1.2.6.1. Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic trong quá trình lên men malolactic.
Vi khuẩn malolactic có mặt trong tất cả các nước cacao và rượu vang. Tùy thuộc vào giai đoạn của quá trình làm rượu vang, điều kiện môi trường mà chúng sẽ xác định khả năng sinh sản của chính mình. Khi phát triển, chúng chuyển hóa một số lượng lớn các chất. Vì thế mà vi khuẩn malolactic đóng một vai trò quan trọng trong
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 18 Khoa Hóa học & CNTP giai đoạn này chất dinh dưỡng đã bị nấm men sử dụng gần như cạn kiệt để tạo ra ethanol, vì thế mà lượng ethanol này có thể gây ức chế và kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn malolactic. Sự thích nghi của vi khuẩn malolactic phụ thuộc vào quá trình xử lí nguyên liệu.
‒ Pha tăng trưởng (pha log): trong pha này hầu hết các vi khuẩn malolactic
đã thích nghi và sẽ tăng trưởng với tốc độ sinh trưởng cực đại. Các tế bào còn sống sẽ bắt đầu nhân lên đến khi sinh khối đạt ổn định và acid malic bắt đầu suy giảm trong pha này, chất dinh dưỡng chủ yếu được sử dụng để xây dựng vật chất tế bào và sinh sản.
‒ Pha cân bằng: trong pha này số lượng tế bào sống là ổn định, acid malic
hầu như được phân giải hoàn toàn.
‒ Pha suy vong: các tế bào sống bắt đầu già đi, giảm dần và tế bào chết tăng
lên, xuất hiện hiện tượng tự phân do các enzyme protease nội bào.
Trong những ngày đầu của quá trình lên men rượu, vi khuẩn và nấm men đều sinh sản. Sau đó, chúng bắt đầu thích nghi hơn với môi trường và nhanh chóng tăng số lượng. Trong suốt thời gian này, vi khuẩn vẫn tiếp tục sinh sản để tăng số lượng nhưng bị giới hạn khi mật độ tế bào đạt 104 đến 105 CFU/ml. Việc tăng mật độ tế bào phụ thuộc vào pH môi trường. Vi khuẩn malolactic đóng vai trò quan trọng trong lên men malolactic, chúng thường diễn ra sau khi nấm men đã hoàn tất quá trình lên men rượu, khi đó mật độ tế bào đạt 106 CFU/ml (Lonvaud-Funel, 1999; Osborn et al., 2000; Versari et al., 1999) [8].
suy vong, nhường chỗ cho vi khuẩn malolactic phát triển. Một phần nấm men chết đi có thể bị tự phân. Hiện tượng tự phân của nấm men là hiện tượng các thành phần của xác tế bào nấm men bị phân giải dưới tác dụng của enzyme thủy phân (hydrolase) của chính bản thân tế bào. Trong quá trình này, hầu hết các protein, acid nucleic, lipid và các vật chất của tế bào đều bị phân giải thành những chất có phân tử lượng thấp hơn và hòa tan vào môi trường. Điều kiện để hiện tượng tự phân của tế bào xảy ra là tế bào đã chết nhưng vẫn còn giữ được hoạt tính của các enzyme hydrolase. Trong sản xuất rượu vang truyền thống, người ta có thể tận dụng xác nấm men tự phân làm nguồn cung cấp một số chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn lên men malolactic phát triển.
1.2.6.3. Sự tương tác giữa vi khuẩn malolactic và nấm men
Sự tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất rượu vang. Bên cạnh việc nghiên cứu, tuyển chọn những giống vi khuẩn malolactic có khả năng thích nghi cao và lên men malolactic tốt, ta còn phải nghiên cứu những tương tác có lợi giữa nấm men và vi khuẩn nhằm mục đích tăng cường khảnăng chống chịu của vi khuẩn trước những ảnh hưởng bất lợi của môi trường. Đã có khá nhiều nghiên cứu về vấn đề tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic.
Những nghiên cứu trên đều chỉ ra được các loại tương tác khác nhau (kích thích, kìm hãm, trung lập) giữa vi khuẩn malolactic và nấm men.
Mức độ của những tương tác này còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm sự tương tác của từng tổ hợp chủng nấm men vi khuẩn malolactic cụ thể, sự hấp thụ và giải phóng các chất dinh dưỡng bởi nấm men, sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào có khả năng kích thích hoặc gây độc đối với vi khuẩn malolactic.
Khi xét ảnh hưởng tương tác giữa nấm men và vi khuẩn malolactic ta thường đề cập đến 2 khía cạnh chính:
Nhiều chủng nấm men có khả năng gây nên những tác động kích thích hoặc kìm hãm đến sự sinh trưởng và khả năng lên men vi khuẩn malolactic:
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 22 Khoa Hóa học & CNTP Một vài loài nấm men có khả năng góp phần vào quá trình lên men malolactic, nhưng vai trò này đã bị phủ định bởi chức năng chính của nấm men là chuyển hóa chất dinh dưỡng thành cồn. Cơ chế tương tác mang tính chất ức chế của nấm men đến vi khuẩn malolactic vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng. Tuy nhiên đã có nghiên cứu cho thấy rằng những ảnh hưởng của nấm men lên vi khuẩn là hạn chế sự phát triển và tồn tại do sản phẩm tạo ra hay sự cạnh tranh chất dinh dưỡng của nấm men. Những nghiên cứu của Lallemand ở phòng thí nghiệm cho biết nấm men tạo chất kháng khuẩn làm hạn chế sự phát triển của Leuconostoc oenos và các vi khuẩn lactic khác. Chất kháng khuẩn này là các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào của nấm men như ethanol, SO2, các acid béo mạch trung bình và protein. Đó là các chất kháng khuẩn tự nhiên.
‒ Ethanol có khả năng ức chế các vi khuẩn nói chung kể cả vi khuẩn malolactic. Người ta thấy rằng đối với vi khuẩn malolactic, ethanol tác dụng mạnh mẽ lên sự sinh trưởng nhưng ít ảnh hưởng đến khả năng lên men malolactic của vi khuẩn này. Theo Capucho và San Romao (1994): ở nồng độ 4% (v/v), ethanol đã có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic nhưng khả năng phân giải acid malic của vi khuẩn vày vẫn đạt được 95%.
‒ SO2 sinh ra từ nấm men cùng với SO2 được cho vào từ quá trình sulfite hóa dịch nho ban đầu là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự ức chế vi khuẩn malolactic và kéo dài thời gian lên men. Người ta thấy rằng, hầu hết các chủng nấm men có khả năng tổng hợp được SO2 với hàm lượng lên đến 30mg/l, một số ít có thể sinh ra SO2 nhiều hơn, thậm chí hơn 100mg/l.
‒ Các acid béo mạch trung bình như acid decanoic, dodecanoic, hexanoic, octanoic… cũng có khả năng ức chế sinh trưởng và khả năng lên men malolactic vi khuẩn lactic, cụ thể: acid decanoic có khả năng ức chế cả nấm men lẫn vi khuẩn malolactic (Edwards và Beelman, 1987; Edwards và cộng sự, 1990; Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988). Đối với hỗn hợp acid decanoic và dodecanoic, Capucho và San Ronao(1994) đã chứng minh rằng, hàm lượng thấp của các acid này (12,5mg/l decanoic và 2,5 mg/l dodecanoic) kích thích khả năng lên men malolactic của vi
khuẩn nhưng ở hàm lượng cao hơn thì xảy ra theo chiều hướng ngược lại. Sự có mặt đồng thời của các acid hexanoic, octanoic và decanoic có thể gây tác động ức chế đến sinh trưởng và lên men malolactic mạnh hơn so với khi chỉ tồn tại riêng lẻ từng loại acid béo (Lonvaud-Funel và cộng sự, 1988).
‒ Sự tạo thành các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cũng đã được nghiên cứu. Theo nghiên cứu của Dick và cộng sự (1992), các hợp chất này có bản chất là protein tích điện âm. Tuy nhiên khả năng này cũng phụ thuộc vào từng chủng và có ít những nghiên cứu sâu về lĩnh vực này đối với các chủng nấm men khác nhau trong sản xuất rượu vang (H.Alexandre và cộng sự, 2004).
‒ Bên cạnh khả năng ức chế bởi các chất có hoạt tính sinh học và các chất kháng khuẩn tự nhiên, sự ức chế vi khuẩn malolactic bởi nấm men còn do sự cạn kiệt về nguồn chất dinh dưỡng. Các chất này được nấm men sử dụng trong giai đoạn sinh trưởng và lên men ethanol. Kết quả là sau khi kết thúc quá trình lên men ethanol và bắt đầu lên men malolactic, các chất sinh trưởng như amino acid, vitamin hầu như không còn đủ cho vi khuẩn malolactic phát triển.
b. Kích thích vi khuẩn malolactic sinh trưởng bởi nấm men
Tác động kích thích lên vi khuẩn malolactic của nấm men ít được nghiên cứu hơn. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Fornachon (1968), sự kích thích khả năng lên men malolactic của vi khuẩn có liên quan đến hiện tượng tự phân của nấm men. Khi nấm men tự phân sẽ giải phóng vào dịch lên men một lượng các hợp chất nitơ gồm các acid amin, peptide, protein và vitamin. Ngoài ra những phân tử lớn khác như glucan, mannoprotein cũng được giải phóng trong quá trình tự phân nấm men và kích thích sự phát triển của vi khuẩn. Các hợp chất này rất cần thiết cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn malolactic trong vang, cụ thể:
‒ Các phân đoạn nitơ khác nhau sinh trưởng vi khuẩn malolactic: Hiện nay vẫn chưa có một kết luận chính thức nào về khả năng sử dụng và chuyển hóa các loại peptide ở các vi khuẩn malolactic. Tuy nhiên, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy sự ảnh hưởng của các phân đoạn protein từ dịch tự phân nấm men trong môi trường vang đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic. Các nghiên cứu trên đều
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 24 Khoa Hóa học & CNTP cho thấy, khi sử dụng các phân đoạn nitơ khác nhau gồm các phân đoạn có phân tử lượng lần lượt là <0,5; 0;5 –1;0; 1 – 10; >10kDa thì các acid amin tự do và đoạn peptide có phân tử lượng <1kDa có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn rất tốt so với các phân đoạn có phân tử lượng lớn hơn gồm các đại phân tử >10kDa và các đoạn peptide 1 – 10kDa (Feuillat và cộng sự, 1977; Guilloux-Benetier và Chassagne, 2003). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
‒ Vai trò của hợp chất nitơ cao phân tử đối với hoạt tính enzyme thủy phân protein của vi khuẩn malolactic: Nghiên cứu của Lonvaud-Funel và cộng sự (1988) lại cho thấy rằng các phân đoạn protein có phân tử lượng >12kDa cũng đóng vai trò như một chất cảm ứng và góp phần quan trọng trong việc làm tăng hoạt tính của các enzyme exoprotease của vi khuẩn malolactic. Trên cơ sở đó, nghiên cứu của Guilloux - Benetier (1993, 1995) đã cho thấy ảnh hưởng của các hợp chất cao phân tử sinh ra từ quá trình tự phân của nấm men đối với sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic. Những chất này gồm các polysaccharide thành tế bào và các phân tử protein. Việc bổ sung các hợp chất cao phân tử từ dịch chiết nấm men vào canh trường lên men malolactic có khả năng kích thích hoạt tính các enzyme aminopeptidase ở
Leuconostoc oenos. Do vậy, vi khuẩn này có thể thủy phân được các phân đoạn nitơ
cao phân tử có trong vang ở cuối giai đoạn lên men chính. Nhờ đó, nó góp phần giúp rút ngắn pha thích nghi và làm tăng tốc độ tổng hợp sinh khối của vi khuẩn malolactic. Nghiên cứu của Farias và Manca de Nadra (2000) cũng đã làm sáng tỏ khả năng phân giải các phân đoạn protein ở vi khuẩn Leuconostoc oenos có khả năng làm tăng hàm lượng các amino acid và peptide trong dịch lên men rượu vang.
c. Sự ức chế nấm men bởi vi khuẩn Malolactic:
Sự có mặt của các chủng vi khuẩn malolactic hoạt động mạnh có thể không ảnh hưởng đến nấm men ở pha sinh trưởng. Nhưng đến giai đoạn suy vong, nó làm tăng tốc độ chết của nấm men do hình thành nên các chất ức chế hoặc làm cạn kiệt các chất dinh dưỡng và các yếu tố sinh trưởng cần thiết của nấm men. Do vậy, sự ức chế nấm men bởi vi khuẩn malolactic chỉ có thể xảy ra ở giai đoạn cuối trước khi kết thúc
quá trình lên men chính. Các nguyên nhân dẫn đến sự ức chế này có thể giải thích theo các cơ chế sau:
‒ Cơ chế thứ nhất liên quan đến khả năng ức chế nấm men bởi các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn malolactic như propionate và acetate. Ngoài ra sự sinh trưởng của vi khuẩn còn làm tổn thất một lượng đáng kể carbohydrate cần thiết cho nấm men. Từ đó làm giảm tốc độ sinh tổng hợp ethanol và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
‒ Cơ chế thứ hai để giải thích cho khả năng ức chế nấm men của vi khuẩn malolactic là chúng có khả năng phân giải thành tế bào nấm men nhờ enzyme β-1.3- glucanase (Guilloux-Benatier và cộng sự, 2000).
‒ Cuối cùng, sự hình thành các độc tố bacteriocin của vi khuẩn malolactic cũng được xem là một tác nhân gây ức chế nấm men (Yurdugul và Bozoglu, 2002). Tuy nhiên, khả năng này vẫn chưa được giải thích một cách rõ ràng.
1.2.6.4. Ảnh hưởng của điều kiện công nghệ và môi trường đến quá trình lên men malolactic
a. Ảnh hưởng của pH
pH có ảnh hưởng rất sâu sắc đến sinh trưởng, phát triển, cũng như khả năng phân giải acid malic của Leuconostoc oenos. Đây là yếu tố quyết định đến tiến trình lên men malolactic, pH tối ưu cho quá trình lên men malolactic tùy thuộc vào chủng và môi trường nuôi cấy. Khoảng pH tối ưu cho sự phát triển cũng như phân giải acid malic của các chủng vi khuẩn là rất khác nhau ngay cả trong cùng một loài. Vi khuẩn
Leuconostoc oenos có thể phát triển được bắt đầu từ pH = 2,9 nhưng pH tối ưu cho
sự phát triển của chủng vi khuẩn này lại là 4,5 – 6,5. Sở dĩ vi khuẩn Leuconostoc oenos chuyển hóa được acid malic thành acid lactic vì trong tế bào của nó có chứa
enzyme malolactic. Do bản chất của enzyme là protein nên hoạt lực của nó chỉ phù hợp với một số khoảng pH nhất định, nếu không sẽ xảy ra hiện tượng keo tụ hoặc biến tính protein và sẽ dẫn tới mất hoạt lực enzyme.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT
Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 28 Khoa Hóa học & CNTP Nguồn nitơ có ảnh hưởng khá nhiều đến sự phát triển của Leuconostoc oenos.
Tuy nhiên, trong quá trình lên men malolactic thì nguồn dinh dưỡng nitơ trong môi trường rất dồi dào do sau khi kết thúc quá trình lên men rượu, lượng nấm men còn lại trong vang non sẽ tự phân (do trong tế bào của chúng có chứa hệ enzyme thủy phân protein), nguồn nitơ tự phân của nấm men là một nguồn đạm rất lí tưởng cho sự phát triển của Leuconostoc oenos.
e. Ảnh hưởng của thành phần đường [2]
Đường cũng là một cơ chất quan trọng trong quá trình phát triển của vi khuẩn
Leuconostoc oenos. Chúng chính là nguồn cung cấp carbohyrate cho các con đường
chuyển hóa của vi khuẩn. Tuy không phải là cơ chất chính trong quá trình lên men malolactic nhưng thành phần đường cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Theo kết quả nghiên cứu của Lê Thị Liên Thanh thì khi môi trường chỉ có fructose hoặc glucose làm cơ chất thì nhận thấy frutose có tác dụng kích thích sinh trưởng mạnh hơn glucose.
f. Ảnh hưởng của acid malic và các acid hữu cơ khác [2]
Các acid hữu cơ chủ yếu trong dịch vang non là: acid malic, acid lactic, acid citric. Ngoài ra còn có lượng nhỏ các acid khác như: acid tartaric. Các acid này ảnh hưởng đến vi khuẩn Leuconostoc oenos như sau:
‒ Acid malic: là chất cảm ứng cho sự hình thành enzyme malolactic, vì vậy trong môi trường buộc phải có thành phần này. Nếu chỉ xét về mặt sinh trưởng và phát triển thì acid malic hầu như không có tác dụng gì trong việc kích thích sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Leuconostoc oenos, kể cả hai dạng L và D, thậm chí còn có tác dụng ức chế khi nồng độ vượt quá 10g/l. Như vậy sự có mặt của acid malic là cần thiết để làm chất cảm ứng nhằm thu được vi khuẩn Leuconostoc oenos có hoạt lực malolactic cao nhưng chỉ trong giới hạn nồng độ cho phép để không gây ức chế cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng, các nghiên cứu cho thấy nồng độ acid malic cho hoạt độ malolactic của vi khuẩn cao nhất là 10g/l đối với dạng