5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
2.3.3.9.Biến nạp bằng xung điện
Vector tái tổ hợp được biến nạp bằng xung điện vào P. pastoris GS115 và hội nhập với genome của nấm men tại điểm AOX1 (hình 2.2).
Chuẩn bị tế bào khả biến P. pastoris GS115: Chủng P. pastoris được nuôi cấy trong môi trường YPG lỏng, lắc 200 rpm ở 30°C qua đêm. Tiếp giống 0,2% trong 20 ml YPG lỏng và nuôi lắc trong vòng 16-18 giờ, OD600 nm đạt 1,4-1,6. Dịch nuôi được để lạnh 30 phút cho ổn định, ly tâm 5000 rpm trong 5 phút thu tế bào. Tế bào được rửa lần 1 bằng nước khử ion, lần 2 bằng sorbitol 1 M. Tế bào sạch được hòa tan trong 100 l sorbitol 1 M chuẩn bị cho biến nạp [78].
Chuẩn bị pPmeglA mở vòng: Để biến nạp vector pPmeglA vào P. pastoris
GS115, vector tái tổ hợp được cắt mở vòng tại vùng AOX1 bằng SacI. Hỗn hợp phản ứng 500 l (gồm 200 l plasmid (5 g), 50 l đệm 10x SacI, 10 l SacI (50 U), 240 l H2O) được ủ 37°C qua đêm. pPmeglA mở vòng được tinh sạch bằng cách chiết isopropanol và chuẩn bị cho biến nạp [78].
Biến nạp plasmid vào P. pastoris G115:dịch tế bào khả biến được bổ sung dịch plasmid tái tổ hợp đã được xử lý bằng SacI. Để ổn định 15 phút, chuyển sang cuvette để xung điện. Chế độ: 1,5 kV, 25 μF, 200 Ω. Bổ sung ngay 1 ml sorbitol 1 M và để lạnh 15 phút. Chuyển toàn bộ dịch biến nạp sang ống falcon 15 ml và ủ ở 30°C trong 1-2 giờ. Dịch biến nạp sau đó được trải trên đĩa thạch YPGS đặc chứa 100 μg/ml zeocin, ủ ở 30°C trong 3-5 ngày. Khuẩn lạc mọc trên
đĩa thạch chứa gen kháng zeocin được nuôi trong môi trường YPG bổ sung 100 μg/ml zeocin để tách DNA kiểm tra gen chèn [78].
Hình 2.2. Mô hình hội nhập gen meglA vào genome của P. pastoris [78]