver Disease/Allergic Disease Agents,
Stronger Neo-Minophagen® C and Glycyron® Tablets.
15. Test Method for Monoammonium Glycyrrhizinate 35 mg, Glycine
25
mg,
DL-Methionine
25
mg
Tablets.
http://www.nihs.go.jp/drug/Orange_Book_JPN
16. Univ.-Prof. Dr. Christoph Klein. Amino acid analysis in biofluids
using LC-MS/MS: Method development, validation and application
in clinical research and dairy science.
17. United States Pharmacopeial Convention 2012. United states of
Pharmacopeia 34-NF 29.
18. Xiaoyan Chen, Dafang Zhong*, Ying Han and Zhiyong Xie, 2010.
Determination of carbocysteine in human plasma by liquid
chromatography/tandem mass spectrometry employing precolumn
derivatizationLaboratory
Pharmacokinetics,
of
Shenyang
Drug
Metabolism
Pharmaceutical
Wenhua Road, Shenyang 110016, China.
University,
and
103
19. Wenyun Lu, Elizabeth Kimball, and Joshua D. Rabinowitz. A Highperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
Method for Quantitation of Nitrogen.
20. Ahuja S, Scypinski S. Hand book of modern pharmaceutical
analysis. USA. Academic Press 2005. Page 415-42.
21. Krähenbühl S, Hasler F, Krapf R. Analysis and pharmacokinetics of
glycyrrhizic acid in humans and experimaental animal. Steroids.
1994:59:121-6 [PubMed].
22. Ivana Kabelová, Markéta Dvořáková, Hana Čížková, Pavel Dostálek
and Karel Melzoch. Determination of free amino acids in cheeses
from the Czech market. Department of Fermentation Chemistry and
Bioengineering, Faculty of Food and Biochemical.
PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Phân tích các thành phần hoạt chất Glycin, L-Cystein, Glycyrhizin
trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký khối phổ (LC-MS/MS).
Điều kiện sắc ký:
Cột: C18 (100 x 2 mm; 1,8 µm); nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng;
Pha động: Hỗn hợp Acetonitril : dung dịch Đệm Amoni acetat 5,0
mM pH = 3,0 (35:65);
Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút;
Thể tích tiêm: 10 µl;
Nhiệt độ Autosampler: nhiệt độ phòng.
Điều kiện khối phổ: chế độ MRM với các thông số sau.
Chất phân
tích
Cone
Voltage
(V)
Năng
lượng
Chế độ
bắn phá
ion hóa
Mảnh mẹ Mảnh con
(V)
Glycin
16
22
ESI+
76,32
29,83
Glycyrrhizin
26
32
ESI+
840,46
453,25
Cystein
24
20
ESI+
121,83
58,88
Chuẩn bị mẫu.
Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp trong pha động
với các nồng độ: Glycyrrhizin 2 µg/ml; Glycin 20 µg/ml; Cystein 1 µg/ml.
Dung dịch mẫu thử: Lấy thuốc của 5 ống, trộn đều. Hút chính xác
2,0 ml dung dịch chế phẩm, pha loãng bằng nước cất vừa đủ 100 ml. Lắc
đều. Hút chính xác 1,0 ml dung dịch trên, pha loãng bằng pha động vừa đủ
20 ml. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Đánh giá kết quả định tính
+ Trên sắc ký đồ của mẫu thử phải cho các píc có cùng thời gian lưu
với píc tương ứng trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
+ Mẫu thử phải thể hiện các mảng phổ đặc trưng của các thành phần
hoạt chất cụ thể như sau:
Glycin: 76,32 => 29,83 Da;
L-Cystein: 121,83 => 58,88 Da;
Glycyrhizin: 840,46 =>453,25 Da.
Đánh giá kết quả định lượng
Dựa vào diện tích pic của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch
chuẩn, dung dịch thử, nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn, thể tích và
độ pha loãng của dung dịch chế phẩm tính hàm lượng % từng hoạt chất so
với hàm lượng ghi trên nhãn.
Quantify Sample Report
MassLynx MassLynx SCN855
Page 1 of 10
Dataset:
Untitled
Last Altered:
Printed:
Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time
Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time
Method: C:\MassLynx\Default.PRO\MethDB\CGI_240415_2.mdb 27 Apr 2015 15:22:44
Calibration: 27 Apr 2015 15:22:44
Name: Blank_ 1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:13:59, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
3.15 1.506e+002
2.42
3.94
2.17
100
0.72
1.21
100
%
%
0
2.00
1.37
0.62
0.98
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
1.470e+002
1.60
1.00
2.89 3.88
1.93
Trace
1
1 Glycin
2
2 L-Cystein
3
3 Glycyrrhizin
0.32
%
2.00
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
4.526e+002
Glycyrrhizin
2.27
67.61
6.76e1
2.91
100
3.69
1.52
0.61
0
min
3.00
# Name
test
2.67
0
min
1.00
Glycyrrhizin
test
min
3.00
1.00
IS Area
3.85
2.00
RT
Area
Response Primar...
76.332 > 29.83
0.37
4.786
4.786
bb
121.832 > 58.88
0.32
2.302
2.302
bb
840.363 > 453.338
2.27
67.609
67.609
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Blank_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:18:56, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
1.46
0.94
0.85
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
1.304e+002
2.71
3.12
2.38
3.91
Glycyrrhizin
test
100
L-Cystein
0.32
3.69
3.69e0
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
2.98 1.628e+002
1.89
2.64
3.62
test
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
2.512e+002
0.06
100
1.00 1.14
1.64
3.76
2.77 3.27 3.73
3.90
0.63
%
%
0
0
min
1.00
2.00
%
1.00
# Name
Trace
1
1 Glycin
2
2 L-Cystein
3
3 Glycyrrhizin
0
min
3.00
2.00
3.00
min
1.00
IS Area
2.00
RT
Area
Response Primar...
76.332 > 29.83
0.49
0.031
0.031
bb
121.832 > 58.88
0.32
3.695
3.695
bb
840.363 > 453.338
2.36
19.514
19.514
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Blank_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:23:47, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
0.01
0.98
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
3.14 1.666e+002
2.63
1.78
3.48
2.35
3.92
%
test
100
Glycyrrhizin
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
1.304e+002
0.76
2.24
0.14
2.49
3.69
1.09 2.17
%
0
min
1.00
2.00
3.00
test
100
0.35 0.69
0.79
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
2.87 2.508e+002
1.79
3.29 3.95
1.91
%
0
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
2.00
3.00
Quantify Sample Report
MassLynx MassLynx SCN855
Page 2 of 10
Dataset:
Untitled
Last Altered:
Printed:
Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time
Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time
Name: Blank_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:23:47, ID: test, Description:
# Name
Trace
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
RT
Area
0.39
2.548
IS Area
Response Primar...
2.548
bb
2.18
30.756
30.756
bb
Conc.
%Dev
Name: Chuan_50_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:28:38, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.40
1547.76
1.55e3
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
1.880e+004
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
10917.22
1.09e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
1.233e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
5.403e+005
Glycyrrhizin
2.29
67181.84
6.72e4
%
3.74
0
0
min
1.00
2.00
0
min
3.00
1.00
2.00
3.00
min
1.00
IS Area
2.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.40
1547.755
Response Primar...
1547.755
bb
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
10917.215
10917.215
bb
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
67181.844
67181.844
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Chuan_50_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:33:30, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.40
2114.25
2.11e3
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
2.470e+004
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
10952.11
1.10e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
1.203e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
5.404e+005
Glycyrrhizin
2.29
66593.33
6.66e4
%
3.75
0
0
min
1.00
2.00
3.00
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
IS Area
2.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.40
2114.252
Response Primar...
2114.252
bb
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
10952.114
10952.114
bb
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
66593.328
66593.328
bb
3.00
Conc.
%Dev
Quantify Sample Report
MassLynx MassLynx SCN855
Page 3 of 10
Dataset:
Untitled
Last Altered:
Printed:
Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time
Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time
Name: Chuan_50_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:38:21, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.40
2529.90
2.53e3
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
3.098e+004
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
11467.70
1.15e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
1.293e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
5.505e+005
Glycyrrhizin
2.29
68384.02
6.84e4
%
3.75
0
0
min
1.00
2.00
0
min
3.00
1.00
2.00
3.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.40
2529.895
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
min
1.00
IS Area
2.00
Response Primar...
2529.895
bb
11467.699
11467.699
bb
68384.016
68384.016
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Chuan_75_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:43:12, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.41
4196.53
4.20e3
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
4.896e+004
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
16515.57
1.65e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
1.789e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
8.134e+005
Glycyrrhizin
2.28
99927.65
9.99e4
%
3.74
0
0
min
1.00
2.00
0
min
3.00
1.00
2.00
3.00
min
1.00
IS Area
2.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
4196.534
Response Primar...
4196.534
bb
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
16515.566
16515.566
bb
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.28
99927.648
99927.648
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Chuan_75_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:48:04, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.40
5689.25
5.69e3
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
6.514e+004
%
Glycyrrhizin
test
100
L-Cystein
0.41
17069.29
1.71e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
1.864e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
8.295e+005
Glycyrrhizin
2.29
100559.12
1.01e5
%
3.76
0
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
2.00
3.00
Quantify Sample Report
MassLynx MassLynx SCN855
Page 4 of 10
Dataset:
Untitled
Last Altered:
Printed:
Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time
Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time
Name: Chuan_75_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:48:04, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.40
5689.251
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
IS Area
Response Primar...
5689.251
bb
17069.289
17069.289
bb
100559.117
100559.117
bb
Conc.
%Dev
Name: Chuan_75_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:52:55, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.41
7487.32
7.49e3
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
8.330e+004
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
16695.61
1.67e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
1.802e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
8.177e+005
Glycyrrhizin
2.29
99776.16
9.98e4
%
3.76
0
0
min
1.00
2.00
0
min
3.00
1.00
2.00
3.00
min
1.00
IS Area
2.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
7487.322
Response Primar...
7487.322
bb
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
16695.611
16695.611
bb
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
99776.156
99776.156
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Chuan_100_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 11:57:46, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.40
10538.50
1.05e4
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
1.217e+005
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
19749.31
1.97e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
2.072e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
1.098e+006
Glycyrrhizin
2.30
130397.56
1.30e5
%
3.76
0
0
min
1.00
2.00
3.00
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
IS Area
2.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.40
10538.496
10538.496
Response Primar...
bb
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
19749.311
19749.311
bb
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
130397.563
130397.563
bb
3.00
Conc.
%Dev
Quantify Sample Report
MassLynx MassLynx SCN855
Page 5 of 10
Dataset:
Untitled
Last Altered:
Printed:
Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time
Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time
Name: Chuan_100_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:02:38, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.41
12910.00
1.29e4
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
1.471e+005
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
20433.99
2.04e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
2.190e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
1.101e+006
Glycyrrhizin
2.29
131888.34
1.32e5
%
3.76
0
0
min
1.00
2.00
0
min
3.00
1.00
2.00
3.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
12909.999
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
min
1.00
IS Area
2.00
Response Primar...
12909.999
bb
20433.994
20433.994
bb
131888.344
131888.344
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Chuan_100_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:07:29, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.41
11537.54
1.15e4
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
1.293e+005
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
20891.70
2.09e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
2.224e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
1.104e+006
Glycyrrhizin
2.29
132335.86
1.32e5
%
3.77
0
0
min
1.00
2.00
0
min
3.00
1.00
2.00
3.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
11537.538
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
min
1.00
IS Area
2.00
Response Primar...
11537.538
bb
20891.701
20891.701
bb
132335.859
132335.859
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Chuan_125_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:12:20, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.41
16929.73
1.69e4
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
1.931e+005
%
Glycyrrhizin
test
100
L-Cystein
0.41
24287.76
2.43e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
2.580e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
1.306e+006
Glycyrrhizin
2.29
153372.59
1.53e5
%
3.76
0
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
2.00
3.00
Quantify Sample Report
MassLynx MassLynx SCN855
Page 6 of 10
Dataset:
Untitled
Last Altered:
Printed:
Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time
Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time
Name: Chuan_125_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:12:20, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
16929.734
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
IS Area
Response Primar...
16929.734
bb
24287.756
24287.756
bb
153372.594
153372.594
bb
Conc.
%Dev
Name: Chuan_125_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:17:11, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.41
17789.77
1.78e4
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
1.945e+005
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
25143.44
2.51e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
2.745e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
1.299e+006
Glycyrrhizin
2.30
152612.78
1.53e5
%
3.77
0
0
min
1.00
2.00
0
min
3.00
1.00
2.00
3.00
min
1.00
IS Area
2.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
17789.768
17789.768
Response Primar...
bb
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
25143.438
25143.438
bb
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
152612.781
152612.781
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Chuan_125_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:22:03, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.41
20118.41
2.01e4
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
2.221e+005
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
23713.63
2.37e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
2.526e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
1.302e+006
Glycyrrhizin
2.29
152205.06
1.52e5
%
3.76
0
0
min
1.00
2.00
3.00
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
IS Area
2.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
20118.412
20118.412
Response Primar...
bb
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
23713.629
23713.629
bb
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
152205.063
152205.063
bb
3.00
Conc.
%Dev
Quantify Sample Report
MassLynx MassLynx SCN855
Page 7 of 10
Dataset:
Untitled
Last Altered:
Printed:
Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time
Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time
Name: Chuan_150_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:26:54, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.40
25267.00
2.53e4
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
2.826e+005
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
28846.24
2.88e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
3.028e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
1.593e+006
Glycyrrhizin
2.29
185119.20
1.85e5
%
3.75
0
0
min
1.00
2.00
0
min
3.00
1.00
2.00
3.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.40
25266.996
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
min
1.00
IS Area
2.00
Response Primar...
25266.996
bb
28846.242
28846.242
bb
185119.203
185119.203
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Chuan_150_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:31:45, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.41
26116.54
2.61e4
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
2.986e+005
Glycyrrhizin
test
100
%
L-Cystein
0.41
29684.95
2.97e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
3.205e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
1.590e+006
Glycyrrhizin
2.28
185413.69
1.85e5
%
3.74
0
0
min
1.00
2.00
0
min
3.00
1.00
2.00
3.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
26116.535
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.28
min
1.00
IS Area
2.00
Response Primar...
26116.535
bb
29684.945
29684.945
bb
185413.688
185413.688
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: Chuan_150_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:36:37, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
test
100
Glycin
0.40
29644.54
2.96e4
MRM of 4 channels,ES+
76.332 > 29.83
3.356e+005
%
Glycyrrhizin
test
100
L-Cystein
0.41
29409.42
2.94e4
MRM of 4 channels,ES+
121.832 > 58.88
3.162e+005
%
test
100
MRM of 4 channels,ES+
840.363 > 453.338
1.546e+006
Glycyrrhizin
2.29
183740.77
1.84e5
%
3.76
0
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
2.00
3.00
Quantify Sample Report
MassLynx MassLynx SCN855
Page 8 of 10
Dataset:
Untitled
Last Altered:
Printed:
Monday, April 27, 2015 15:22:44 SE Asia Standard Time
Monday, April 27, 2015 15:23:55 SE Asia Standard Time
Name: Chuan_150_3, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:36:37, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.40
29644.543
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
IS Area
Response Primar...
29644.543
bb
29409.416
29409.416
bb
183740.766
183740.766
bb
Conc.
%Dev
Name: THu_1, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:41:28, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
Glycyrrhizin
THu_1 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+
test
76.332 > 29.83
1.889e+005
Glycin
100
0.41
16856.69
1.69e4
THu_1 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+
test
121.832 > 58.88
1.505e+005
L-Cystein
100
0.41
15684.87
1.57e4
THu_1 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+
test
840.363 > 453.338
1.319e+006
Glycyrrhizin
100
2.31
155426.08
1.55e5
%
%
%
3.78
0
0
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
2.00
3.00
min
1.00
IS Area
2.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
16856.691
16856.691
Response Primar...
bb
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
15684.868
15684.868
bb
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.31
155426.078
155426.078
bb
3.00
Conc.
%Dev
Name: THu_2, Date: 27-Apr-2015, Time: 12:46:19, ID: test, Description:
Glycin
L-Cystein
Glycyrrhizin
THu_2 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+
test
76.332 > 29.83
1.913e+005
Glycin
100
0.41
17835.08
1.78e4
THu_2 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+
test
121.832 > 58.88
1.514e+005
L-Cystein
100
0.41
15652.79
1.57e4
THu_2 Smooth(Mn,1x2) MRM of 4 channels,ES+
test
840.363 > 453.338
1.317e+006
Glycyrrhizin
100
2.29
156273.31
1.56e5
%
%
%
3.77
0
0
min
1.00
2.00
3.00
min
1.00
2.00
3.00
0
min
1.00
IS Area
2.00
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
76.332 > 29.83
0.41
17835.082
17835.082
Response Primar...
bb
2
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
15652.791
15652.791
bb
3
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
156273.313
156273.313
bb
3.00
Conc.
%Dev
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
# Name
Trace
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Page 1 of 11
RT
Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1029.237
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
10100.721
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
63987.199
bb
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Name: Std_75%_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 09:56:41, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1293.753
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
15572.046
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
96226.798
bb
Name: Std_100%_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:00:51, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1725.132
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
20181.395
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
128302.398
bb
Name: Std_125%_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:04:21, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
2155.562
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
25226.743
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
160433.997
bb
Name: Std_150%_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:09:11, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
2598.978
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
30309.093
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
193009.970
bb
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
Page 2 of 11
Name: Std_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:15:09, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1675.098
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
20181.908
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
133343.023
bb
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Name: Thu_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:18:01, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1656.028
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
18909.012
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
147800.092
bb
Name: Thu_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:22:17, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1665.908
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
18956.005
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
148778.004
bb
Name: Thu_1_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:25:11, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1675.008
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
18856.605
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
147878.004
bb
Name: Thu_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:29:01, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1599.099
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
18933.056
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
147725.896
bb
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
Page 3 of 11
Name: Thu_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:33:17, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1589.076
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
18956.044
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
147738.056
bb
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Name: Thu_2_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:37:11, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1585.977
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
18955.861
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
147895.328
bb
Name: Thu_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:40:01, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1609.567
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
18704.967
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
148405.955
bb
Name: Thu_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:43:55, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1692.008
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
18723.888
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
152654.675
bb
Name: Thu_3_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 10:47:59, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1688.066
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
18733.876
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
153224.091
bb
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
Page 4 of 11
Name: Thu_4_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:01:31, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,39
1649.009
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
18999.034
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
148829.922
bb
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Name: Thu_4_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:04:55, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1650.554
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
18893.099
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.28
147985.044
bb
Name: Thu_4_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:08:59, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1674.097
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
189878.933
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
147888.915
bb
Name: Thu_5_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:12:31, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,39
1598.656
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
18740.981
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
147836.632
bb
Name: Thu_5_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:15:05, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1609.523
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
18861.098
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.28
148665.236
bb
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
Page 5 of 11
Name: Thu_5_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:18:58, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1599.733
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
18667.944
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
147789.656
bb
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Name: Thu_6_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:22:31, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,39
1645.554
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
18678.563
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
147749.654
bb
Name: Thu_6_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:25:05, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1655.522
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
18766.955
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.28
147452.311
bb
Name: Thu_6_3, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:28:58, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1667.538
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
18677.933
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
148003.944
bb
Name: Std_dd_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:33:11, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1689.882
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
20891.092
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
132335.647
bb
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
Page 6 of 11
Name: Std_dd_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:36:09, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1688.821
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
20887.992
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
133772.983
bb
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Name: DD_80_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:39:01, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1296.219
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
12754.811
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
124340.735
bb
Name: DD_80_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:42:17, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1299.291
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
12667.982
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
124652.452
bb
Name: DD_80_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:45:11, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1292.821
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
12533.721
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
123347.731
bb
Name: DD_80_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:49:01, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1289.129
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
12453.762
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
122939.839
bb
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
Page 7 of 11
Name: DD_80_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:53:17, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1328.912
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
12509.362
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
124330.647
bb
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Name: DD_80_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 11:57:11, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1302.112
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
12548.933
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
124536.527
bb
Name: DD_100_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:01:01, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1615.237
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
15681.083
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
156578.738
bb
Name: DD_100_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:04:55, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1617.829
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
15762.351
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
156837.922
bb
Name: DD_100_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:08:09, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1642.367
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.40
16349.362
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.29
156067.637
bb
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
Page 8 of 11
Name: DD_100_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:12:31, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,39
1623.872
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
16352.831
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
157002.811
bb
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Name: DD_100_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:15:38, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1677.361
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
16387.372
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.28
155411.927
bb
Name: DD_100_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:18:59, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1679.728
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
16427.356
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
156001.273
bb
Name: DD_120_1_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:22:31, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,39
1989.736
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
18614.263
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
187665.367
bb
Name: DD_120_1_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:25:53, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1899.920
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
18728.293
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.28
188367.352
bb
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
Page 9 of 11
Name: DD_120_2_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:28:58, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
1989.921
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
18609.293
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
188664.722
bb
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Conc.
%Dev
Name: DD_120_2_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:32:31, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,39
1981.828
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.41
18677.920
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
187998.723
bb
Name: DD_120_3_1, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:36:05, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,41
1965.728
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
18860.362
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.28
178933.027
bb
Name: DD_120_3_2, Date: 28-Apr-2015, Time: 12:40:18, ID: test, Description:
# Name
Trace
RT
Area
1
1 Glycin
2
3
IS Area
Primar…
76.332 > 29.83
0,40
2977.822
bb
2 L-Cystein
121.832 > 58.88
0.39
18799.262
bb
3 Glycyrrhizin
840.363 > 453.338
2.30
177927.712
bb
Quantify Sample Summary Report MassLynx MassLynx SCN855
Dataset: Untitled
Last Altered: Friday, April 28, 2015 18:02:34 SE Asia Standard Time
Printed: Friday, April 28, 2015 18:04:25 SE Asia Standard Time
Page 10 of 11
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lâp - Tự do – Hạnh phúc
BÁO CÁO
SỬA CHỮA LUẬN VĂN DSCK CẤP I KHÓA 16
Kính gửi:
- Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp DSCK cấp I;
- Phòng Sau đại học Trường đại học Dược Hà Nội;
- Giáo viên hướng dẫn.
Họ và tên học viên: Trịnh Lê Anh
Tên đề tài: Nghiên cứu nâng cao tiêu chuẩn chất lượng thuốc tiêm CGI.
Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc.
Mã số:
Đã bảo vệ luận văn tốt nghiệp DSCK cấp I vào hồi: 8 giờ 30 phút
ngày 13
tháng 9 năm 2015 tại thành phố Thanh Hóa. Quyết định số:
611/QĐ-DHN ngày 07 tháng 8 năm 2015 của Hiệu trưởng Trường Đại học
Dược Hà Nội.
NỘI DUNG SỬA CHỮA, HOÀN CHỈNH
1. Những nội dung đã được sửa chữa theo yêu cầu của Hội đồng:
Tên luận văn chưa phù hợp với nội dung:
+ Đổi lại tên mới: “Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc
tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”.
Cần nêu rõ nguồn gốc của thuốc tiêm CGI:
+ Đã bổ xung thêm nguồn gốc thuốc tiêm CGI vào trong luận văn.
Cách viết tài liệu tham khảo chưa đúng, một số tài liệu tham khảo đã
quá cũ.
+ Lược bỏ một số tài liệu tham khảo đã cũ của luận văn. Viết lại các tài
liệu tham khảo theo đúng quy định về trình bày tài liệu tham khảo của luận
văn tốt nghiệp, nghiên cứu khoa học.
Sửa từ “Độ thô” thành “Độ vững”.
+ Đã sửa lại.
Trang 22: xem lại lượng cân và nồng độ của dung dịch chuẩn.
+ Đã xem xét lại và hiệu chỉnh các lượng cân mẫu phù hợp.
Bàn luận cần so sánh với các kết quả đã công bố.
+ Bổ sung bàn luận so sánh giữa kết quả định lượng bằng phương pháp
LC-MS/MS và kết quả định lượng bằng phương phương pháp đã xây
dựng trong TCCS của chế phẩm.
Nội dung chưa đề cập đến phương pháp phân tích định tính.
+ Bổ sung thêm phần định tính.
Nên có phụ lục về quy trình phân tích.
+ Đã bổ sung quy trình phân tích định tính và định lượng các hoạt chất
trong thuốc tiêm CGI bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LCMS/MS.
Còn một số lỗi chính tả.
+ Đã đính chính các lỗi chính tả.
2. Những nội dung xin bảo lưu: Không có.
Hà Nội, ngày
tháng 9 năm 2015
Xác nhận của cán bộ hướng dẫn
Học viên
Trịnh Lê Anh
PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN
Ủy viên thư ký Hội đồng
TS. Nguyễn Trần Linh
Chủ tịch Hội đồng
PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện
[...]... trng; - Tan tt trong nc; tan trong ethanol, khú tan trong methylen clorid, khụng tan trong ether [14] Glycin O OH NH2 Hỡnh 1.2 Cụng thc cu to ca Glycin - Cụng thc phõn t: C2H5NO2; Cụng thc cu to: H2N-CH2-COOH; Trng lng phõn t: 75,07 g/mol; Tờn khoa hc: Acid aminoacetic; Bt kt tinh mu trng, v ngt; Tan tt trong nc; tan trong c mụi trng acid v mụi trng kim, tan trong ethanol, khụng tan trong ether [4],... t: 157,62 g/mol; Tờn khoa hc: 2-Amino-3-sulfhydrypropanoic hydroclorid; 4 - Bt kt tinh mu trng; - Tan tt trong nc; tan trong c mụi trng acid v mụi trng kim, tan trong ethanol, khụng tan trong cỏc dung mụi hu c ớt phõn cc [4], [13], [18] 1.1.3 Tỏc dng dc lý, dc ng hc, ch nh, chng ch nh thuc tiờm CGI Dc lc hc [15] + Tỏc dng chng viờm: c ch cỏc enzym chuyn húa acid arachidonic: Glycyrrhizin cú th liờn... kali mỏu + Ph n cú thai hoc nuụi con bỳ 6 1.1.4 Phng phỏp nh lng cỏc hot cht trong thuc tiờm CGI Trờn th gii ó cú nhiu ti liu cụng b v cỏc phng phỏp nh tớnh, nh lng: Glycyrrhizin; Glycin; L-Cystein khỏc nhau bng cỏc k thut: sc ký lng [11], [13], [16]; chun th tớch [12], [13], [18]; sc ký lng khi ph [19], [17], [22] Tuy thuc CGI ó c sn xut ti Nht Bn, Trung Quc v s dng ti nhiu ni trờn th gii, xong cha... sc ký (HPLC) vi kh nng phõn tớch khi ca h thng khi ph Sc ký lng hiu nng cao l mt h thng cú vai trũ tỏch cỏc cht da trờn s khỏc nhau v cỏc tớnh cht húa lý ca chỳng [4] Khi ph l k thut o trc tip t s khi lng v in tớch ca ion (m/z) c to thnh trong pha khớ t phõn t hoc nguyờn t ca mu da trờn s chuyn ng ca cỏc ion nguyờn t hay ion phõn t trong mt in trng hoc mt t trng nht nh [18], [13] 1.2.2 H thng sc ký. .. thng sc ký lng khi ph loi t cc chp ba (Triple Quadrupole) hay cũn gi l khi ph hai ln (MS/MS) c s dng nhiu trong cụng tỏc nghiờn cu, kim tra cht lng thuc, nht l nh lng thuc trong dch sinh hc, nghiờn cu tng ng sinh hc, nghiờn cu nh lng cỏc thuc cú thnh phn phc tp vỡ thit b cú nhy, chn lc cao Trong cỏc kiu hỡnh thnh ion, k thut phun in t ESI (Electrospray Ionazition ESI) c s dng nhiu hn c Trong nghiờn... ti trong mu th Thụng thng gm: cỏc tp cht, sn phm phõn hy, cht nn Trong LC-MS, tớnh c hiu c th hin khi kt qu thu c trờn sc ký mu th cho thy pic ca cht cn phõn tớch c phõn tỏch v nhn din rừ rng T l ỏp ng ca mu trng ti v trớ cỏc pic ca cht phõn tớch khụng c vt quỏ 2% 1.3.2 tuyn tớnh tuyn tớnh ca mt qui trỡnh phõn tớch din t ỏp ng phõn tớch thu c t l vi nng (trong khong nht nh) ca cht phõn tớch trong. ..Chng 1 TNG QUAN 1.1 THUC TIấM COMPOUND GLYCYRRHIZIN INJECTION (CGI) 1.1.1 Ngun gc v cụng thc bo ch ca thuc tiờm CGI + Ngun gc: Thuc tiờm CGI (Compound Glycyrhizin Injection) c sn xut bi: Beijing Kawin Technology Share-holding Co., Ltd No.7 Rongchang East Street, BDA, Beijing, China + Cụng thc bo ch 20 ml dung dch tiờm CGI: Monoamoni Glycyrrhizinate tng ng Acid Glycyrrhizin 40 mg Glycin 400... cao Khi trong cụng thc cú thờm cỏc thnh phn tỏ dc cú tỏc dng m pH, nn mu phc tp phng phỏp s gp sai s hoc khụng tin hnh c 7 Hot cht Cystein dng nguyờn liu mt s dc in ó xõy dng phng phỏp nh lng bng chun oxy húa kh, trong ú cht phõn tớch c hũa tan trong nc ri chun bng dung dch iod 0,1N phng phỏp tha tr hoc chun trc tip vi ch th h tinh bt [13]; [16]; [18] Phng phỏp ny da vo tớnh kh ca nhúm -SH trong phõn... Glycyrrhizin trong ch phm thuc tiờm CGI c xõy dng phng phỏp nh lng bng sc ký lng hiu nng cao vi detector UV bc súng 252 nm; hoc detector PDA vi bc súng ly pic l 252 nm [12] Krọhenbỹhl S, Hasler F, Krapf R ó tin hnh nh lng acid Glycyrrhizin v cỏc cht chuyn húa ca Acid Glycyrrhizin bng phng phỏp LC-MS/MS, khong nng thp khong 1-2 àg/ml [22] 8 1.2 SC Kí LNG - KHI PH (LC-MS) 1.2.1 Khỏi nim Sc ký lng khi... t mc gn nhau (mc phõn tỏn) gia mt dóy kt qu thu c ca cỏc mu th c chun b t mt mu ng nht trong iu kin ó ra chớnh xỏc chia lm 3 cp: lp li, chớnh xỏc trung gian v tỏi lp lp li lp li din t chớnh xỏc ca quy trỡnh phõn tớch tin hnh trong cựng iu kin thớ nghim trong khong thi gian ngn lp li biu th chớnh xỏc trong nh lng Thng c tin hnh trờn 3 nng khỏc nhau, mi nng 3 ln (suy ra t ỳng) Cng cú th ... Lờ Anh DANH MC CC CH VIT TT CGI : Thuc tiờm Compound Glycyrrhizin Injection ESI : Ch ion húa bng phun in t HPLC : Sc ký lng hiu nng cao LC : Sc ký lng LC-MS/MS : Sc ký lng ph ln m/z : Khi lng/... 3.7 Sc ký mu chun Glycin v mu trng 32 Hỡnh 3.8 Sc ký mu chun Glycyrrhizin v mu trng 32 Hỡnh 3.9 Sc ký mu chun L-Cystein v mu trng 33 T VN Thuc tiờm Compound Glycyrrhizin Injection (CGI) cha... Cỏc sc ký c trỡnh by cỏc hỡnh 3.7; 3.8; 3.9 Kt qu t l ỏp ng pic c trỡnh by bng 3.3 Hỡnh 3.7 Sc ký mu chun Glycin v mu trng Hỡnh 3.8 Sc ký mu chun Glycyrrhizin v mu trng 32 Hỡnh 3.9 Sc ký mu
Ngày đăng: 22/10/2015, 10:37
Xem thêm: Nghiên cứu phân tích các hoạt chất trong thuốc tiêm CGI bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ