2.2.4.1. Thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hướng đến sự sinh triển và phát triển của chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos
a. Thí nghiệm 1: khảo sát đường cong sinh trưởng của Leuconostoc oenos.
Vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy trong môi trường MT1 có bổ sung dịch rượu cacao non. Sau 4h tiến hành lấy mẫu pha loãng theo các tỉ lệ từ 10-1 đến 10-8, cấy trải trên đĩa peptri. Ủ đĩa trong 2 ngày sau đó tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc xuất hiện ra để xác định số lượng tế bào trong 1ml huyền phù.
Ngoài ra, quan sát đặc điểm hình thái của chúng qua kính hiển vi.
b. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến sự sinh trưởng của
Leuconostoc oenos.
Chúng tôi sử dụng môi trường cơ bản có bổ sung cồn lần lượt theo các nồng độ: ‒ M1: độ cồn = 0%V
‒ M2: độ cồn = 5%V ‒ M3: độ cồn = 10%V ‒ M4: độ cồn = 12%V ‒ M5: độ cồn = 15%V
Tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy lắc liên tục (120v/p) ở nhiệt độ phòng trong môi trường đã điều chỉnh các độ cồn như trên.
Tiến hành lấy mẫu, pha loãng mẫu với nồng độ 10-1 và đo OD ở bước sóng 600nm theo từng ngày và đánh giá kết quả.
c. Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến sự sinh trưởng
và phát triển của Leuconostoc oenos.
Nguồn nitơ hữu cơ cũng là một thành phần môi trường khá quan trọng ảnh hưởng hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn. Để nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần này đến sự sinh trưởng của Leuconostoc oenos, chúng tôi sử dụng môi trường cơ bản được bổ sung các thành phần nitơ hữu cơ như sau:
‒ M1: môi trường cơ bản bổ sung peptone nồng độ 15g/l ‒ M2: môi trường cơ bản bổ sung cao thịt bò nồng độ 15g/l
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 39 Khoa Hóa học & CNTP ‒ M3: môi trường cơ bản bổ sung cao nấm men nồng độ 15g/l
‒ M4: môi trường cơ bản bổ sung hỗn hợp các nguồn nitơ trên với nồng độ mỗi loại là 15g/l.
Tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy lắc liên tục (120v/p) ở nhiệt độ phòng trong môi trường đã bổ sung các nguồn nitơ như trên.
Tiến hành lấy mẫu, pha loãng mẫu với nồng độ 10-1 và đo OD ở bước sóng 600nm theo từng ngày và đánh giá kết quả.
d. Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển
của vi khuẩn Leuconostoc oenos.
pH môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và hoạt lực của sinh trưởng của vi sinh vật. Để tìm khoảng pH thích hợp để thu sinh khối, chúng tôi sử dụng môi trường cơ bản điểu chỉnh pH bằng dung dịch acid citric 10%:
‒ M1: pH = 3 ‒ M2: pH = 3,5 ‒ M3: pH = 4 ‒ M4: pH = 4,5 ‒ M5: pH = 5 ‒ M6: pH = 5,5.
Tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy lắc liên tục (120v/p) ở nhiệt độ phòng trong môi trường đã điều chỉnh pH như trên.
Tiến hành lấy mẫu, pha loãng mẫu với nồng độ 10-1 và đo OD ở bước sóng 600nm theo từng ngày và đánh giá kết quả.
e. Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng của thành phần đường đến khả năng sinh
trưởng và phát triển của Leuconostoc oenos.
Trong dịch quả nước cacao có các loại đường chính với hàm lượng tương đối lớn, gồm: frutose, glucose và saccharoze. Để tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường đến sự sinh trưởng và phát triển của Leuconostoc oenos, chúng tôi tiến hành sử dụng môi trường cơ bản có bổ sung như sau:
‒ M2: bổ sung đường fructose: 20g/l ‒ M3: bổ sung đường glucose: 20g/l
‒ M4: bổ sung hỗn hợp 3 loại đường trên với nồng độ mỗi loại là: 7g/l. ‒ ĐC: không bổ sung đường.
Tế bào vi khuẩn Leuconostoc oenos được nuôi cấy lắc liên tục (120v/p) ở nhiệt độ phòng trong môi trường đã bổ sung các loại đường với tỉ lệ như trên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành lấy mẫu, pha loãng mẫu với nồng độ 10-1 và đo OD ở bước sóng 600nm theo từng ngày và đánh giá kết quả.
2.2.4.2. Thí nghiệm khảo sát tỉ lệ giống vi khuẩn thích hợp bổ sung vào dịch vang non trong lên men malolactic
Để bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos vào thực hiện quá trình lên men
malolactic ta cần xác định lượng giống vi khuẩn đưa vào sao cho quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất. Chúng tôi tiến hành bổ sung 3 tỉ lệ giống khác nhau là:
‒ ĐC: không bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos ‒ M1: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 5g/l ‒ M2: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 10g/l ‒ M3: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos với nồng độ 15g/l
Các mẫu trên được cấy vào dịch rượu vang cacao non đã lên men rượu 7 ngày và tiến hành lên men malolactic trong 20 ngày.
Trong quá trình lên men và sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic, chúng tôi thu mẫu và kiểm tra các chỉ tiêu: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, độ rượu.
2.2.4.3. Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos trong lên men malolactic.
Sau khi khảo sát có được tỉ lệ giống thích hợp, tiến hành khảo sát thời điểm bổ sung giống vi khuẩn. Dịch nước cacao sau khi được xử lí sẽ điều chỉnh độ Brix đến 25 và pH = 4. Sau đó bổ sung giống nấm men Saccharomyces cerevisiae với tỉ lệ 2%V và bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos với tỉ lệ đã nghiên cứu qua thí nghiệm ở mục 2.4.2.2 với các thời điểm như sau:
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 41 Khoa Hóa học & CNTP ‒ ĐC: mẫu đối chứng, không bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ M1: bổ sung đồng thời cả chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và
chủng vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ M2: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos vào thời điểm nấm men phát
triển ở pha logarit, tức là ngày thứ 3 của quá trình lên men chính.
‒ M3: bổ sung vi khuẩn Leuconostoc oenos ngày cuối cùng của quá trình
lên men chính, tức là ngày thứ 7 của quá trình lên men cồn.
Quá trình lên men chính là 7 ngày và lên men malolactic là 20 ngày. Sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic, chúng tôi tiến hành các chỉ tiêu về: pH, hàm lượng chất khô (oBrix), độ acid toàn phần, độ rượu sau quá trình lên men.
2.2.4.4. Khảo sát tỉ lệ chất làm trong bentonite
Rượu vang cacao sau khi qua quá trình lên men malolactic có một độ đục nhất định. Để nghiên cứu hiệu quả lắng trong cũng như tốc độ lắng của rượu vang theo thời gian. Chúng tôi sử dụng bentonite được pha thành dung dịch 10% trong nước và được chia với các tỉ lệ khác nhau từ 0 – 5g/l bổ sung vào rượu vang cacao đã lên men malolactic.
Tiến hành lấy mẫu và đo OD theo từng ngày để xác định độ trong và tốc độ lắng trong theo thời gian.