Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: - Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak của nó. - Có 4 phƣơng pháp định lƣợng đƣợc sử dụng trong sắc ký .
1.5.2.1 Phương pháp chuẩn ngoại (Externals Standard)
Phƣơng pháp chuẩn ngoại là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều đƣợc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
So sánh diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ của các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn hoá 1 điểm hoặc nhiều điểm.
a. Chuẩn hoá 1 điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử :
Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: Cx =Cs
Ở đ y:
Cx : nồng độ mẫu thử
Cs: nồng độ chất chuẩn sx (Hx): diện tích (chiều cao) của peak mẫu thử Ss (Hs): diện tích (chiều cao) của peak mẫu chuẩn
b. Chuẩn hoá nhiều điểm: Tiến hành qua các bước sau
Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các kết quả thu đƣợc là các diện tích, hoặc chiều cao peak ở mỗi điểm chuẩn.
Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tƣơng quan giữa diện tích s (hoặc chiều cao H) peak với nồng độ của chất chuẩn (C), Sử dụng đoạn tuyến tính của đƣờng chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định.
Hinh 1. 6: th phư ng pháp chu n ngoại Sx
Xây dựng phƣơng trình hồi qui tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) peak với nồng độ của chất cần xác định.
Trong đó :
Y = a+bCx Y : Diện tích peak
a : Giao điểm của đƣờng chuẩn với trực tung, b : Độ dốc của đƣờng chuẩn.
Cx : Nồng độ của chất thử...
Dựa vào phƣơng trình hồi quy này ta tính đƣợc nồng độ chất thử.
X Y a C b
Chú ý : Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) peak mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính của đƣờng chuẩn.
1.5.2.2 Phương pháp chuẩn nội ( Internals Standard)
Trong định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký, điện li nói chung cũng nhƣ HPLC nói riêng phƣơng pháp chuẩn ngoại (ESTD) tỏ ra có nhiều nhƣợc điểm trong phân tích, các mẫu phải xử lý phức tạp (chiết, tách...) và đặc biệt là các mẫu vừa phức tạp vừa có hàm lƣợng thấp của chất cần định lƣợng. Ví dụ nhƣ các mẫu huyết tƣơng trong nghiên cứu dƣợc động học.
Phƣơng pháp chuẩn nội (ISTD) giúp khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên của ESTD. Ngoài ra, nó còn có thể giúp cực tiểu hóa đƣợc những sai số gây nên do máy móc và kỹ thuật.
Kỹ thuật chuẩn nội có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau: ngƣời ta thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lƣợng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất đƣợc thêm này gọi là chuẩn nội.
Từ những dữ kiện về : diện tích (hoặc chiều cao) peak và lƣợng (hoặc nồng độ) của chất chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định đƣợc hàm lƣợng của thành phần cần định lƣợng trong mẫu thử một cách chính xác.
Vì rằng kết quả (response) của chất chuẩn và chuẩn nội với detector không cùng độ nhạy, nên trƣớc hết cần phải xác định hệ số đáp ứng (response factors) để hiệu chính trong tỉnh kết quả.
Xác định hệ số đáp ứng Fx
Chuẩn bị một hỗn hợp có chứa những lƣợng (hoặc nồng độ) đã biết của chất chuẩn và chuẩn nội rồi chạy sắc ký. Sắc đồ thu đƣợc sẽ cho ta biết các dữ liệu về diện tích của các peak.
Trong phƣơng pháp chuẩn nội, ngƣời ta thấy có mối tƣơng quan giữa tỷ số của khối lƣợng (hoặc nồng độ) của chuẩn và chuẩn nội với tỷ số điện tích của 2 peak và hệ số đáp ứng đƣợc tính theo phƣơng trình sau :
Tính theo nồng độ ta có: . : . . . mc Sc mc Sic Fx
mis Sic mis Sc Cc Sis Fx Cis Sc Ở đây :
mc,mis lần lƣợt là khối lƣợng của chất chuẩn và chuẩn nội. Cc, Cis lần lƣợt là nồng độ của chuẩn và chuẩn nội
Sc, Sis lần lƣợt là diện tích peak chuẩn và chuẩn nội.
Các sai số sẽ đƣợc cực tiêu hóa nếu hệ số Fx xấp xỉ đơn vị có nghĩa là chất chuẩn và chuẩn nội có cùng đáp ứng với detector. Tuy nhiên trong thức tế điều này thƣờng khó đạt đƣợc hoàn hảo.
Định lƣợng thành phần trong mẫu thử.
a. Phương pháp chuẩn 1 điểm : Chuẩn nội đƣợc thêm vào cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử, rồi tiến hành sắc ký.Lƣợng hoặc nồng độ của thành phần trong mẫu thử đƣợc tính nhƣ sau:
Tính theo nồng độ ta có:
b. Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm : Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa những lƣợng (hoặc nồng độ) chất chuẩn khác nhau nhƣng tất cả cùng chứa một lƣợng (hoặc nồng độ) chuẩn nội. Sau đó sắc ký và thu đƣợc các dữ kiện tiến hành vẽ đƣờng chuẩn biểu diễn sự tƣơng quan gỉữa tỷ số diện tích (hoặc chiểu cao) peak của chuẩn trên chuẩn nội (Ss/ Sis) với tỷ số của nồng độ chuẩn ngoại trên chuẩn nội (Cs/Cis).
Hinh 1. 7: Phư ng pháp đường chu n sử ụng nội chu n
Song song tiến hành sắc ký mẫu thử cũng đƣợc thêm chuẩn nội với lƣợng (hoặc nồng độ) nhƣ thang chuẩn
Tính tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) peak của chất thử trên diện tích (hoặc chiều cao) peak chuẩn nội (Sx/Sis).rồi dựa vào đƣờng chuẩn sẽ tìm đƣợc
. St Ct Cis Fx Sis . St mt Cis Fx Sis
nồng độ của chất thử (Cx).
1.5.2.3 Phương pháp thêm chuẩn
Ƣu điểm của kỹ thuật thêm chuẩn là có độ chính xác cao vì nó loại trừ đƣơc sai số do các yếu tố ảnh hƣởng, đặc biệt là ảnh hƣởng của quá trình xử lý mẫu (chiết xuất, tinh chế các chất từ các dạng bào chế...)
Kỹ thuật tiến hành nhƣ sau :
Xử lý mẫu thử rồi tiến hành, sắc ký.
Thêm vào mẫu thử những lƣợng đã biết của các chất chuẩn tƣơng ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện .
Nồng độ chƣa biết Cx của mẫu thử đƣợc tính dựa vào sự chênh lệch, nồng độ ΔC (lƣợng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao) peak S theo công thức:
C Cx Sx S
Có thể tính toán nồng độ Cxcủa mẫu thử theo một cách khác :
Tiến hành sắc ký một mẫu thử và mẫu thử đã đƣợc thêm chuẩn nhƣ trên. Sử dụng một peak không muốn định lƣợng của mẫu thử nhƣ là một chuẩn nội.
Bằng cách, sử dụng peak không muốn xác định của mẫu thử nhƣ là một chuẩn nội trong phƣơng pháp thêm này, chúng ta sẽ cực tiểu hoá đƣợc các sai số gây nên trong quá trình định lƣợng nhƣ đã trình bày ở trên.
Trong trƣờng hợp mẫu thử không chứa peak không muốn xác định thì có thể thêm một chất chuẩn nội vào mẫu thử rồi tiến hành phân tích nhƣ trên
Tính nồng độ của thành phần thứ hai: Ra = S2a/Sia ( ở sắc đồ a)
Rb = S2b/Slb (ở sắc đồ b) Rthêm = Rb - Ra
Ythử = (Ythêm) . (Ra)/R thêm
Nồng độ của thành phần thứ ba: Cách tính tƣơng tự.
1.5.2.4 Kỹ thuật đường chuẩn thêm chuẩn
Nguyên tắc : chuẩn bị một dãy hỗn hợp gồm các lƣợng mẫu thử giống nhau và các chất chuẩn (tƣơng ứng với các thành phần cần xác định) với lƣợng tăng dần. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký. Dựng đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa diện tích (S) hoặc chiều cao (H) của pic tổng (thử + chuẩn) với lƣợng hoặc nồng độ của chất chuẩn thêm (AC). Giao điểm của đƣờng chuẩn kéo dài với trục hoành chính là nồng độ của chất cần xác định
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM
2.1 Trang thiết bị và hóa chất
2.1.1 Thiết bị
-Máy sắc ký lỏng hiệu Varian với đầu dò DAD
H nh 2. 1: đ h thống máy HPLC
-Cân phân tích Sartorius có độ chính xác 0,1mg - Máy xay mẫu
-Bể siêu âm đuổi khí; máy đo pH
-Bộ lọc hút chân không với màng lọc 0,45µm -Cột sắc ký pha đảo C18,(150 x 4,6mm; 5µm)
2.1.2 Dụng cụ
-Dụng cụ thủy tinh các loại: bình định mức, pipet, phểu thủy tinh... -Xilanh nhựa 5ml
-Xilanh thủy tinh 100µl
-Giấy lọc mẫu có kích thƣớc lỗ 0,2µm; 0,45µm
2.1.3 Hóa chất
Tất cả các hóa chất đều đạt tiêu chuẩn đáp ứng dùng phân tích trên máy HPLC.
- Natri benzoat; Kali sorbat - Nhật - Nƣớc cất loại dùng cho HPLC - Merk
- Kali ferrocyanur (K4[Fe(CN)6].3H20) - Merk - Kẽm sunfat (ZnSO4.7H20) - Merk
- Amoni acetate (CH3COONH4) - Merk
- Methanol (MeOH) ; Acetonitrile (ACN) - Merk
2.2 Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu.
+ Mẫu rau : cải xanh, cải thìa
+ Mẫu quả : cam sành, cà chua,quýt
Sử dụng cách lấy mẫu đại diện : Chọn các loại quả vừa đều nhau, tƣơi,bóng ,đẹp. Không chọn những quả có dấu hiệu bị hƣ hỏng. Chọn các mẫu rau tƣơi. Các mẫu đƣợc bảo quản ở nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời.
2.3 Nguyên tắc xử lý mẫu [7]
Mẫu thử là các mẫu cam, quýt , cà chua, cải xanh,cải thìa đƣợc nghiền nhuyễn ép lấy dịch lọc, lọc bằng giấy lọc, ly tâm 500 vòng/phút lấy dịch trong, lắc đều 30 phút bằng máy lắc sau đó cho dịch lọc vào bể siêu âm đuổi bọt khí. Hút 2,00ml dung dịch trong này pha loãng trong bình định mức 10,0 ml bằng
dung môi phá mẫu dung dịch axit axetic l %. Lọc qua màng lọc 0,45μm.
2.4 Các sơ đồ xử lý mẫu xác định vitamin C A. Sơ đồ xử lý chất chuẩn. A. Sơ đồ xử lý chất chuẩn.
Chuẩn axit ascosbic 99,1% nguyên trạng
Cân chính xác 30,9mg
Dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn
Mẫu tiêm vào HPLC
Pha loãng trong BĐM 100ml bằng DMPM CH3COOH 1%
Lắc đều sau đó đuổi bọt khí bằng bể siêu âm, hút 2,0ml dung dịch
chuẩn đem pha loãng trong BDDM 25ml
B. Sơ đồ xử lý mẫu cam sành , quýt và cà chua : Mẫu cam sành, quýt
cà chua Xay, nghiền, ép Lấy dịch lọc trong Bể siêu âm Dung dịch mẫu phân tích
Lấy dịch lọc đem ly tâm 500 vòng/phút
Lấy 2,00ml dung dịch này pha loãng bằng dung dịch axit axetic
1% trong bình định mức 10,0ml Đuổi bọt khí
Mẫu tiêm vào HPLC
Bóc vỏ
C. Sơ đồ xử lý mẫu rau : cải xanh, cải thìa
Mẫu cải xanh, cải thìa Xay, nghiền nát Lấy dịch lọc trong Bể siêu âm Dung dịch mẫu phân tích
Lấy dịch lọc đem ly tâm 500 vòng/phút
Lấy 2,00ml dung dịch này pha loãng bằng dung dịch axit axetic 1% trong bình định mức 10,0 ml
Đuổi bọt khí
Mẫu tiêm vào HPLC
Rửa sạch
2.5 Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC
-Vitamin Caxit ascorbic 99,1% (nguyên trạng)
- Dung dịch chuẩn gốc, cân 30,9 mg (±0,1mg) chất chuẩn vitamin C axit ascorbic hàm lƣợng 99,1 % (nguyên trạng) pha loãng trong bình định mức 100,0 ml, hòa tan bằng dung môi phá mẫu. Hút 2,0 ml chuẩn này đem pha loãng trong bình định mức 25,0 ml đến vạch bằng axit axetic 1 %. Lọc qua bộ lọc dung môi và đuổi hết bọt khí bằng bể siêu âm
Từ chuẩn gốc pha loãng dãy chuẩn :
- Dung dịch chuẩn 1 có nồng độ 10 mg/l - Dung dịch chuẩn 2 có nồng độ 20 mg/l - Dung dịch chuẩn 3 có nồng độ 40 mg/l - Dung dịch chuẩn 4 có nồng độ 60 mg/l - Dung dịch chuẩn 5 có nồng độ 80 mg/l - Dung dịch chuẩn 6 có nồng độ 100 mg/l
Lắc đều 30 phút và siêu âm 5 phút các dung dịch chuẩn trên. Lọc dung dịch thu đƣợc qua màng lọc 0,45 μm. Thu dịch lọc tiêm vào máy HPLC.
2.6 Cài đặt các thông số đo.
- Điều kiện sắc ký : Cột sắc ký: C18 (250 x 4,6 ; 5μ m) Tốc độ dòng : 0,5 ml/phút. Pha động: metanol : H3PO4 0,05% = 70 : 30 Nhiệt độ lò cột 25°C: nhiệt độ phòng. Thể tích tiêm 20 μl - Điều kiện detectơ :
Detectơ DAD ở 1 bƣớc sóng 254 nm. Loại detectơ này cho phép ghi phổ hấp thụ DAD của vitamin C đƣợc tách ra trên sắc ký đồ. Với sự trợ giúp của máy tính, các dữ liệu phổ này đƣợc lƣu trữ và sau đó đem so sánh với phổ hấp thụ của các chất chuẩn, nhờ đó cho phép khẳng định đƣợc phần nào cấu trúc của vitamin C và đánh giá đƣợc độ sạch của peak.
2.7 Quy tr nh đo trên máy HPLC.
- Rửa cột : Bằng metanol chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút - Pha động : metanol : H3PO4 0,05% = 70 : 30
- Mẫu đƣợc tiêm.
- Kết quả đƣợc chỉ thị là diện tích peak.
2.8 Phƣơng pháp khảo sát đánh giá.
2.8.1 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOQ)
của phương pháp
Giới hạn phát hiện (LOD) đƣợc định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn gấp 3 lần tín hiệu đƣờng nền. (LOD - xác định theo quy tắc 3 σ (xicma) Đây là một thông số đặc trƣng cho độ nhạy của phƣơng pháp.
LOD = tín hiệu chiều cao pic/nhiễu đƣờng nền 3.
Giới hạn định lƣợng (LOQ) (limit of quantitation) là nồng độ nhỏ nhất đo đƣợc của phƣơng pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng đƣợc với một RSD % quy định, thƣờng LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đƣờng nền
2.8.2 Khảo sát độ lặp lại
Độ lặp lại đƣợc dùng để đánh giá định lƣợng độ phân tán của các kết quả phân tích. Đại lƣợng này đặc trƣng cho độ gần về giá trị trung bình của hai hay
nhiều phép đo nhận đƣợc trong những điều kiện giống nhau.
Đánh giá độ lặp lại dựa trên độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) hoặc độ biến động.
2.8.3 Xác định độ thu hồi
Đây là một thông số không thể thiếu đƣợc trong khi đánh giá một phƣơng pháp phân tích.
- Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thử ,cùng với việc tiến hành làm mẫu thực không có thêm chuẩn
Trong đó:
%X: độ thu hồi
Cs+mâu: nồng độ tổng chuẩn thêm vào và mẫu thực có đo đƣợc. Cmâu: nồng độ thực đo đƣợc. Cso: nồng độ chuẩn biết trƣớc S mâu mâu SO C C %X 100 C
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Xác phƣơng tr nh đƣờng chuẩn
Dãy chuẩn vitamin C đƣợc khảo sát có nồng độ nhƣ sau : 0 mg/l ; 10 mg/l ; 20 mg/l ; 40 mg/l ; 60 mg/l ; 80 mg/l ,100 mg/l . Sử dụng các thông số đo nhƣ đã trình bày mục 2.6 và quy trình đo trong mục 2.7 . Phân tích các chuẩn nói trên và xác định phƣơng trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích các peak, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.1 và các hình 3.1 đến hình 3.7.
Bảng 3. 1: Diện tích peak của vitamin C tƣơng ứng với từng nồng độ chuẩn
Nồng độ chuẩn (mg/l) Diện tích pic b a R2 0 0 -153062 92097 1 10 786379 20 1680254 40 3504998 60 5382269 80 7224561 100 9053270
H nh 3. 2: c đ m u chu n vit min C có n ng độ 20 mg/l
H nh 3. 3: c đ m u chu n vit min C có n ng độ 40 mg/l
H nh 3. 5: c đ m u chu n vit min C có n ng độ 80 mg/l
H nh 3. 6: c đ m u chu n vit min C có n ng độ 100 mg/l
Sử dụng chƣơng trình Microsoft Excel để xây dựng đƣờng chuẩn, ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng vitamin C nhƣ sau :
Phƣơng trình hồi qui của đƣờng chuẩn theo diện tích peak có dạng : y = ax + b trong đó x là nồng độ , y là diện tích pic
b= -153062 a = 92097
Hệ số hồi quy tuyến tính là : R2 = 1
Mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn đƣợc thể hiện qua hình 3.7
H nh 3. 7: ường chu n đ nh lượng vit min C
3.2 Độ lặp lại :
3.2.1 Độ lặp lại theo chuẩn :