Đây là đại lƣợng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký : sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó đƣợc xác định qua phƣơng trình sau:
1.4.1.4.6 Hệ số phân bố
Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể đƣợc mô tả bằng phƣơng trình nhƣ sau:
Hằng số cân bằng K cho cân bằng này đƣợc gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố (partition coefficient) và đƣợc tính nhƣ sau:
Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh. CM : nồng độ cấu tử trong pha động.
Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích
1.4.2 Hệ thống HPLC
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản nhƣ sau: + Bình chứa pha động.
+ Bộ phận khử khí (degasse) + Bơm cao áp (pump)
+ Bộ phận tiêm mẫu (injection) + Cột sắc ký ( pha tĩnh)
+ Đầu dò
+ Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống
1.4.2.1 Bình chứa pha động
Máy HPLC thƣờng có 4 đƣờng dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đƣờng là 100 %.
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đƣờng dung môi cùng một lúc mà thƣờng sử dụng 2 hoặc 3 đƣờng để cho hệ pha động luôn đƣợc pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải. Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.
Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đƣờng nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích.
1.4.2.2 Bộ khử khí (degasse)
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu nhƣ trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tƣợng sau đây sẽ xảy ra
Tỷ lệ pha động của các đƣờng dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lƣu của peak thay đổi
Trong trƣờng hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết đƣợc thì có thể pump sẽ không hút đƣợc dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.
Trong bất cứ trƣờng hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai
1.4.2.3 Bơm ( pump)
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. pump phải tạo đƣợc áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến -500 at -
(lat = 0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liên tục. Lƣu lƣợng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại pump có áp suất rất cao lên đến 1200 Bar).
Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thƣờng có áp suất tối đa 412 Bar. Tốc độ dòng : 0,1- 9,999 ml/phút.
Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã đƣợc cài đặt. Hiện tại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục.
1.4.2.4 Bộ phận tiêm mẫu (injection)
Dùng để đƣa mẫu vào cột phân tích. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample).
Trên cơ sở đó ngƣời ta chế tạo các loại detector sau:
Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV (detector UV). Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 run để phát hiện các chất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất.
Detector huỳnh quang dễ phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng nhƣ các dẫn xuất có huỳnh quang và là loại detector có độ chọn lọc cao nhất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Loại hiện đại hơn có detector diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất.
1.4.2.5 Bộ phận ghi tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang.
Các máy thế hệ mới đều đùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lƣu tẩt cả các thông số của peak nhƣ tính đối xứng, hệ số phân giải... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của ngƣời sử dụng nhƣ : nồng độ, RSD % ...
1.4.2.6 In kết quả
Sau khi đã phận tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện.
1.4.2.7 Chọn điều kiện sắc ký
Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm đƣợc các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu. Các điều kiện đó bao gồm :
1.4.2.7.1 Lựa chọn pha tĩnh
Dựa vào các tài liệu dƣợc điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ... ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau. Chúng ta thông thƣờng dùng 2 loại cột pha thuận (NP) và cột pha đảo (RP). Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác nhƣ cột CN, cột NH2...
a. Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính
Pha tĩnh : Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực.Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm -OH phân cực ƣa nƣớc.
Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực nhƣ: methanol, benzen, acetonitril, chlorofoc...
b. Cột pha đảo (RP): ( ilic gel đã Al yl hó )
Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch cacbon thẳng (C8 hay C18 tƣơng đƣơng RP 8 hay RP 18) hay các mạch cacbon vòng (phenyl- tƣơng đƣơng cột phenyl) vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít
Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực nhƣ:
Methanol, acetonitril, nƣớc hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi - đệm.
Sự tách của chất đƣợc nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó đƣợc ứng dụng chủ yếu trong phân tích dƣợc phẩm. Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu.
Hiện nay pha tĩnh trên nền silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H, ngoài ra còn có các loại pha tĩnh trên nền oxit nhôm, trên nền chất hữu cơ cao phân tử, trên nền mạch cacbon.
1.4.2.7.2 Lựa chọn pha động
Dựa vào các tài liệu, dƣợc điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ...ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn cửa peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm đƣợc dung môi hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị
+ Pha động có thể làm thay đổi + Độ chọn lọc
+ Thời gian lƣu
+ Hiệu năng tách của cột + Độ phân giải
+ Tính đối xứng của peak
Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn đƣợc pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích. Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau :
biến đổi hóa học.
Pha động phải hòa tan đƣợc các chất phân tích thì mới rửa giải đƣợc chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột Ví dụ : đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column).
Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhƣng ít nhất là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu.
Phải có độ tinh khiết cao, hoá chất tinh khiết phân tích. Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phải phù hợp với loại detector . Ví dụ: UV - VIS khi sử dụng thì dung môi không đƣợc hấp thụ quang (Ví dụ: axit axetic ở bƣớc sóng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không đƣợc phát quang.
Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.
Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC) pha động là dung môi phân cực là : nƣớc, ACN, MeOH, axit hay bazơ hữu cơ và một vài amin hay amino axit. Do sự thêm nƣớc vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực hơn chất hữu cơ nguyên một mình nó. Ví dụ: thêm nƣớc vào ACN hay MeOH... sẽ tạo đƣợc pha động phân cực hơn nó. Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trƣờng hợp tách RP-HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định pH. Chất tạo phức, tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất.
1.4.3 Tiến hành đo sắc ký
1.4.3.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
Máy HPLC phải đƣợc kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy hoạt động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi,
tốc độ dòng, năng lƣợng đèn... đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.
Đặc biệt cột sắc ký phải đƣợc kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký
Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: rửa bằng MeOH, không rửa bằng nƣớc Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nƣớc trƣớc cho sạch mụối, sau đổ rửa. Tỷ lệ ACN hay MeOH. Nƣớc (50: 50) cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nƣớc 100 % sau đó để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng đƣợc. Lƣu ý nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng đƣợc các yêu cầu phân tích.
1.4.3.2 Chuẩn bị dung môi pha động :
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dùng cho HPLC. Các hóa chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích.
Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian.
1.4.3.3 Chuẩn bị dung môi pha động :
Mẩu thử : Xử lý mẫu thử theo đúng qui trình, theo nguyên tắc:
Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trƣờng hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải - đƣợc bằng cách lọc hay chiết...
Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vƣợt quá khả năng tách của cột. Có thể gây ra nghẽn cột.
Mẫu chuẩn : Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống nhƣ mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống nhƣ mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhƣng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.
1.4.3.4 Cách đo HPLC
Mỗi máy có mỗi cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:
- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trƣớc khi cho vào cột.
- Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký nhƣ : + Cấu hình máy.
+ Tỷ lệ các dung môi pha động.
+ Bƣớc sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích .
1.5 Định lượng bằng phương pháp (HPLC)
Quá trình định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC có thể chia làm 4 bƣớc. Mỗi bƣớc đều có ảnh hƣởng trực tiếp đến kết quả định lƣợng
1.5.1 Các bƣớc định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC
-Lấy mẫu thử.
-Tiến hành đo sắc ký. -Đo tín hiệu detector. -Phƣơng pháp định lƣợng.
1.5.1.1 Lấy mẩu thử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
quản mẫu và xử lý mẫu.
Để giảm sai số, việc lấy mẫu phải tôn trọng triệt để theo các nguyên tắc đã đƣợc quy định đối với từng loại đối tƣợng mẫu để có thể lấy đƣợc đại diện.
Quá trình bảo quản mẫu cũng có thể dẫn đến sai số đổi với mẫu thử là chất bay hơi, chất có thể phản ứng đƣợc với hơi nƣớc hoặc không khí.
Các thành phần vi lƣợng có thể bị hấp phụ hoặc phản hấp phụ bởi bình chứa trong thời gian bảo quản
Độ nhạy cao hơn để có thể đo đƣợc bằng detector của máy. Cách này đƣợc áp dụng đối với những chất có đáp ứng rất nhỏ hoặc hoàn toàn không có đáp ứng với detector đo độ hấp thụ quang học.
1.5.1.2 Tiến hành đo sắc ký
Quá trình chạy sắc ký cần chú ý :
Có thể xảy ra sự phân huỷ của chất thử trong khi phân tách.
Có thể xuất hiện peak lạ trên sắc đồ đo dung môi dùng hoà tan mẫu thử có chứa tạp chất. Vì vậy cần phải kiểm tra bằng sắc ký các vết tạp đó.
Chuẩn bị mẫu thử
Dung môi để hòa tan mẫu thử phải đƣợc xem xét cẩn thận. Lý tƣởng nhất là dùng pha động làm dung môi để hoà tan nó.
Trừ trƣờng hợp mẫu thử khó tan trong dung môi này thì phải tìm dung môi khác thích hợp hơn.
Dung môi phải đáp ứng các yêu cầu sau : Độ tinh khiết cao để không có peak lạ.
Cơ thể hoà lẫn đƣợc với dung môi rửa giải (pha động). Cho đáp ứng rất nhỏ với detector
Tiêm mẫu: có 2 cách tiêm mẫu vào cột :
Dùng bơm tiêm và van tiêm mẫu thể tích xác định
Dùng van tiêm mẫu cho kết quả chính xác hơn (+1%) so với dùng bơm tiêm (± 1 – 2 %).
1.5.1.3 Đo tín hiệu detector
Detector đƣợc dùng phổ biên nhất trong HPLC là detector UV-VIS Detector sử dụng phải đáp ứng một số yêu cầu s a u :
+ Hoạt động đƣợc ở vùng tuyến tính của nó có độ hấp thụ nhỏ đổi với dung môi (độ nhiễu đƣờng nền thấp).
+ Tránh lọt không khí vào cột và detector. + Giữ sạch cell và làm sạch nó thƣờng xuyên.
Tín hiệu detector : tín hiệu detector đo đƣợc khi chất ra khỏi cột sắc ký đƣợc máy ghi lạidƣới dạng peak, ở máy sắc ký cổ điển, việc đo diện tích hoặc chiều cao peak đƣợc thực hiện bằng tay. Còn ở các máy sắc ký hiện đại việc đo đạc này đƣợc tự động hoá nhờ máy tích phân máy tính.
1.5.2 Các phƣơng pháp định lƣợng
Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: - Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak của nó. - Có 4 phƣơng pháp định lƣợng đƣợc sử dụng trong sắc ký .
1.5.2.1 Phương pháp chuẩn ngoại (Externals Standard)
Phƣơng pháp chuẩn ngoại là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
So sánh diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ của các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn hoá 1 điểm hoặc nhiều điểm.
a. Chuẩn hoá 1 điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử :
Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: Cx =Cs
Ở đ y: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cx : nồng độ mẫu thử
Cs: nồng độ chất chuẩn sx (Hx): diện tích (chiều cao) của peak mẫu thử Ss (Hs): diện tích (chiều cao) của peak mẫu chuẩn
b. Chuẩn hoá nhiều điểm: Tiến hành qua các bước sau
Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các kết quả thu đƣợc là các diện tích, hoặc chiều cao peak ở mỗi điểm chuẩn.