khuẩn Leuconostoc oenos.
Đường cũng là một cơ chất quan trọng trong quá trình phát triển của vi khuẩn
Leuconostoc oenos. Chúng chính là nguồn cung cấp carbohyrate cho các con đường
chuyển hóa của vi khuẩn. Tuy không phải là cơ chất chính trong quá trình lên men malolactic nhưng thành phần đường cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Theo kết quả nghiên cứu của Lê Thị Liên Thanh thì khi môi trường chỉ có fructose hoặc glucose làm cơ chất thì nhận thấy frutose có tác dụng kích thích sinh trưởng mạnh hơn glucose. [2], [5]
Để nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần đường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos, chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường cơ bản có điều chỉnh như sau: M1: bổ sung đường saccharose 20g/l; M2: bổ sung đường fructose 20g/l; M3: bổ sung đường glucose: 20g/l; M4: bổ sung hỗn hợp 3 loại đường trên với nồng độ mỗi loại là: 7g/l; ĐC: không bổ sung đường.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 55 Khoa Hóa học & CNTP Thông thường, so với các loại đường khác, glucose là cơ chất được vi khuẩn lactic sử dụng nhiều hơn cả. Glucose có thể tham gia trực tiếp vào các chu trình như: con đường đường phân, con đường pentose phosphate, con đường phosphoketolase. Còn ở fructose, có hai con đường trao đổi là: lên men lactic dị hình (con đường đường phân) và lên men dị kết hợp (di hình/ mannitol).[1]
Tuy nhiên, ở môi trường M2 chỉ có chứa đường fructose và môi trường M3 chỉ có chứa đường glucose thì vi khuẩn ở M2 sẽ phát triển tốt hơn so với ở M3. Điều này có thể giải thích là do đường fructose có cấu trúc vòng 5, trong quá trình phân giải sẽ nhanh hơn đường glucose có cấu trúc vòng 6 bền hơn. Như vậy có thể nhận thấy rằng, các dạng đường dạng xetora như fructose kích thích sinh trưởng tốt hơn đường dạng andoza như glucose.
Còn đường saccharoze, là loại đường disaccharide, sự chuyển hóa các disaccharide hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Hầu hết các tác giả đều cho rằng vi khuẩn lactic sẽ đồng hóa các loại đường này bằng cách thủy phân chúng thành monosaccharide trước, sau đó các đường đơn này tiếp tục thâm gia vào chuỗi các chuyển hóa đã nói ở trên. Điều này giải thích vì sao vi khuẩn phát triển kém hơn ở môi trường chỉ chứa đường saccharoze. [1]
Như vậy, qua các thí nghiệm trên, điều kiện tốt nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos là nuôi cấy từ 2 – 3 ngày ở nhiệt độ từ 250C, ngoài các yếu tố vi lượng thì các thành phần chủ yếu sẽ bổ sung như sau: fructose 7g/l, glucose 7g/l, saccharose 7g/l, peptone 5g/l, cao thịt bò 5g/l, cao nấm men 5g/l, pH = 5 và độ cồn < 10%V.
Chúng tôi sử dụng môi trường này để nuôi cấy vi khuẩn Leuconostoc oenos lấy sinh khối và nhân giống ở cấp quy mô phòng thí nghiệm trong lên men malolactic nhờ tế bào tự do.
3.2. Tỉ lệ giống thích hợp bổ sung vào dịch vang non.
Dịch cacao sau khi lên men chính 7 ngày sẽ bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc
oenos với các tỉ lệ như sau để tiến hành lên men malolactic như sau: ĐC: không bổ
Theo kết quả trên, ta thấy rằng pH tăng nhẹ từ 3,893 đến 4,001, trong đó mẫu M3 cho giá trị pH cao nhất. Điều này được giải thích là do trong quá trình lên men rượu, nấm men sinh trưởng và phát triển tạo ra sản phẩm chính là ethanol, CO2 và các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi như acid acetic, andehyte…Tuy nhiên khi kết thúc quá trình lên men rượu, lượng CO2, ethanol và các hợp chất hữu cơ tạo ra không đáng kể. Đồng thời nhờ hoạt động của vi khuẩn Leuconostoc oenos trong quá trình lên men malolactic tiếp sau đó để chuyển hóa acid malic (di-acid) thành acid lactic (mono- acid) nên pH môi trường tăng nhẹ.
Ở mẫu M1 khi bổ sung đồng thời cả nấm men và vi khuẩn. Ta thấy quá trình lên men malolactic vẫn diễn ra bình thường. Điều này chứng tỏ nấm men và vi khuẩn không xảy ra sự đối kháng. Tuy nhiên, trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, đặc biệt là đường, vi khuẩn Leuconostoc oenos đã sử dụng cơ chất đường để lên men tạo acid lactic, tuy không nhiều nhưng cũng ảnh hưởng đến nguy cơ làm tăng độ chua của vang.
Ở mẫu M2 khi bổ sung vi khuẩn tại thời điểm nấm men đạt pha logarit thì khả năng lên men malolactic là không đáng kể. Biểu thị ở lượng pH thấp hơn so với M1 và M3. Điều này có thể giải thích được do thời điểm này nấm men đang phát triển mạnh nên dẫn tới ức chế sự phát triển của vi khuẩn nên dẫn tới quá trình lên men malolactic diễn ra quá chậm chạp.
Ở mẫu M3 khi chúng tôi bổ sung vi khuẩn vào thời điểm cuối của quá trình len men chính tuy có nhược điểm là lúc này nồng độ cồn khá cao nhưng bù lại quá trình lên men cồn lại không bị ảnh hưởng. Hơn nữa chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn và huấn luyện nên có khả năng chịu độ cồn cao và pH thấp.
3.3.2. Sự thay đổi hàm lượng chất khô
Dựa vào bảng 3.8 và đồ thị 3.11, ta thấy sau quá trình lên men malolactic, hàm lượng chất khô có xu hướng giảm. Tuy nhiên, sự khác biệt này không đáng kể, dao động từ 8,5 xuống 7,5. Hàm lượng chất khô còn lại của mẫu M3 là thấp nhất và cao nhất là mẫu ĐC. Có sự giảm hàm lượng chất khô theo thời gian vì đó là nguồn carbohydate mà nấm men đã dùng. Khi kết thúc quá trình lên men rượu chuyển sang
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 61 Khoa Hóa học & CNTP giai đoạn lên men malolactic, nấm men và ngay cả vi khuẩn vẫn chuyển hóa một lượng nhỏ đường làm cho hàm lượng chất khô giảm nhẹ.
3.3.3. Sự thay đổi độ acid tổng
Qua kết quả, ta thấy đồng thời với sự tăng pH là sự giảm độ acid tổng. Độ acid tổng trước và sau quá trình lên men malolactic giảm có thể được giải thích là do hoạt động của vi khuẩn Leuconostoc oenos chuyển hóa acid malic thành acid lactic có vị chua dịu và có độ acid thấp hơn.
Tương tự như đối với sự thay đổi pH, ở mẫu M2, do nấm men ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn nên quá quá trình lên men malolactic diễn ra rất chậm chạp, khiến cho pH tăng chậm dẫn đến độ acid tổng của mẫu M2 thấp hơn so với M1 và M3.
3.3.4. Sự thay đổi độ cồn
Theo kết quả ở bảng 3.8, ta thấy rằng ở tất cả các mẫu, độ rượu có xu hướng tăng theo thời gian. Tuy nhiên trong quá trình lên men malolactic, độ rượu chỉ tăng nhẹ, không đáng kể. Điều này phù hợp với hàm lượng chất khô giảm nhẹ trong quá trình lên men malolactic. Ở mẫu M1 và M2, khi bổ sung giống nấm men ở thời điểm bắt đầu lên men rượu và thời điểm nấm men đạt pha logarit, độ rượu thấp hơn so với ở mẫu M3 là thời điểm kết thúc quá trình lên men rượu. Tuy các giá trị biểu thị độ còn chênh lệch nhau không nhiều, khoảng từ 11,35 đến 11,75 nhưng cũng cho thấy vi khuẩn cũng tác động nhỏ đến quá trình lên men rượu. Điều này có thể giải thích do vi khuẩn sử dụng cơ chất đường để lên men tạo acid lactic, dẫn đến nấm men sử dụng ít cơ chất đường để lên men rượu hơn, cuối cùng độ rượu thấp hơn.
Qua các kết quả trên, ta thấy rằng, thời điểm bổ sung giống thích hợp nhất là sau quá trình lên men rượu.
3.4. Tỉ lệ chất làm trong bentonite
Sau khi lên men rượu và lên men malolactic, rượu vang thường bị đục. Hiện tượng đục là một dung dịch có mặt các tiểu phần và các chất lơ lửng mà nó làm chệch ánh sáng từ hướng đi thông thường, nó là một nhân tố gây ảnh hưởng không tốt khi đánh giá chất lượng rượu vang. Do đó, việc đo độ trong có liên quan đến việc xác
‒ A là mẫu rượu cacao không qua lên men malolactic. ‒ B là mẫu rượu cacao đã qua lên men malolactic. Kết quả cho thấy như sau:
‒ Về độ trong: Mẫu B và mẫu A không có quá nhiều sự khác biệt về độ trong.
‒ Về màu sắc: Mẫu B cho màu nâu cánh gián tương đẹp, còn mẫu A cho màu sắc nhợt nhạt. Điều này là do trong quá trình lên men malolactic, vi khuẩn
Leuconostoc oenos trong quá trình lên men sinh ra các hợp chất polyphenol, các hợp
chất gây màu và cả màu của môi trường nuôi cấy và huẩn luyện vi khuẩn.
‒ Về mùi vị đặc trưng: Cả mẫu A và B đều có hương vị đặc trưng của cacao. Tuy nhiên, mẫu B cho mùi vị thơm hơn so với mẫu A. Điều này do trong quá trình lên men malolactic sinh ra các este có mùi thơm, cũng như trong qúa trình làm trong bằng bentonite, bentonite hấp phụ các anthoctanin liên kết (chỉ số PVP) và chủ yếu là các phân thử tanin lớn (chỉ số thẩm tách và EtOH), các phân tử tanin trùng hợp (chỉ số HCl). Kết quả là các chỉ số này giảm tương ứng với việc rượu vang có hương thơm dịu hơn.
‒ Về độ chua: Mẫu B cho độ chua dịu nhẹ, hài hòa và không bị gắt như mẫu A. Điều này chứng tỏ hiệu quả của quá trình lên men malolactic, lượng acid malic giảm làm cho rượu không bị chua gắt.
Kết luận: rượu vang sau khi trải qua quá trình lên men malolactic đã làm chất lượng của rượu tốt hơn biểu thị qua sự thay đổi tích cực của độ trong, mùi vị, màu sắc và độ chua dịu hơn.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 66 Khoa Hóa học & CNTP
Chương 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ những nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra được một số kết quả về quá trình lên men malolactic trong sản xuất rượu vang cacao như sau:
‒ Lựa chọn được môi trường nuôi cấy và huấn luyện chủng vi khuẩn
Leuconostoc oenos. Kết quả thu được chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos cho sinh
khối và phát triển tốt nhất khi nuôi cấy từ 2 – 3 ngày và trong 1 lít môi trường ngoài các thành phần dinh dưỡng cơ bản thì được bổ sung thêm cao thịt bò 5g, cao nấm men 5g, peptone 5g, glucose 7g, fructose 7g, saccharose 7g, điểu chỉnh pH = 5 và độ cồn < 10%V.
‒ Xây dựng được quy trình công nghệ lên men malolactic nhờ tế bào vi khuẩn tự do: nhiệt độ lên men: 200C, thời điểm bổ sung giống vi khuẩn: kết thúc quá trình lên men rượu, nồng độ vi khuẩn: 5 – 10g sinh khối ẩm/ lít (nồng độ tế bào trong huyền phù là 109CFU/ml).
‒ Nghiên cứu sử dụng chất làm trong rượu vang là bentonite với nồng độ thích hợp là 2 – 3g/l. Thời gian xử lí là 6 - 8 ngày với nhiệt độ tàng trữ là 10 – 150C. ‒ Nghiên cứu khả năng phân giải acid citric của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ Sau khi tối ưu các điều kiện, tiến hành lên malolactic và tàng trữ. Chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan và nhận thấy: chất lượng cảm quan của rượu sau khi lên men malolactic đã được cải thiện, đặc biệt là về mùi vị. Rượu sau quá trình lên men malolactic có vị chua hài hòa hơn mà vẫn giữ được hương vị đặc trưng của rượu cacao và có màu nâu cánh gián đẹp mắt và ổn định. Đồng thời kết quả kiểm tra vi sinh cũng cho thấy sản phẩm đạt tiêu chuẩn Việt Nam về mặt vi sinh.
4.2. Kiến nghị
Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi chỉ thực hiện một số khía cạnh của quá trình lên men malolactic rượu vang cacao. Cho nên, chúng tôi thấy cần có những nghiên cứu tiếp theo về đề tài này là:
‒ Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng acid malic và acid lactic đến quá trình sinh trưởng và phát triển cũng như hoạt độ enzym của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ Khảo sát các phương pháp cố định Leuconostoc oenos trên chất mang BC. ‒ Khảo sát lên men malolactic bằng phương pháp cố định tế bào vi khuẩn
Leuconostoc oenos.
‒ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ hiệu quả lắng.
‒ Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất rượu vang cacao theo quy mô pilot.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 68 Khoa Hóa học & CNTP
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Ngô Lâm Tuấn Anh (2007). Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Bách khoa TP. HCM.
[2] Đặng Hồng Ánh (2004). Sản xuất rượu vang chất lượng cao, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước, Viện Công nghệ Thực phẩm, Hà Nội.
[3] Lê Văn Việt Mẫn (2010). Thí nghiệm Vi sinh vật học thực phẩm, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh, trang 28 – 33.
[4] Trịnh Xuân Ngọ (2009). Cây cacao và kĩ thuật chế biến, NXB Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh.
[5] Lê Thị Liên Thanh (1997). Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý và hóa sinh của
leuconostoc oenos ứng dụng trong sản xuất rượu vang, Luận án TSKH, Đại học Bách
Khoa Hà Nội.
[6] M. Victoria Moreno-Arribas (2009). Wine Chemistry and Biochemistry, Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC), Madrid Spain.
[7] Claude Racine (2005). Malolactic fermentation in wine, Lallemand Inc. Montréal, Canada.
[8] P. Rib´ ereau-Gayon, Y. Glories, A. Maujean, D. Dubourdieu (2006). The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments 2nd Edition, John Wiley & Sons Ltd,
The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex PO19 8SQ, England.
[9] Kaewkanlaya Wongkalasin [2004]. Selection of malolactic bacteria for wine fermentation, Degree of Master of Science in Microbiology, Suranaree University of
Technology, 2004.
[10] Guoqiang Zhang (2013). The essential amino acids requirements for Oenococcus Oeni growth and organic acids metabolism, African Journal of
Microbiology Research, Vol . 7(16), pp. 1592.
[11] L.M.T. Dicks, H. Schoeman, M.A. Vivier, J.S. Pretorius, Taxonomy of malolactic bacteria and biological control of spoilage microorganisms in wine.
International workshop held in Verona on April 17th 1998 organized by Lallemand, p.9-16.
[12] W.J. Kelly, R.V. Asmundson, D.H. Hopcroft (1989). Growth of Leuconostoc oenos under Anaerobic conditions. Am. J. Enol.Vitic., Vol. 40, No.4.
[13] http://www.labm.com/products/m-r-s-agar-de-man-rogosa-and-sharpe-agar/. [14] http://www.ehow.com/how-does_5462404_alcohol-kill-bacteria.html. [15] http://voer.edu.vn/m/anh-huong-cua-cac-nhan-to-moi-truong-den-su-sinh- truong-cua-vi-sinh-vat/56fdad04 [16] http://trangvangnongnghiep.com/giong-ca-cao-moi/5277-mot-so-giong- ca-cao-moi.html#.UxvIc5AarNs
[17] Nguyễn Hoàng Dũng. Giáo trình thực hành đánh giá cảm quan, Trường Đại học Bách khoa TP. Hồ Chí Minh, tháng 7/2014, https://www.academia.edu/5521040/Thuc_hanh_danh_gia_cam_quan
[18] http://dicionariosaude.com/lactobacillus/
[19] http://parasites.czu.cz/food/parasite.php?idParasite=43
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học Khoa Hóa học & CNTP
PHỤ LỤC
Phụ lục A
MẪU PHIẾU TRẢ LỜI
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CẢM QUAN SẢN PHẨM Phương pháp so sánh cặp
Họ và tên người thử:...Giới tính:…….. Nghề nghiệp:...Tuổi:………… Ngày thử:... Bạn nhận được một cặp mẫu sản phẩm (mẫu A, mẫu B). Bạn hãy đánh giá giữa 2 mẫu đó có gì khác nhau về các tính chất sau đây:
Tính chất cảm quan Mẫu
Trạng thái sản phẩm (độ trong) Màu sắc
Mùi đặc trưng của cacao Vị chua hài hòa
Mẫu A: rượu chưa lên men malolactic Mẫu B: rượu đã lên men malolactic
Kết luận: Bạn thích mẫu nào hơn? (mẫu A, mẫu B): …….. Ghi chú:
‒ Nếu đặc tính mẫu này tốt hơn mẫu kia (kí hiệu >). ‒ Nếu đặc tính mẫu này kém hơn mẫu kia (kí hiệu <). ‒ Nếu đặc tính hai mẫu này tương đương nhau (kí hiệu =).
DANH SÁCH THÀNH VIÊN HỘI ĐỒNG CẢM QUAN 1. KS. Nguyễn Chí Thuần.
2. KS. Nguyễn Văn Tới. 3. CN. Nguyễn Minh Nhựt. 4. Lê Đình Chí Công. 5. Hoàng Thái Hà. 6. Nguyễn Tiến Thành. 7. Lương Đức Vỉnh. 8. Nguyễn Thị Hằng. 9. Lê Thị Hồng Hương. 10. Lê Việt Trinh.
Phụ lục B
KẾT QUẢ CẢM QUAN PHEP THỬ SO SÁNH CẶP
Mục đích: So sánh cặp mẫu rượu A và B với các chỉ tiêu: độ trong, màu sắc,