1.7.1. Tình hình nghiên cứu PUFA trên thế giới
Trên thế giới, một vài thập niên gần đây các thực phẩm có chứa các axít béo omega-3 và omega-6 đã được tung ra thị trường bán lẻ rất mạnh và ngày càng được mở rộng nghiên cứu trên nhiều đối tượng cung cấp dầu giàu các axít béo omega-3 và omega-6 khác nhau.
Grima và cộng sự (1995) [28] đã sử dụng phương pháp tạo phức với urê để cô đặc PUFA từ sinh khối VTB Isochyrysis galbana với tỉ lệ urê: axit béo là 4:1, ở
4 ºC. Sau đó tiếp tục phân tách bằng HPLC (high-pressure liquid chromatography),
phân đoạn EPA và DHA đạt độ tinh khiết tương ứng là 96,0 và 94,9%.
Wanasundara và Shahidi (1999) [77], đã tối ưu hóa điều kiện tách chiết và
tinh sạch các axit béo không bão hòa để đạt được cực đại EPA và DHA trong mỡ cá voi bằng phương pháp cô đặc với việc sử dụng urê. Kết quả là các axit béo ω-3 thu được chiếm đến 88,2% so với TFA khi tỉ lệ urê: axit béo là 9:2 và thời gian tinh thể hóa là 24h ở nhiệt độ -10°C.
Senanayake và cộng sự (2000) [69] cũng đã sử dụng kỹ thuật tạo phức với
urê để thu DHA từ sinh khối vi tảo Crypthecodinium cohnii. Thành phần axít béo
có trong dầu tảo gồm 22:6, 14:0 và 18:1. Với quá trình tạo phức với urê, các axit béo 14:0, 16:0 và 18:1 đã bị loại hầu như hoàn toàn trong khi đó DHA đã được làm giàu từ 47,4 đến 97,1% với hiệu suất của quá trình là 32,5% theo lượng dầu tảo gốc. Hiệu quả thu hồi DHA cao hơn và 66,5% DHA tổng số có mặt trong dầu tảo gốc đã được phát hiện nhờ quá trình làm giàu DHA tiếp theo quá trình tạo phức hợp urê [69]. Tảo C. cohnii có chứa khoảng 40% DHA (wt/wt). Dầu tảo này có chứa 95% TAG ở dạng các axít béo tự do hoặc các alkyl ester đơn giản. Hầu hết các sản phẩm dầu tảo đều ở dạng TAG [35].
Nghiên cứu của Mendes và cộng sự (2007) [53] đã cho thấy, thành phần axit béo trong phần tạo phức với urê và phần không tạo phức với urê là khác nhau, phụ thuộc vào tỉ lệ urê: axit béo và nhiệt độ kết tinh. Quy trình cô đặc và tinh sạch
DHA ở VTB dị dưỡng giàu DHA như Crypthecodinium cohnii đã được thực hiện
với urê: axit béo tối ưu là 7:2; nhệt độ kết tinh là 4 hoặc 8 ºC. Khi đó, hàm lượng
DHA tinh sạch chiếm 99,2% so với TFA.
Gần đây nhất, Lin và cộng sự (2014) [49], sử dụng phương pháp tạo phức với urê trong điều kiện tối ưu: tỷ lệ urê: este etyl dầu cá mòi là 1,9: 1 và nhiệt độ kết tinh -1°C thì độ tinh khiết và phục hồi hoàn toàn của EPA và DHA là 65,6% và 46,8%, tương ứng.
1.7.2. Tình hình nghiên cứu PUFA ở Việt Nam
Trên thị trường Việt Nam đã xuất hiện nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng có chứa omega-3 và omega-6 nhưng hầu hết chúng đều được nhập ngoại và được sản xuất từ cá. Đây cũng chính là những khó khăn cho sự phát triển các sản phẩm có chứa omega của Việt Nam. Gần đây đã có những nghiên cứu về tách chiết PUFA trên các đối tượng khác nhau.
Mai Thị Diệu Thảo (2006) [5] đã tiến hành hòa tan các axit béo trong mỡ cá basa vào trong dung môi hữu cơ (hexan hoặc aceton), sau đó dung môi này được hạ nhiệt độ xuống -20°C đến -70°C, để kết tinh trong một ngày rồi thu nhận các phân đoạn khác nhau của axit béo. Thu được hàm lượng Omega-3 thu được lên tới 24,03% axit béo.
Trên đối tượng cá Ngừ, Lại Mai Hương (2007) [3] đã kết luận hàm lượng PUFA trong phần không tạo phức tăng khi nhiệt độ giảm, và ngược lại, % SFA và MUFA tăng khi nhiệt độ tăng. Ở nhiệt độ 4°C thích hợp cho làm giàu DHA trong giàu cá Ngừ. Tỉ lệ FFA: urê là 1:3 (w/w) cho % DHA tăng từ 32% lên 79% tăng 2,46 lần so với tỉ lệ 1:2. Tỉ lệ urê: methanol là 3:16 (w/v) cho hiệu suất PUFA và EPA lớn nhất, trong khi hiệu suất DHA lớn nhất khi tỷ lệ đó là 3:12.
Trên đối tượng dầu Hồ Đào, Bùi Quang Thuật (2009) [6] cũng đã làm giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 bằng phương pháp tạo phức với urê ở nhiệt
độ 5°C, tỉ lệ urê: hỗn hợp axít béo là 2:1; tỉ lệ cồn: hỗn hợp axít béo là 9:1cho hiệu suất thu PUFA có độ tinh khiết cao đạt 92,78 %.
Theo công trình nghiên cứu của Hoàng Thị Lan Anh và cộng sự (2009) [1], trên đối tượng Schizochytrium mangrovei PQ6 tỉ lệ urê: axit béo được sử dụng là 5:2, thời gian tinh thể hóa là 12giờ ở nhiệt độ 4-10°C. Khi đó, phần không tạo phức với urê có chứa DHA và DPA chiếm 85,2% và 13,4% so với TFA của pha lỏng, tương ứng. Bên cạnh đó, 2 loại axit béo khác là axit linoleic (C18:2 -6) và axit dihomo-γ- linoleic (C20:3-6) chiếm một lượng nhỏ 0,604% và 0,744% so với TFA trong pha lỏng.
Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu mới sản xuất dầu sinh học giàu omega–3 và
omega–6 trên đối tượng VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 ứng dụng
làm thực phẩm chức năng vẫn còn là mới mẻ và mới bắt đầu được tiến hành nghiên cứu từ năm 2013. Chính vì vậy, chúng tôi mong muốn thực hiện đề tài nghiên cứu
“Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ
sinh khối VTB dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam”với hi
vọng kết quả thu được sẽ bước đầu cung cấp những cơ sở khoa học cho phép ứng
dụng sản xuất dầu sinh học giàu omega–3 và omega–6 làm thực phẩm chức năng cho con người và động vật nuôi.
Mục đích của đề tài nghiên cứu của chúng tôi như sau:
+/ Tìm ra qui trình tối ưu cho tách chiết lipit tổng số từ sinh khối tảo dị dưỡng S. mangrovei PQ6.
+/ Tìm ra qui trình tối ưu cho tách chiết FFA từ lipit tổng số (dầu thô) được tách chiết từ sinh khối tảo dị dưỡng S. mangrovei PQ6.
+/ Tìm ra được điều kiện thích hợp cho quá trình làm giàu axit béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 và omega-6 ở quy mô phòng thí nghiệm.
+/ Đánh giá chất lượng của lipit, FFA thu được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo giàu omega–3 và omega–6, đồng thời đánh giá chất
lượng của dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ SKK tảo S. mangrovei
PQ6 để có thể làm nguyên liệu cho việc sản xuất viên thực phẩm chức năng cho người.
Công việc thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
CHƢƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy
VTB dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 được phòng Công nghệ Tảo
phân lập tại huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang.
Chúng được nuôi cấy trong môi trường M12 có thành phần (g/L): glucose - 90, cao nấm men - 10, muối biển nhân tạo - 17,5. Tảo được nuôi trong bình lên men tự tạo 30 lít ở nhiệt độ 28 - 30°C có sục khí liên tục. pH môi trường được duy trì trong khoảng 6,5 -7,5.
Sinh khối tảo được thu hoạch khi sinh trưởng của tảo ở pha cân bằng (sau 4- 5 ngày nuôi cấy). Đây là giai đoạn sinh khối tảo có hàm lượng lipit đạt cao nhất. Sinh khối chủng PQ6 được thu hoạch bằng phương pháp ly tâm ở 4000 v/p trong 10 phút, sau đó được sấy khô ở 80°C đến khối lượng không đổi. Để bảo đảm cho nguyên liệu đầu vào là ổn định với tất cả quá trình tách chiết dầu sau này, SKK thu được được trộn đều và cất giữ trong các túi ny lông được hàn kín miệng và giữ trong -20°C cho đến khi sử dụng. Sinh khối tảo khô được nghiền thành dạng mịn nhỏ với cát thủy tinh được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình tách chiết lipit và hỗn hợp axit béo.
Hình 2.1. Ảnh tế bào Schizochytrium mangrovei PQ6 và nuôi cấy trong các hệ
thống lên men 30 lít 2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Các hóa chất vô cơ như: NaOH, KOH, Na2SO4, HCl và các loại dung môi như: n-hexan, ethanol, diethyl ete, cloroform, axit acetic đặc, petroleum ether do Trung Quốc sản xuất.
Các hóa chất sử dụng để xác định chỉ số axit và peroxyt của hỗn hợp axit béo tự do tách được như: thuốc thử phenolphthalein, KI, dung dịch hồ tinh bột 1%, Na2S203.
Các hóa chất sử dụng để xác định chỉ số axit và peroxyt của dầu tảo giàu omega- 3 và omega- 6 tách được như: Thuốc thử phenolphthalein, KI, dung dịch hồ tinh bột 1%, Na2S2O3 do Việt Nam sản xuất.
Các dụng cụ và thiết bị sử dụng: Bình cầu các loại gắn với ống sinh hàn hồi lưu; phễu chiết; phễu lọc; cốc đong; ống đong và bình tam giác các loại; giấy lọc, nhiệt kế; máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70 (Nhật Bản); máy cô quay chân không (IKA của Đức); cân kỹ thuật Precisa XB 1200C; cân phân tích Shimazu AY120 (Nhật Bản); Máy khuấy từ gia nhiệt Kika Labortechnik (Đức); tủ sấy Cornthem (New Zealand); máy ly tâm Sorvall (R) (Đức); bình lên men 30 lít tự tạo; máy sắc kí khí HP-6890, ghép nối với Mass Selective Detector Agilent 5973; cột HP-5MS; khí mang He; thư viện phổ khối: WILEY275.L và NIST 98.L
2.2. Phƣơng pháp
Quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axit béo dạng omega-3 và omega-6 từ VTB bao gồm 3 giai đoạn chính cần phải tiến hành như: tách chiết lipit tổng số (dầu thô) từ sinh khối tảo; tách chiết FFA từ dầu thô; tách chiết và làm giàu axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA. Để thực hiện các nội dung nêu trên, một số phương pháp tiến hành như sau:
2.2.1.Tách chiết lipit [11]
Mười gam SKK chủng PQ6 được chiết với ba loại dung môi là n-hexan, cloroform và petroleum ether trên máy khuấy từ gia nhiệt. Nhiệt độ tách chiết thay đổi từ 50 đến 75°C, thời gian tách chiết từ 1 - 5 giờ với chế độ khuấy thay đổi từ để tĩnh đến khuấy liên tục. Tỷ lệ dung môi : nguyên liệu từ 8:1 đến 12:1. Số lần trích ly được tiến hành từ 1 đến 3 lần. Ngoài ra, ảnh hưởng của chất lượng SKK lên hiệu suất tách chiết dầu cũng được kiểm tra thông qua 2 yếu tố là độ ẩm sinh khối và nhiệt độ sấy sinh khối. Phản ứng chiết tiến hành trên máy khuấy từ, ly tâm ở 4000 vòng/ phút trong 10 phút để tách lớp dung môi với bã sinh khối và nước. Sau đó, dung môi được loại bỏ khỏi lipit bằng cách sử dụng máy cất quay chân không ở nhiệt độ 70°C. Lượng lipit thu được được đựng trong các bình thủy tinh tối màu và cân trọng lượng. Phần trăm dầu tách chiết được được tính theo công thức sau:
Hàm lượng lipit (% SKK) = (m2 - m1) x 100% Trong đó: m2 (g) - khối lượng lipit thu được,
m1(g) - khối lượng sinh khối khô đem tách
2.2.2. Tối ƣu các thông số của quá trình tách chiết lipit
Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm ảnh hưởng của một số tác nhân như dung môi, thời gian khuấy sục, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi, nhiệt độ khuấy sục, chế độ khuấy, số lần chiết, nhiệt độ sấy sinh khối, độ ẩm sinh khối lên hiệu suất quá trình tách chiết lipit từ sinh khối chủng VTB dị dưỡng PQ6. Phạm vi thay đổi của các yếu tố khác nhau ảnh hưởng lên hiệu suất quá trình tách chiết lipit từ sinh khối chủng PQ6 như sau:
- Ảnh hưởng của dung môi: n- hexan, cloroform, petroleum ether - Ảnh hưởng của thời gian khuấy: 1, 3, 4 và 5 giờ
- Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liêu: dung môi: 1: 8; 1: 10 và 1: 12 - Ảnh hưởng của nhiệt độ khuấy: 50 -55; 60 – 65 và 70- 75°C
- Ảnh hưởng của chế độ khuấy: để tĩnh, khuấy gián đoạn và khuấy liên tục - Ảnh hưởng của số lần chiết: 1, 2 và 3 lần
- Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy sinh khối: 60, 70, 80 và 90°C - Ảnh hưởng của độ ẩm sinh khối: 0, 30, 50 và 80%
2.2.3. Tối ƣu hóa qui trình tách chiết FFA từ dầu thô
2.2.3.1. Tối ƣu nồng độ NaOH trong phản ứng thủy phân dầu thô
Dầu tảo thô (tức là lipit tổng số tách chiết được từ SKK VTB dị dưỡng chủng PQ6) được xà phòng hoá bằng dung dịch NaOH (nồng độ từ 1N đến 2,5N) trong cồn 70%. Hỗn hợp được khuấy từ gia nhiệt ở 70°C trong 3 giờ. Sau phản ứng, dung dịch muối NaCl 3% được bổ sung vào hỗn hợp xà phòng hoá và các chất không xà phòng hóa được tách ra khỏi hỗn hợp bằng li tâm ở 4000 vòng/ phút trong 40 phút. Phần xà phòng được axít hoá bằng dung dịch HCl cho đến pH = 2. Sau đó, các FFA được tách ra khỏi hỗn hợp dung dịch bằng dung môi n-hexan. Lớp dung môi n-
hexan có chứa FFA được lọc qua muối Na2SO4 khan và tiếp theo việc loại bỏ dung
môi n-hexan bằng máy cô quay chân không ở 70°C.
Hiệu suất thủy phân dầu tảo thô được tính theo công thức sau:
M m x 100 H (%) =
H (%): Hiệu suất thủy phân dầu tảo thô
m (g): Khối lượng FFA thu được sau khi thủy phân dầu tảo M (g): Khối lượng dầu thô được dùng cho quá trình thủy phân
2.2.3.2. Nghiên cứu làm giàu hỗn hợp dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA bằng phƣơng pháp tạo phức với urê omega-6 từ hỗn hợp FFA bằng phƣơng pháp tạo phức với urê
Sử dụng phương pháp tạo phức với urê để làm giàu hỗn hợp axít béo omega- 3 và omega-6 từ hỗn hợp axít béo thu được sau quá trình thủy phân dầu nêu ở mục 2.2.3.1., chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố khác nhau lên hiệu suất tách PUFAs dạng omega-3 và omega-6 như sau:
- Tỷ lệ urê: hỗn hợp axít béo là: 1:1; 2:1; 3:1 và 4:1; - Tỷ lệ urê: cồn là: 1:6; 1:8; 1:9 và 1:10;
- Dải nhiệt độ kết tinh được nghiên cứu là: 4, 15 và 25°C.
Quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA bằng phương pháp tạo phức với urê được thực hiện như sau:
Mười g hỗn hợp FFA thu được sau quá trình thủy phân dầu được cho vào hỗn hợp Ethanol và urê (theo các tỷ lệ khác nhau). Khuấy từ và gia nhiệt ở 60°C trong 5 phút đến khi hỗn hợp tan hoàn toàn. Sau đó, phản ứng tạo phức ở các nhiệt độ khác nhau trong thời gian 12 – 15 giờ. Trong đó, phức hợp được tạo ra do sự kết hợp của các SFA và MUFA với urê. Các axít béo omega-3 và omega-6 không tạo phức với urê. Sau quá trình tạo phức, hỗn hợp được lọc tách phức tạo thành ra khỏi hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6. Tiến hành cất quay chân không ở 80°C để loại bỏ cồn dư và thu nhận hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6. Tiếp theo hỗn hợp axit béo thu được được rửa 3 lần với nước ấm để loại bỏ urê còn dư thừa. Sau đó, tiến hành bổ sung thêm n- hexan vào hỗn hợp để hòa tan các axít béo. Tiếp theo, hỗn hợp được phân lớp qua phễu chiết, thu phần dung môi chứa các axít béo ở lớp trên và loại bỏ lớp dưới (chứa nước). Hỗn hợp dung môi chứa các axit béo được lọc
qua muối Na2SO4 khan để loại bỏ nước dư và được cất quay chân không ở 80°C để
loại bỏ dung môi và thu hỗn hợp axit béo omega-3 và omega-6.
Hiệu suất tách chiết các axít béo omega-3 và omega-6 được đánh giá thông qua hiệu suất tách PUFAs và hiệu suất tạo phức giữa SFA, MUFA và urê như sau:
+/ Hiệu suất tách PUFA (Hs %) đƣợc tính theo công thức sau:
Trong đó: M2
M1 x 100 Hs (%) =
Hs: Hiệu suất tách PUFAs (%)
M1: Khối lượng các PUFA thu được sau khi tạo phức (g) M2: Khối lượng FFA đem phân tách.
+/ Hiệu suất tạo phức của SFAs và MUFA với urê (H %) đƣợc tính theo
công thức sau:
Trong đó:
H (%): Hiệu suất tạo phức của các SFAs và MUFA;