Cây cà chua có tên khoa học là Lycopesium esculentum, có nguồn gốc từ Nam Mỹ, là loại rau ăn quả, họ Cà (Solanaceae). Cây cà chua có 2 loại hình sinh trƣởng: có hạn và vô hạn. Cà chua là cây dài ngày, tự thụ phấn. Cà chua có thể sinh trƣởng trên nhiều loại đất khác nhau nhƣ đất sét, đất cát, đất pha cát. Nhiệt độ thích hợp cho cà chua để đạt năng suất cao, chất lƣợng tốt là khoảng 21 – 24 độ C và thời tiết khô.
Quả cà chua có nhiều kích cỡ và màu sắc khi chín khác nhau (vàng, da cam, hồng, đỏ…) nhƣng cà chua màu đỏ giàu chất dinh dƣỡng và các hợp chất có hoạt tính sinh học nhất.
1.3.4.2 Giá trị dinh dưỡng quả cà chua
Quả cà chua đƣợc chế biến thành nhiều dạng khác nhau và đƣợc dùng trong các bữa ăn hàng ngày của ngƣời Việt Nam nhằm mục đích làm tăng thêm giá trị dinh dƣỡng và tạo nên vẻ đẹp bắt mắt trong việc trình bày các món ăn. Hàm lƣợng sinh tố : khi cà chua chín màu đỏ tƣơi của cà chua tạo nên vẻ đẹp rất bắt mắt trong việc trình bày các món ăn. Màu đỏ của cà chua cũng cho thấy hàm lƣợng vitamin A thiên nhiên trong cà chua cao, trung bình 100 g cà chua chín tƣơi sẽ đáp ứng đƣợc 13 % nhu cầu hằng ngày về vitamin A, vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B1, B2. Sắc tố hồng có trong quả cà chua có thể làm giảm chỉ số thƣơng tổn da xuống 40 % đặc biệt là những quả cà chua chín đỏ
1.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [5,10]
1.4.1 Giới thiệu về phƣơng pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.4.1.1 Cơ sở lý thuyết
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trƣớc
kia gọi là phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phƣơng pháp này ra đời từ năm 1967- 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phƣơng pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm, đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc. Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lƣợng.
Ƣu điểm của HPLC :
+ Điều kiện phân tích khá dễ dàng.
+ Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao. + Độ lặp lại cao.
+ Thƣờng không phân hủy mẫu.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ . Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ ( rây phân tử).
1.4.1.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết .Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có sắc ký Gel hay rây phân tử. Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất
phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động. Nhƣ vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C... vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C.. sẽ đƣợc tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tƣơng tác F1 , F2 và F3
Tổng của 3 tƣơng tác này sẽ quyết định chất nào đƣợc rửa giải ra khỏi cột trƣớc tiên khi lực lƣu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngƣợc lại.
Đối với mỗi chất, sự lƣu giữ đƣợc qui định bởi 3 lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hƣởng không lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột.
Nhƣ vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột.
1.4.1.3 Phân loại sắc ký và ứng dụng
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tĩnh đổi với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột. Theo cơ chế chia tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ của sắc ký, ngƣời ta phân ra các loại sau đây :
+ Sắc ký phân bố - sắc ký chiết (LLC). + Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC).
+ Sắc ký rây phân tử - sắc ký gel (IG-HPLC).
Nhƣng thực tế hiện nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu. Sắc ký hấp phụ là quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với cảc chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột. Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ :
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC) : pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực.
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): pha tĩnh không phân cực pha động phân cực
Loại sắc ký này đƣợc áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tƣơng tự nhau và thuộc loại không phân cực , phân cực yếu hay trung bình nhƣ các vitamin, các thuốc hạ nhiệt giảm đau ...chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng loại sắc ký hấp phụ pha đảo (RP).
1.4.1.4 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
Kết quả của quá trình tách các chất đƣợc detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ. Từ các thông số của các peak, nhiều đại lƣợng đặc trƣng về lý thuyết đƣợc đƣa ra để đánh giá một quá trình sắc ký. Dƣới đây là một số đại lƣợng thƣờng dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lƣợng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký.
1.4.1.4.1 Thời gian lưu : Retention time (Rt)
Thời gian lƣu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lƣu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lƣu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Vì vậy thời gian lƣu là đại lƣợng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lƣu phụ thuộc vào các yếu tố : + Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động. + Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
Trong một số trƣờng hợp thời gian lƣu còn phụ thuộc vào pH của pha động. Trong một phép phân tích nếu Rt nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu Rt quá lớn thì peak bị loãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác nhƣ hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lƣu chúng ta dựa vào các yếu tố trên.
1.4.1.4.2 Hệ số dung lượng k’
-Hệ số dung lƣợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lƣợng chất tan trong pha tĩnh và lƣợng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng .
-Hệ số dung lƣợng k’ phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc tính của pha tĩnh và pha động.
R R 0 R 0 0 0 t t t t K ' 1 t t t
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. K’ lớn thì peak bị loãng, độ nhạy kém. Trong thực tế k’ từ 1 đến 5 là tối ƣu.
1.4.1.4.3 Độ chọn lọc
A, B có K’A và K’ B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc
=K'A/K'B (K’A >K'B)
với càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng
1.4.1.4.4 Số đĩa lý thuyết N
Số đĩa lý thuyết là đại lƣợng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc kí nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống nhƣ một lớp pha tĩnh có chiều cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tích mà trong đó một cân bằng nhiệt động đƣợc thiết lập.
Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trƣng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao. Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ. Ngƣời ta chứng minh đƣợc:
Hay :
Trong đó : W 1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút) W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)
1.4.1.4.5 Độ phân giải R (Resolution)
Đây là đại lƣợng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký : sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó đƣợc xác định qua phƣơng trình sau:
1.4.1.4.6 Hệ số phân bố
Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể đƣợc mô tả bằng phƣơng trình nhƣ sau:
Hằng số cân bằng K cho cân bằng này đƣợc gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân bố (partition coefficient) và đƣợc tính nhƣ sau:
Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh. CM : nồng độ cấu tử trong pha động.
Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích
1.4.2 Hệ thống HPLC
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản nhƣ sau: + Bình chứa pha động.
+ Bộ phận khử khí (degasse) + Bơm cao áp (pump)
+ Bộ phận tiêm mẫu (injection) + Cột sắc ký ( pha tĩnh)
+ Đầu dò
+ Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống
1.4.2.1 Bình chứa pha động
Máy HPLC thƣờng có 4 đƣờng dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đƣờng là 100 %.
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đƣờng dung môi cùng một lúc mà thƣờng sử dụng 2 hoặc 3 đƣờng để cho hệ pha động luôn đƣợc pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải. Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.
Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đƣờng nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích.
1.4.2.2 Bộ khử khí (degasse)
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu nhƣ trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tƣợng sau đây sẽ xảy ra
Tỷ lệ pha động của các đƣờng dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lƣu của peak thay đổi
Trong trƣờng hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết đƣợc thì có thể pump sẽ không hút đƣợc dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.
Trong bất cứ trƣờng hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai
1.4.2.3 Bơm ( pump)
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. pump phải tạo đƣợc áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến -500 at -
(lat = 0.98 Bar) và pump phải tạo dòng liên tục. Lƣu lƣợng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại pump có áp suất rất cao lên đến 1200 Bar).
Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thƣờng có áp suất tối đa 412 Bar. Tốc độ dòng : 0,1- 9,999 ml/phút.
Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã đƣợc cài đặt. Hiện tại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục.
1.4.2.4 Bộ phận tiêm mẫu (injection)
Dùng để đƣa mẫu vào cột phân tích. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample).
Trên cơ sở đó ngƣời ta chế tạo các loại detector sau:
Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV (detector UV). Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 run để phát hiện các chất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất.
Detector huỳnh quang dễ phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng nhƣ các dẫn xuất có huỳnh quang và là loại detector có độ chọn lọc cao nhất.
Loại hiện đại hơn có detector diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất.
1.4.2.5 Bộ phận ghi tín hiệu
Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang.
Các máy thế hệ mới đều đùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lƣu tẩt cả các thông số của peak nhƣ tính đối xứng, hệ số phân giải... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của ngƣời sử dụng nhƣ : nồng độ, RSD % ...
1.4.2.6 In kết quả
Sau khi đã phận tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện.
1.4.2.7 Chọn điều kiện sắc ký
Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm đƣợc các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu. Các điều kiện đó bao gồm :
1.4.2.7.1 Lựa chọn pha tĩnh
Dựa vào các tài liệu dƣợc điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ... ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau. Chúng ta thông thƣờng dùng 2 loại cột pha thuận (NP) và cột pha đảo (RP). Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác nhƣ cột CN, cột NH2...
a. Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính
Pha tĩnh : Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực.Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm -OH phân cực ƣa nƣớc.
Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực nhƣ: methanol, benzen, acetonitril, chlorofoc...
b. Cột pha đảo (RP): ( ilic gel đã Al yl hó )
Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch cacbon thẳng (C8 hay C18 tƣơng đƣơng RP 8 hay RP 18) hay các mạch cacbon vòng (phenyl- tƣơng đƣơng cột phenyl) vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít
Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực nhƣ:
Methanol, acetonitril, nƣớc hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi - đệm.
Sự tách của chất đƣợc nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó đƣợc ứng dụng chủ yếu trong phân tích dƣợc phẩm. Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu.