Các tác nhân làm trong có thể được phân loại thành một trong các nhóm dưới đây:
‒ Các chất protein: casein, albumin, isinglass, gelatin. ‒ Đất họa tính: các dạng bentonite và các loại khác.
‒ Các polyme với các thành phần trơ hoặc pirridone: nilon, PVPP.
‒ Các chất keo có khả năng hòa tan hạn chế: polysaccharide tự nhiên và các chất kết tủa ferroxyanide cùng các muối của nó.
Mục đích của việc bổ sung các chế phẩm có bản chất protein vào rượu vang nhằm làm dịu và giảm tính chất se lưỡi của rượu vang, nó còn làm giảm màu bằng cách hấp phụ và kết quả các thành phần phenol và tanin. Tất cả các loại protein này đều có bản chất tự nhiên và thường được sử dụng trong thực tế là các dạng tinh khiết. Bốn loại thông dụng nhất hay được áp dụng trong rượu vang là: casein, albumin, isinglass vả gelatin. [8]
Gelatin là sản phẩm thủy phân các gân và da của động vật. Nó được phân loại
như một dẫn xuất colagen và có trọng lượng phân tử lớn [8]. Các gelatin tinh thể được hòa tan trong nước nóng với nhiệt độ 40 – 500C, xử lí cho rượu vang đỏ thì lượng dùng thường thay đổi từ 3 – 10g/l. [8]
Casein là một hồn hợp các protein trong sữa kết tủa bằng acid, phần lớn ở dạng
α và β [8]. Bột casein thường không hòa tan trong nước tinh khiết nhưng hòa tan tốt trong môi trường kiềm. Lượng sử dụng thường là từ 10 – 20g/hl nhưng đôi khi cũng lên 50g/hl.
Albumin là hỗn hợp của các protein lòng trắng trứng: ovalbumin và conalbumin.
Hàm lượng cả avalbumin chiếm 50% trong protein của lòng trắng trứng còn conalbumin chiếm khoảng 15%. Albumin là một nhóm các protein có khả năng hòa tan trong nước, bao gồm albumin huyết thanh bò (BSA) [8]. Đối với lòng trắng trứng tươi thì lượng sử dụng khoảng 3 – 8g/225l rượu (một cái lòng trắng trứng tương ứng với khoảng 4g chất khô). Còn lòng trắng trứng đông lạnh thì khi để hết đông ở nhiệt độ thường thì sử dụng ngay lập tức với lượng 75 – 200ml/hl [8].
Isinglass là protein dạng keo từ thành phần của bong bóng cá, có trọng lượng
phân tử và các đặc tính tương tự như gelatin. Khả năng hòa tan trong nước lạnh của isinglass tốt hơn gelatin. Các tác ngân làm trong thường hòa tan từ 1 – 5% trong nước tùy thuộc vào bản chất của chất làm trong. Trong một số trường hợp nhất định thì hòa tan trong dung dịch muối (NaCl hoặc KCl) hoặc ở pH kiềm (bằng NH4OH). Đặc điểm chung của tất cả các protein này là chúng có điểm đẳng điện gần với dãy pH của rượu vang (Haurowitz, 1963). Do vậy, các chất trợ lắng chỉ có khả năng hòa tan giới hạn trong rượu vang và các phần tử của chúng vận chuyển toàn bộ các điện tích dương,
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 32 Khoa Hóa học & CNTP vì vậy với bất kì lượng protein nào được bổ sung vào mà dư thừa thì sẽ bị loại bỏ bằng tác nhân có bản chất là bentonite. Điểm đẳng điện của protein cũng có tác động đến các chất phức hệ protein – tanin tương ứng sẽ được hình thành (Oh và Hoff, 1987). Các dạng chất tanin hình thành phức hệ hiệu quả ở giá trị pH tương ứng điểm đẳng điện của các protein nhưng kém hiệu quả tại giá trị pH cao hơn. [2]
1.3.2.2. Đất hoạt tính
Bentonite được sử dụng rộng rãi để hấp phụ các thành phần có bản chất là các
protein của rượu vang. Bentonite thường được sử dụng để làm trong rượu vang và dấm.
Bentonite là loại đất tự nhiên với các dạng cấu tạo như: Mg, Ca, Al2O3.5SiO3.nH2O. Nguồn của đất hoạt tính bentonite có tác động không đang kể đến các đặc tính của nó, và sự khác biệt chủ yếu là các tỷ lệ cả các ion Mg2+, Ca2+ và Na+
trong các lưới phân tử. Bentonite được sản xuất ở Đức và Bắc Phi thường được sử dụng tại các nước châu Âu có các dạng Ca2+ trội hơn và kèm theo là hoàn tan trong nước kém hơn và khả năng tiếp nhận protein kém hơn tính theo một đơn vị trọng lượng. Bentonite được sản xuất từ Wyoming thường được sử dụng ở Mỹ ở dạng Na+, hoàn tan trong nước tốt hơn và khả năng nhận protein tốt hơn so với dạng Ca2+.
Bentonite có cấu trúc mà có thể trương nở sau khi tiếp xúc với nước. Sau 2 ngày ngâm trong nước, dung dịch bentonite sẽ có khả năng hấp phụ tốt nhất. Bentonite có bản chất là một chấ trơ với các hợp chất phenol trong rượu vang ngoại trừ các anthocyamin mang điện tích dương. Các đất hoạt tính dạng Na+ có khả năng hấp phụ protein gấp đôi dạng Ca2+ được sử dụng là các tác nhân làm trong rượu vang. Đã là nhiều công trình nghiên cứu để so sáng về hai dạng hợp chất này, tuy nhiên với dạng Na+ thì khả năng hấp phụ trên mỗi đơn vị cặn lắng cao hơn. Khả năng hấp phụ của đất hoạt tính bentonite ở pH = 3,0 cao gấp 3 lần ở pH = 4,5 (Kakob, 1968). Cơ chế trao đổi cation phụ thuộc vào các dạng ion, các ion Na+ hoặc là Ca++ từ bentonite đi vào rượu vang, khi đó nó hấp phụ các protein trong quá trình trao đổi.
Bentonite cũng được coi là các chất trợ lắng để làm trong dịch quả và làm giảm mức độ các chất lắng khác hơn là protein. Chúng có khả năng hấp phụ đáng kể các
amino acid và các thành phần khác trong dịch quả. Các đặc điểm không mong muốn của bentonite là sự kết chặt kém của các cặn lắng của bentonite, điều này có thể khắc phục bằng việc sử dụng trợ lọc diatomit để làm trong rượu vang sau khi xử lí. Bentonite thường trương nở ở trong nước vớ nồng độ 5 – 15%. Bentonite trương nở tốt hơn trong nước ấm [9].
1.3.2.3. Các chất cao phân tử tổng hợp
Các nguyên liệu như polyglyxerin, polyamit (nylon) và các polyvinyl polypyrrolidone (PVPP) là các sản phẩm tổng hợp với các nguyên tử cacbon và oxy có trên bề mặt mà chúng tác dụng như các chất hấp phụ. Cả nylon và PVPP là các chất bột màu trắng không có khả năng hòa tan mà thường được sử dụng trong rượu vang. Do PVPP có khả năng hấp phụ hiệu quả hơn nên nó thường được ưu tiên sử dụng hơn là nylon. Các chất này thường được đưa vào khi xử lí các mẻ, sau đó được lắng và lọc tách khỏi rượu vang rồi thải bỏ [8]. PVPP có ái lực mạnh đối với các hợp chất polyphenol [9], ở Pháp thường sử dụng với hàm lượng cao nhất là 80g/hl. PPVP còn được sử dụng để làm mất màu trực tiếp trong vang trắng hay để loại bỏ các chất màu không mong muốn, nó thường được sử dụng để làm giảm vị se lưỡi và làm mềm các loại rượu vang có lượng tanin cao. Điểm đáng quan tâm trong thực tế đối với các tác nhân làm trong này được thể hiện ở khả năng hấp phụ các chất phenol đơn nhân như: catechin (hay các flavonoid) chiếm ưu thế hơn so vơi các phenol lưỡng phân. Còn đối với các hợp chất mạch dài thì khả năng hấp phụ hiệu quả hơn khi sử dụng các chất trợ lắng có bản chất protein. Các chất catechin thường liên quan tới quá trình nâu hóa trong rượu vang trắng và được xem là các chất đắng đặc thù trong tự nhiên hơn cả ngưỡng cảm nhận mà 20mg/l.
Trên đây là các tác nhân làm trong thường được sử dụng nhất, ngoài ra người ta còn sử dụng một số tác nhân có bản chất keo khác như: các polysaccharide tự nhiên (agar, alginat..), than hoạt tính, huyền phù silicagen…
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 36 Khoa Hóa học & CNTP Dụng cụ: đĩa peptri, ống nghiệm, que cấy, erlen các thể tích, bercher các thể tích, bình định mức, ống đong, đèn cồn, đũa thủy tinh, bộ chưng cất rượu, buret, giá đỡ ống nghiệm, giá sắt, phễu lọc…
Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ sấy, nồi hấp Autoclear, tủ lạnh, máy Vortex, máy đo pH cầm tay, tỉ trọng kế, máy đo OD, kính hiển vi, máy lắc ngang, máy ly tâm 4000 vòng, cân 4 số…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp lên men malolactic (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rượu vang non sau khi qua quá trình lên men ethanol, sẽ được lắng gạn để loại bỏ xác nấm men cũng như thịt quả trong dịch nước cacao ban đầu. Sau khi gắng gạn, kiểm tra các chỉ tiêu của rượu vang non theo bảng 2.1.
Bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos theo tỉ lệ đã được nghiên cứu và tiến hành lên men malolactic ở nhiệt độ từ 15 – 200C trong thời gian 20 ngày.
2.2.2. Phương pháp làm trong rượu
Rượu vang cacao sau quá trình lên men malolactic sẽ tiến hành lắng gạn cặn để loại bỏ xác vi khuẩn và các tiểu phần khác có trong rượu vang.
Bentonite được pha trong thành dung dịch 10% trong nước và được chuẩn bị trước 2 ngày.
Rượng vang sau khi được lắng gạn sẽ được tiến hành làm trong bằng bentonite theo tỉ lệ và thời gian xử lí đã được nghiên cứu.
2.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.4.1. Thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hướng đến sự sinh triển và phát triển của chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos
a. Thí nghiệm 1: khảo sát đường cong sinh trưởng của Leuconostoc oenos.
Vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy trong môi trường MT1 có bổ sung dịch rượu cacao non. Sau 4h tiến hành lấy mẫu pha loãng theo các tỉ lệ từ 10-1 đến 10-8, cấy trải trên đĩa peptri. Ủ đĩa trong 2 ngày sau đó tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện ra để xác định số lượng tế bào trong 1ml huyền phù.
Ngoài ra, quan sát đặc điểm hình thái của chúng qua kính hiển vi.
b. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến sự sinh trưởng của
Leuconostoc oenos.
Chúng tôi sử dụng môi trường cơ bản có bổ sung cồn lần lượt theo các nồng độ: ‒ M1: độ cồn = 0%V
‒ M2: độ cồn = 5%V ‒ M3: độ cồn = 10%V ‒ M4: độ cồn = 12%V ‒ M5: độ cồn = 15%V
Tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy lắc liên tục (120v/p) ở nhiệt độ phòng trong môi trường đã điều chỉnh các độ cồn như trên.
Tiến hành lấy mẫu, pha loãng mẫu với nồng độ 10-1 và đo OD ở bước sóng 600nm theo từng ngày và đánh giá kết quả.
c. Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến sự sinh trưởng
và phát triển của Leuconostoc oenos.
Nguồn nitơ hữu cơ cũng là một thành phần môi trường khá quan trọng ảnh hưởng hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn. Để nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần này đến sự sinh trưởng của Leuconostoc oenos, chúng tôi sử dụng môi trường cơ bản được bổ sung các thành phần nitơ hữu cơ như sau:
‒ M1: môi trường cơ bản bổ sung peptone nồng độ 15g/l ‒ M2: môi trường cơ bản bổ sung cao thịt bò nồng độ 15g/l
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 39 Khoa Hóa học & CNTP ‒ M3: môi trường cơ bản bổ sung cao nấm men nồng độ 15g/l
‒ M4: môi trường cơ bản bổ sung hỗn hợp các nguồn nitơ trên với nồng độ mỗi loại là 15g/l.
Tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy lắc liên tục (120v/p) ở nhiệt độ phòng trong môi trường đã bổ sung các nguồn nitơ như trên.
Tiến hành lấy mẫu, pha loãng mẫu với nồng độ 10-1 và đo OD ở bước sóng 600nm theo từng ngày và đánh giá kết quả.
d. Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển
của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
pH môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và hoạt lực của sinh trưởng của vi sinh vật. Để tìm khoảng pH thích hợp để thu sinh khối, chúng tôi sử dụng môi trường cơ bản điểu chỉnh pH bằng dung dịch acid citric 10%: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
‒ M1: pH = 3 ‒ M2: pH = 3,5 ‒ M3: pH = 4 ‒ M4: pH = 4,5 ‒ M5: pH = 5 ‒ M6: pH = 5,5.
Tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy lắc liên tục (120v/p) ở nhiệt độ phòng trong môi trường đã điều chỉnh pH như trên.
Tiến hành lấy mẫu, pha loãng mẫu với nồng độ 10-1 và đo OD ở bước sóng 600nm theo từng ngày và đánh giá kết quả.
e. Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng của thành phần đường đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của Leuconostoc oenos.
Trong dịch quả nước cacao có các loại đường chính với hàm lượng tương đối lớn, gồm: frutose, glucose và saccharoze. Để tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường đến sự sinh trưởng và phát triển của Leuconostoc oenos, chúng tôi tiến hành sử dụng môi trường cơ bản có bổ sung như sau:
‒ M2: bổ sung đường fructose: 20g/l ‒ M3: bổ sung đường glucose: 20g/l
‒ M4: bổ sung hỗn hợp 3 loại đường trên với nồng độ mỗi loại là: 7g/l. ‒ ĐC: không bổ sung đường.
Tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy lắc liên tục (120v/p) ở nhiệt độ phòng trong môi trường đã bổ sung các loại đường với tỉ lệ như trên.
Tiến hành lấy mẫu, pha loãng mẫu với nồng độ 10-1 và đo OD ở bước sóng 600nm theo từng ngày và đánh giá kết quả.
2.2.4.2. Thí nghiệm khảo sát tỉ lệ giống vi khuẩn thích hợp bổ sung vào dịch vang non trong lên men malolactic
Để bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos vào thực hiện quá trình lên men
malolactic ta cần xác định lượng giống vi khuẩn đưa vào sao cho quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất. Chúng tôi tiến hành bổ sung 3 tỉ lệ giống khác nhau là:
‒ ĐC: không bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos ‒ M1: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 5g/l ‒ M2: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 10g/l ‒ M3: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 15g/l
Các mẫu trên được cấy vào dịch rượu vang cacao non đã lên men rượu 7 ngày và tiến hành lên men malolactic trong 20 ngày.
Trong quá trình lên men và sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic, chúng tôi thu mẫu và kiểm tra các chỉ tiêu: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, độ rượu.
2.2.4.3. Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos trong lên men malolactic.
Sau khi khảo sát có được tỉ lệ giống thích hợp, tiến hành khảo sát thời điểm bổ sung giống vi khuẩn. Dịch nước cacao sau khi được xử lí sẽ điều chỉnh độ Brix đến 25 và pH = 4. Sau đó bổ sung giống nấm men Saccharomyces cerevisiae với tỉ lệ 2%V và bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos với tỉ lệ đã nghiên cứu qua thí nghiệm ở mục 2.4.2.2 với các thời điểm như sau:
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 41 Khoa Hóa học & CNTP ‒ ĐC: mẫu đối chứng, không bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ M1: bổ sung đồng thời cả chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và
chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ M2: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos vào thời điểm nấm men phát
triển ở pha logarit, tức là ngày thứ 3 của quá trình lên men chính.
‒ M3: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos ngày cuối cùng của quá trình
lên men chính, tức là ngày thứ 7 của quá trình lên men cồn.
Quá trình lên men chính là 7 ngày và lên men malolactic là 20 ngày. Sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic, chúng tôi tiến hành các chỉ tiêu về: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, độ rượu sau quá trình lên men.
2.2.4.4. Khảo sát tỉ lệ chất làm trong bentonite
Rượu vang cacao sau khi qua quá trình lên men malolactic có một độ đục nhất định. Để nghiên cứu hiệu quả lắng trong cũng như tốc độ lắng của rượu vang theo thời gian. Chúng tôi sử dụng bentonite được pha thành dung dịch 10% trong nước và
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});