2.2.5.1. Phương pháp phân tích Vật lí
a. Kiểm tra độ Brix
Sử dụng Brix kế của phòng thí nghiệm hóa sinh.
Cách thực hiện:
Dùng đũa khuấy khuấy nhẹ dung dịch cần đo nồng độ chất hòa tan, lấy ra một giọt chấm vào mặt kính. Đậy nắp kính lại. Quan sát và đọc độ Brix qua ống kính bằng vạch phân chia vùng tối và vùng sáng trên thang đo. Xoay nhẹ ống kính để nhìn rõ nếu thấy thang đo bị mờ. Sau đó rửa lại kính bằng nước cất và lau khô nhẹ nhàng bằng giấy thấm.
Sử dụng máy đo pH Mettler của phòng thí nghiệm vi sinh.
Cách tiến hành:
Rửa sạch đầu đo, lau khô bằng giấy thấm, nhúng đầu đo vào dung dịch cần đo. Khi máy hiện lên “pH” thì có thể đọc giá trị pH trên màn hình. Khi đo nhiều lần liên tiếp thì sau mỗi lần đo, làm sạch bằng cách nhúng đầu đo vào nước cất. Sau khi đo xong, rửa sạch đầu đo, lau khô và tắt máy.
c. Kiểm tra hàm lượng cồn Ethanol
Phương pháp này được tiến hành theo TCVN 03786 – 1986.
Cách tiến hành:
Dùng bình định mức lấy chính xác 500ml hoặc 250ml rượu ở 20oC (tuỳ theo loại rượu kế), rót cẩn thận vào bình cầu của bộ cất rượu. Lấy khoảng 100ml nước cất, tráng rửa bình định mức vài lần để chuyển vào bình cầu. Lắp hệ thống cất, hứng dịch cất vào bình định mức vừa tráng nói trên, trong bình này chứa sẵn 50ml nước cất. Sau khi cất được 3/4 bình hướng và nhiệt độ hơi cất đạt 100oC thì ngừng cất thêm nước cất đến vạch mức rồi giữ ở nhiệt độ 20oC trong 30 phút. Sau đó thêm nước cất đến vạch, lắc đều rồi tiếp tục tiến hành theo TCVN 378-86.
d. Phương pháp đo OD
Sử dụng máy đo quang của phòng thí nghiệm vi sinh.
Cách tiến hành:
Sử dụng pipepman mang hút 1ml huyền phù rồi pha vào ống nghiệm có chứa 9ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng bằng nồi hấp Autoclear. Dùng Vortex lắc đều dung dịch trong ống nghiệm. Đổ dung dịch ra cuvet rồi tiến hành đo OD theo bước sóng thích hợp. Đợi số chỉ trên màn hình ổn định thì ghi lại. Tiến hành đo 3 lần và lấy giá trị trung bình.
2.2.5.2. Phương pháp phân tích Hóa học
Sử dụng phương pháp phân tích hóa học để xác định hàm lượng acid có trong rượu vang theo TCVN 1273 – 1986.
a. Dụng cụ và thuốc thử
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 43 Khoa Hóa học & CNTP b. Tiến hành thử
Lấy chính xác 10ml rượu cho vào cốc, dung tích 100ml thêm 50 ml nước cất (đã đun sôi và để nguội). Sau đó dùng dung dịch NaOH 0,1 N vừa nhỏ giọt vừa khuấy và đo pH của dung dịch. Việc chuyển độ kết thúc ở pH = 7.
c. Tính toán kết quả
Hàm lượng acid (X1) chuyển ra acid citric tính bằng g/l rượu theo công thức: X1 = V . 70 . 0,1 . 1000 = 0,7 V
10 . 1000 Trong đó:
‒ V – thể tích dung dịch natri hidroxit 0,1N tiêu tốn khi chuẩn, ml; ‒ 70 – phần tử lượng acid citric, g;
‒ 0,1 – nồng độ của NaOH; ‒ 1000 – hệ số chuyển ra g/l;
2.2.5.3. Phương pháp phân tích Sinh học
Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định tổng số tế bào vi khuẩn
Leuconostoc oenos có trong 1ml huyền phù.
a. Nguyên tắc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được. Đây là cơ sở cho việc định lượng tế bào trên thạch đĩa vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chính là số lượng tế bào sống có trong thể tích giống đó.
Cấy một thể tích xác định dịch mẫu đã pha loãng lên đĩa petri có môi trường thích hợp. Đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả phát triển của một tế bào.
b. Thao tác đổ đĩa, cấy giống nấm men
‒ Ghi trên đáy đĩa: tên mẫu, ngày cấy, nồng độ pha loãng. ‒ Bật đèn UV khử trùng phòng cấy trước lúc cấy 20 – 30 phút.
‒ Thực hiện đổ đĩa, với mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường. Xoay đĩa theo hình số 8 để môi trường phân bố đều trong đĩa, để yên để môi trường đặc hoàn toàn.
‒ Dùng pipetman vô trùng hút 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa. Dàn đều bằng que gạt thủy tinh.
‒ Đặt tất cả các đĩa đã cấy vào tủ ấm, nuôi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. c. Cách đếm khuẩn lạc
Dùng bút lông kim và thước kẻ chia đáy hộp ra 4 phần, lần lượt đếm các khuẩn lạc có trong từng phần.
d. Công thức tính
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 51 Khoa Hóa học & CNTP Các mẫu M2, M3 cho các giá trị trung bình và gần tương đương nhau. Và mẫu M4 cho giá trị OD cao nhất. Các kết quả trên phù hợp với các nghiên cứu của Lê Thị Liên Thanh đã đưa ra.
Qua biểu đồ cũng như bảng kết quả, chúng ta có thể kết luận rằng trong môi trường riêng rẽ các nguồn nitơ thì vi khuẩn đều phát triển tốt, cao nhất ở cao nấm men, sau đó đến cao thịt bò và cuối cùng là peptone. Tuy nhiên, môi trường tốt nhất là môi trường có chứa của 3 nguồn nitơ trên.
Những kết quả trên có thể giải thích như sau: peptone là một hỗn hợp của polypeptide và acid amin được hình thành bởi một phần thủy phân của protein. Việc phân giải các polypeptide thành peptide làm mất nhiều năng lượng hơn, chính vì vậy, ở môi trường nuôi cấy chỉ có pepton, vi khuẩn phát triển chậm nhất. Cao nấm men, cao thịt bò là hỗn hợp của các acid amin và peptide có độ dài ngắn hơn. Trong quá trình chuyển hóa dinh dưỡng của vi khuẩn, chúng không mất quá nhiều năng lượng để bẻ gãy các chuỗi polypeptide thành peptide mà chỉ chuyển hóa peptide thành các acid amin. Chính vì vậy, ở các môi trường riêng cao thịt bò và cao nấm men
Leuconostoc oenos phát triển tốt hơn môi trường chỉ chứa peptone.
Như vậy, nguồn nitơ ảnh hưởng đáng kể đến khả năng phát triển cực đại của chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos. Để thu sinh khối được cao nhất, ta sử dụng môi trường có chứa cả 3 nguồn nitơ hữu cơ là: cao thịt bò, cao nấm men và peptone.
3.1.5. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc
oenos.
pH có ảnh hưởng rất sâu sắc đến sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng phân giải acid malic của Leuconostoc oenos. Sở dĩ vi khuẩn Leuconostoc oenos chuyển hóa được acid malic thành acid lactic vì trong tế bào của nó cơ chứa enzym maloactic. Do bản chất của enzym là protein nên hoạt lực của chúng chỉ phù hợp với một số khoảng pH nhất định, nếu không sẽ xảy ra hiện tượng keo tụ hoặc biến tính protein và sẽ dẫn đến mất hoạt lực enzym. Môi trường vang non rất thích hợp cho sự phân hủy acid malic vì các chủng vi khuẩn có hoạt độ malolactic cao trong khoảng pH của rượu vang non, tuy nhiên lại không thích hợp cho sự sinh trưởng của chúng. [2], [5]
Vi khuẩn cần có độ pH sinh lí bên trong tế bào của chúng giống như tất cả các sinh vật khác. Khả năng để chúng tồn tại trong các môi trường pH cực đoan phụ thuộc vào khả năng chiều chỉnh sự chênh lệch pH bên trong và bên ngoài của chúng.
Ở môi trường có độ pH thấp (pH 3 ÷ 4), vi khuẩn phát triển kém do pH trong tế bào chất có sự biến hóa đột ngột sẽ làm phá vỡ màng sinh chất hoặc làm ức chế hoạt tính của enzyme hay protein chuyển màng, do đó làm tổn thương đến vi sinh vật. Sự biến đổi pH của môi trường cũng sẽ làm thay đổi trạng thái điện ly của phân tử các chất dinh dưỡng, làm hạ thấp khả năng sử dụng chúng của vi sinh vật dẫn đến các vi khuẩn này sẽ bị chết và mất một thời gian tương đối dài để vi khuẩn tổng hợp ra các phân tử đi kèm, chẳng hạn như các protein gây sốc acid hay các protein gây sốc nhiệt. Chúng được dùng để phòng ngừa sự biến tính acid của các protein khác và giúp sửa chữa lại các protein đã bị biến tính. [16]
Từ đó cho thấy, môi trường rượu vang non không thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn này. Tuy nhiên, môi trường được bổ sung sượu vang non là môi trường huấn luyện tương đối tốt cho quá trình chuẩn bị lên men malolactic sau này.
3.1.6. Ảnh hưởng của thành phần đường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos. khuẩn Leuconostoc oenos.
Đường cũng là một cơ chất quan trọng trong quá trình phát triển của vi khuẩn
Leuconostoc oenos. Chúng chính là nguồn cung cấp carbohyrate cho các con đường
chuyển hóa của vi khuẩn. Tuy không phải là cơ chất chính trong quá trình lên men malolactic nhưng thành phần đường cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Theo kết quả nghiên cứu của Lê Thị Liên Thanh thì khi môi trường chỉ có fructose hoặc glucose làm cơ chất thì nhận thấy frutose có tác dụng kích thích sinh trưởng mạnh hơn glucose. [2], [5]
Để nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần đường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos, chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường cơ bản có điều chỉnh như sau: M1: bổ sung đường saccharose 20g/l; M2: bổ sung đường fructose 20g/l; M3: bổ sung đường glucose: 20g/l; M4: bổ sung hỗn hợp 3 loại đường trên với nồng độ mỗi loại là: 7g/l; ĐC: không bổ sung đường.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 55 Khoa Hóa học & CNTP Thông thường, so với các loại đường khác, glucose là cơ chất được vi khuẩn lactic sử dụng nhiều hơn cả. Glucose có thể tham gia trực tiếp vào các chu trình như: con đường đường phân, con đường pentose phosphate, con đường phosphoketolase. Còn ở fructose, có hai con đường trao đổi là: lên men lactic dị hình (con đường đường phân) và lên men dị kết hợp (di hình/ mannitol).[1]
Tuy nhiên, ở môi trường M2 chỉ có chứa đường fructose và môi trường M3 chỉ có chứa đường glucose thì vi khuẩn ở M2 sẽ phát triển tốt hơn so với ở M3. Điều này có thể giải thích là do đường fructose có cấu trúc vòng 5, trong quá trình phân giải sẽ nhanh hơn đường glucose có cấu trúc vòng 6 bền hơn. Như vậy có thể nhận thấy rằng, các dạng đường dạng xetora như fructose kích thích sinh trưởng tốt hơn đường dạng andoza như glucose.
Còn đường saccharoze, là loại đường disaccharide, sự chuyển hóa các disaccharide hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Hầu hết các tác giả đều cho rằng vi khuẩn lactic sẽ đồng hóa các loại đường này bằng cách thủy phân chúng thành monosaccharide trước, sau đó các đường đơn này tiếp tục thâm gia vào chuỗi các chuyển hóa đã nói ở trên. Điều này giải thích vì sao vi khuẩn phát triển kém hơn ở môi trường chỉ chứa đường saccharoze. [1] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Như vậy, qua các thí nghiệm trên, điều kiện tốt nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos là nuôi cấy từ 2 – 3 ngày ở nhiệt độ từ 250C, ngoài các yếu tố vi lượng thì các thành phần chủ yếu sẽ bổ sung như sau: fructose 7g/l, glucose 7g/l, saccharose 7g/l, peptone 5g/l, cao thịt bò 5g/l, cao nấm men 5g/l, pH = 5 và độ cồn < 10%V.
Chúng tôi sử dụng môi trường này để nuôi cấy vi khuẩn Leuconostoc oenos lấy sinh khối và nhân giống ở cấp quy mô phòng thí nghiệm trong lên men malolactic nhờ tế bào tự do.
3.2. Tỉ lệ giống thích hợp bổ sung vào dịch vang non.
Dịch cacao sau khi lên men chính 7 ngày sẽ bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc
oenos với các tỉ lệ như sau để tiến hành lên men malolactic như sau: ĐC: không bổ
Theo kết quả trên, ta thấy rằng pH tăng nhẹ từ 3,893 đến 4,001, trong đó mẫu M3 cho giá trị pH cao nhất. Điều này được giải thích là do trong quá trình lên men rượu, nấm men sinh trưởng và phát triển tạo ra sản phẩm chính là ethanol, CO2 và các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi như acid acetic, andehyte…Tuy nhiên khi kết thúc quá trình lên men rượu, lượng CO2, ethanol và các hợp chất hữu cơ tạo ra không đáng kể. Đồng thời nhờ hoạt động của vi khuẩn Leuconostoc oenos trong quá trình lên men malolactic tiếp sau đó để chuyển hóa acid malic (di-acid) thành acid lactic (mono- acid) nên pH môi trường tăng nhẹ.
Ở mẫu M1 khi bổ sung đồng thời cả nấm men và vi khuẩn. Ta thấy quá trình lên men malolactic vẫn diễn ra bình thường. Điều này chứng tỏ nấm men và vi khuẩn không xảy ra sự đối kháng. Tuy nhiên, trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, đặc biệt là đường, vi khuẩn Leuconostoc oenos đã sử dụng cơ chất đường để lên men tạo acid lactic, tuy không nhiều nhưng cũng ảnh hưởng đến nguy cơ làm tăng độ chua của vang.
Ở mẫu M2 khi bổ sung vi khuẩn tại thời điểm nấm men đạt pha logarit thì khả năng lên men malolactic là không đáng kể. Biểu thị ở lượng pH thấp hơn so với M1 và M3. Điều này có thể giải thích được do thời điểm này nấm men đang phát triển mạnh nên dẫn tới ức chế sự phát triển của vi khuẩn nên dẫn tới quá trình lên men malolactic diễn ra quá chậm chạp.
Ở mẫu M3 khi chúng tôi bổ sung vi khuẩn vào thời điểm cuối của quá trình len men chính tuy có nhược điểm là lúc này nồng độ cồn khá cao nhưng bù lại quá trình lên men cồn lại không bị ảnh hưởng. Hơn nữa chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn và huấn luyện nên có khả năng chịu độ cồn cao và pH thấp.
3.3.2. Sự thay đổi hàm lượng chất khô
Dựa vào bảng 3.8 và đồ thị 3.11, ta thấy sau quá trình lên men malolactic, hàm lượng chất khô có xu hướng giảm. Tuy nhiên, sự khác biệt này không đáng kể, dao động từ 8,5 xuống 7,5. Hàm lượng chất khô còn lại của mẫu M3 là thấp nhất và cao nhất là mẫu ĐC. Có sự giảm hàm lượng chất khô theo thời gian vì đó là nguồn carbohydate mà nấm men đã dùng. Khi kết thúc quá trình lên men rượu chuyển sang
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 61 Khoa Hóa học & CNTP giai đoạn lên men malolactic, nấm men và ngay cả vi khuẩn vẫn chuyển hóa một lượng nhỏ đường làm cho hàm lượng chất khô giảm nhẹ.
3.3.3. Sự thay đổi độ acid tổng
Qua kết quả, ta thấy đồng thời với sự tăng pH là sự giảm độ acid tổng. Độ acid tổng trước và sau quá trình lên men malolactic giảm có thể được giải thích là do hoạt động của vi khuẩn Leuconostoc oenos chuyển hóa acid malic thành acid lactic có vị chua dịu và có độ acid thấp hơn.
Tương tự như đối với sự thay đổi pH, ở mẫu M2, do nấm men ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn nên quá quá trình lên men malolactic diễn ra rất chậm chạp, khiến cho pH tăng chậm dẫn đến độ acid tổng của mẫu M2 thấp hơn so với M1 và M3.
3.3.4. Sự thay đổi độ cồn
Theo kết quả ở bảng 3.8, ta thấy rằng ở tất cả các mẫu, độ rượu có xu hướng tăng theo thời gian. Tuy nhiên trong quá trình lên men malolactic, độ rượu chỉ tăng nhẹ, không đáng kể. Điều này phù hợp với hàm lượng chất khô giảm nhẹ trong quá trình lên men malolactic. Ở mẫu M1 và M2, khi bổ sung giống nấm men ở thời điểm