hợp FFA
Hỗn hợp axít béo thu được sau quá trình thủy phân dầu tảo gồm SFA, MUFA và omega-3 và omega-6 PUFA. Như vậy, muốn có được sản phẩm là hỗn hợp omega-3 và omega-6 có độ tinh khiết cao các axit béo này cần phải được phân tách ra khỏi các SFA và MUFA và sau đó được làm giàu lên. Điều này đồng nghĩa với việc phải loại bỏ SFA và MUFA ra khỏi hỗn hợp axit béo. Dựa vào đặc tính của axit béo no và không no đa nối đôi chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tạo phức với urê để làm giàu hỗn hợp omega-3 và omega-6. Cơ sở khoa học của việc sử dụng urê để phân tách SFA và MUFA ra khỏi các PUFA là do các tinh thể urê có cấu trúc tứ giác kín với các rãnh có đường kính 5,67 angtron. Khi có mặt các phân tử axit béo không phân nhánh mạch dài như SFA, các rãnh của phân tử urê được tạo nên đủ lớn để khớp với chuỗi axit béo và kết tinh trong một cấu trúc lục giác với các rãnh có đường kính 8-12 angtron. Sự có mặt của các liên kết đôi trong chuỗi carbon làm tăng kích thước của phân tử và đồng thời lại làm giảm khả năng tạo phức của nó với urê. Chính vì vậy, các phân tử SFA hoặc MUFA có khả năng tạo phức một cách dễ dàng với phân tử urê hơn so với các phân tử axit béo có 2 hoặc 3 nối đôi trở lên. Do vậy, trong phân đoạn không tạo phức với urê sẽ chỉ chiếm phần lớn các axit béo không bão hòa có nhiều hơn một nối đôi [53]. Đây là một phương pháp hiệu quả và dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam và để có được hiệu suất thu hồi PUFAs omega-3 và omega-6 cao bước đầu chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số các thông số kỹ thuật ảnh hưởng lên quá trình như: tỷ lệ hỗn hợp FFA: urê, tỷ lệ urê: cồn và nhiệt độ kết tinh.
3.4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp FFA: urê lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs
Trong phương pháp tạo phức với urê, tỷ lệ giữa FFA: urê là yếu tố quan trọng quyết định tới độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi của PUFA mong muốn. Nếu tỷ lệ này quá nhỏ thì urê sẽ không đủ khả năng tạo phức với tất cả các SFA và MUFA do đó độ tinh sạch của PUFA sẽ không cao. Tuy nhiên, nếu tỷ lệ này quá lớn thì urê sẽ có khả năng tạo phức với cả một số PUFAs, do đó sẽ làm cho hiệu suất thu hồi PUFA lại thấp. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp FFA: urê dao động từ 1:1 đến 1:4 lên hiệu suất tạo phức với urê. Kết quả thu được được trình bày ở hình 3.9.
Kết quả nghiên cứu thu được được chỉ ra trên hình 3.9 đã cho thấy hiệu suất tạo phức đạt cao nhất là 63,1% ở tỷ lệ hỗn hợp FFA: urê là 1: 4, đồng thời hiệu suất tách PUFA thu được ở công thức này cũng đạt cao nhất (27,7% so với TFA). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với công bố của Grima và cộng sự (1995) [28] khi sử
dụng phương pháp tạo phức với urê để cô đặc PUFA từ sinh khối VTB Isochyrysis
galbana với tỉ lệ FFA: urê là 1: 4, ở 4°C. Sau đó, tác giả tiếp tục sử dụng phương pháp HPLC để phân tách các phân đoạn có chứa EPA và DHA ra khỏi nhau và đạt
độ tinh khiết tương ứng là 96,0 và 94,9%. Kết quả nghiên cứu thu được của chúng
tôi ở đây cũng cho phép chúng tôi sử dụng tỷ lệ hỗn hợp FFA: urê là 1: 4 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ urê:cồn lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách
PUFAs
Tỷ lệ urê: cồn cũng có khả năng ảnh hưởng tới khả năng làm giàu PUFA ở phương pháp nêu trên. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ urê: cồn từ 1:6 tới 1:10 lên hiệu suất tách PUFAs còn các thông số khác nhau tỷ lệ FFA: urê là 1:4 và nhiệt độ kết tinh là 4°C được giữ nguyên trong các thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu thu được được trình bày ở hình 3.10.
Hình 3.9. Hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFA ở các tỷ lệ FFA: urê khác nhau
Kết quả chỉ ra trên hình 3.10 đã cho thấy hiệu suất tạo phức tăng từ 58 lên 67% khi tăng tỷ lệ urê: cồn từ 1:6 lên 1:10. Trong quá trình thí nghiệm chúng tôi quan sát thấy, khi hòa tan urê trong cồn ở 60°C thì ở các tỉ lệ 1: 6 và 1: 7 thì urê không tan hết trong cồn và lắng xuống dưới, do đó khả năng tạo phức của urê với axit béo có thể xảy ra không hoàn toàn. Hiệu suất tạo phức đạt giá trị cao nhất ở tỷ lệ urê: cồn là 1: 10. Tuy nhiên, hiệu suất tách PUFA thu được ở công thức này lại thấp hơn hiệu suất tách PUFA ở công thức 1: 9. Theo kết quả nghiên cứu của Lại Mai Hương (2007) [3], khi tạo phức urê với dầu cá Ngừ cho đã cho thấy phần trăm (%) DHA trong pha lỏng giảm khi giảm tỉ lệ urê: dung môi, khi sử dụng nhiều dung môi có khả năng cho phép rửa phần lỏng khỏi phần rắn tốt hơn, tuy nhiên, phức tạo thành lại kém bền vững hơn. Do đó, sẽ giải phóng một phần SFA và MUFA vào pha lỏng làm cho độ tinh sạch của PUFA trong pha lỏng lại bị giảm. Như vậy, xét cả về mặt hiệu quả thu hồi PUFA và hiệu quả kinh tế, chúng tôi chọn tỷ lệ urê: cồn là 1: 9 là thích hợp cho quá trình làm giàu axít béo omega-3 và omega-6 tiếp theo.
3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs
Nhiệt độ kết tinh không những có ảnh hưởng lớn đến độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi PUFA mà còn ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế trong của quá trình kết tinh. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ kết tính với dải nhiệt độ là 4, 15 và 25°C lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách
A
B
Hình 3.10. Hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFA ở các tỷ lệ urê: cồn khác nhau
A
PUFAs trong đó tỷ lệ FFA: urê là 1:4 và tỉ lệ urê: ethanol là 1:9 được giữ nguyên (hình 3.11).
Hàm lượng PUFA thu được trong phần không tạo phức tăng khi nhiệt độ kết tinh giảm (hình 3.11). Hiệu suất PUFA thu được đạt giá trị cao nhất là 30% so với axit béo khi nhiệt độ kết tinh tạo phức là 4°C. Đồng thời, ở công thức nhiệt độ này hiệu suất tạo phức với urê cũng đạt cao nhất là 50,5%. Điều này có thể được giải thích là ở nhiệt độ 4°C, urê tạo phức với hỗn hợp các SFA và MUFAs là bền vững nhất. Theo công bố của tác giả Medina và cộng sự (1995) [52] đã cho thấy ở 4°C, urê tạo phức với SFA và MUFA là bền vững nhất, ở nhiệt độ cao hơn thì các phức được tạo ra kém bền vững hơn dẫn đến hàm lượng SFA và MUFA trong phần không tạo phức tăng và hiệu suất PUFA lại bị giảm. Vì vậy, 4°C là nhiệt độ kết tinh tối ưu cho quá trình thu nhận EPA và DPA cao từ dầu cá tuyết. Với mục tiêu nghiên cứu là tạo ra dầu sinh học giàu các axít béo omega-3 và omega-6 nên căn cứ vào hiệu suất thu hồi PUFA và hiệu suất tạo phức nêu trên, chúng tôi đã lựa chọn nhiệt độ kết tinh là 4°C cho quá trình tạo phức của SFAs và MUFA với tinh thể urê là thích hợp nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi.
3.5. Thành phần axít béo của hỗn hợp axit béo omega 3 và omega 6 thu đƣợc từ dầu thô của chủng PQ6 từ dầu thô của chủng PQ6
Với điều kiện thích hợp cho thí nghiệm đã được trình bày ở phần trên (tỷ lệ FFA: urê -1: 4, tỷ lệ urê: cồn – 1: 9 và nhiệt độ kết tinh tạo phức với urê là 4°C), chúng tôi đã tiến hành thu hỗn hợp axit béo giàu omeg-3 và omega-6. Hỗn hợp axit béo omega-3 và omega-6 thu được sau quá trình làm giàu cũng đã được tiến hành
A B
Hình 3.11. Hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFA ở các nhiệt độ kết tinh khác nhau
phân tích thành phần axit béo bằng máy sắc ký khí. Kết quả nghiên cứu thu được được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.12.
Bảng 3.5. Thành phần axít béo của hỗn hợp axit béo omega 3 và omega 6thu
đƣợc sau quá trình làm giàu
STT Acid béo Tên khoa học Tên
thường
Hàm lượng (%
so với
TFA)
1 C18:1(n-9) Octadecenoic acid Oleic 0,714
2 C18:2(n-6) -t trans-9,12-octadecadienoic acid Linoleic 7,844
3 C18:2(n-6) -c cis-9,12-octadecadienoic acid 0,362
4 C18:4n-3 Octadecatetraenoate 0,818 5 C20:4n-6 Arachidonate acid AA 0,639 6 C20:3n-6 Eicosatrienoic acid 0,719 7 C20:4n-3 Eicosatetraenoate 1,073 8 C20:5n-3 Eicosapentaenoate EPA 2,072 9 C22:5n-6 5,8,10,12,14-eicosanoic DPA 14,304 10 C22:6n-3 Docosahexaenoate DHA 71,456
Tổng số axít béo omega-3 và omega-6 99,287
Tổng hàm lƣợng DHA+DPA+EPA 87,832
Các kết quả nghiên cứu thu được trên bảng 3.5 và hình 3.12 đã cho chúng ta thấy hỗn hợp axit béo này có chứa 99,287 % so với TFA là các axít béo không bão hòa đa nối đôi ở dạng omega-3 và omega-6. Ngoài ra, hàm lượng của DHA, DPA và EPA chiếm 87,83 % so với TFA. Hàm lượng DHA tăng từ 22,44% so với TFA ở hỗn hợp FFA lên 71,44% so với TFA ở hỗn hợp giàu omega-3 và omega-6 với hiệu suất làm giàu là 50,5%. Kết quả thu được đã cho thấy quá trình làm giàu axít béo bằng phương pháp tạo phức với tinh thể urê cho hiệu quả rất cao trong điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi và đảm bảo được yêu cầu về chất lượng của dầu sinh học giàu hỗn hợp các axít béo omega-3 và omega-6 (với hàm lượng DHA, DPA và EPA trong dầu chiếm hơn 80% so với axít béo tổng số) phục vụ cho mục đích làm thực phẩm chức năng cho người và động vật nuôi.
3.6. Bƣớc đầu kiểm tra chất lƣợng của dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 thu đƣợc sau quá trình làm giàu omega-6 thu đƣợc sau quá trình làm giàu
Sản phẩm dầu sinh học giàu omega-3 và omega-6 thu được sau quá trình tinh sạch và làm giàu được phân tích một số chỉ tiêu hóa lý được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 thu đƣợc sau quá trình làm giàu
Kết quả phân tích thu được ở bảng 3.6 đã cho thấy sản phẩm dầu sinh học giầu axit béo omega-3 và omega-6 sau quá trình làm giàu có chỉ số axit đạt 143mg KOH/g. Giá trị này đã không khác biệt nhiều so với chỉ số axit của dầu sau thủy phân (136,5 mg KOH/g ở bảng 3.3) đã cho thấy hỗn hợp dầu sinh học thu được tồn tại chủ yếu ở dạng FFA và quá trình làm giầu không làm thay đổi các liên kết. Chỉ số peroxyt của sản phẩm dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 là 2,82 meqO2/kg < 5 meqO2/kg (tiêu chuẩn chất lượng đã được chúng tôi đăng ký) cho thấy chỉ số oxy hóa thấp, dầu ít bị oxy hóa trong điều kiện tự nhiên. Vì vậy, dầu sinh học giầu axit béo omega-3 và omega-6 thu được về cơ bản đã đạt được yêu cầu
TT Chỉ tiêu Đơn vị tính Kết quả Tiêu chẩn chất lƣợng
1 Cảm quan - Màu vàng sẫm, trong có màu vàng/sáng- da cam
2 Chỉ số axit mg KOH/g 143 -
Từ các kết quả nghiên cứu thu được qua nhiều đợt thí nghiệm khác nhau, chúng tôi đã tiến hành sơ đồ hóa quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 từ hỗn hợp FFA (hình 3.13).
Hình ảnh minh họa cho quá tách chiết dầu sinh học giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 được chỉ ra trên (hình 3.14). Với quá trình này, chúng tôi đã thu được dầu sinh học đảm bảo chất lượng, với hàm lượng các axít béo omega-3 và omega-6 trong dầu tảo cao (đặc biệt là hàm lượng DHA, DPA và EPA chiếm hơn 80% so với TFA).
Hình 3.13. Quá trình tối ƣu làm giàu hỗn hợp axít béo từ FFA Cô quay 70°C Cô quay 80°C Ethanol Urê+H2O n-hexan Na2SO4 khan H2O Urê+H2O Ethanol n-hexan H2O H2O+urê
Lọc phân hai pha 4°C, qua đêm Urea+Ethanol FFA:Urea: Ethanol =1:4:36 20g FFA Hỗn hợp Axit béo và urê
Hỗn hợp phân hai lớp Pha rắn SFA+MUFA+ur ê Pha lỏng PUFA PUFA+urê SFA+MUFA H2O n-hexan Na2SO4 khan PUFA thô PUFA+ n -hexan PUFA sạch SFA+MU FA sạch H2O n-H2O Urê Cô quay
54 Lê Thị Thơm - K16
Hòa tan phần rắn trong nước cất
Hình 3.14. Ảnh minh họa quá trình làm giàu hỗn hợp axít béo omega-3 và omega-6 từ FFA
Hòa tan PUFAs tinh thể trong nước cất, n-Hexan. Phân lớp trên phễu chiết. Hỗn hợp phân thành 3 lớp.
Thu lớp trên cùng chứa
PUFAs
Cô quay thu được PUFA lỏng (dầu
sinh học) Hòa tan phần trên trong n -
hexan. Thu phần trên chứa dung môi nHexan và SFA
Tiến hành cất quay, thu SFAs Lọc hỗn hợp qua phễu chiết Pha lỏng (PUFAs)
Cất quay PUFA. Sau cất quay thu được dạng tinh thể (do còn
chứa Urea) Cho PUFA vào
bình cầu Phân lớp trên phễu
chiết hỗn hợp phân 2 lớp. Lớp trên chưa SFAs, lớp dưới chứa nước và Urea
Cân 20g FFA
Pha hỗn hợp urê: ethannol (1:10) trên máy khuấy từ gia nhiệt
600C
Bổ sung hỗn hợp urê: ethannol vào FFA (1FFA:4 urê:36 Ethanol), khuấy từ 10 phút. Để hỗn hợp trong
tủ lạnh 4 - 100C qua đêm
Hỗn hợp sau để lạnh, phân thành 2 lớp. Phần trên lỏng chứa PUFA,
phần dưới rắn chứa SFAs và MUFA
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu thu được được trình bày ở trên chúng tôi xin rút ra một số kết luận như sau:
1.Đã tối ưu được các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết lipit từ sinh khối
khô chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 cho hiệu suất tách lipit đạt 70% so với
sinh khối khô gồm: sử dụng dung môi là n-hexan; nhiệt độ khuấy - 70-75°C; thời gian - 4 giờ; chế độ khuấy liên tục; tỉ lệ dung môi: sinh khối: 10: 1; trích ly 1 lần; nhiệt độ sấy sinh khối 80°C và độ ẩm sinh khối 0%.
Thành phần axit béo của lipit tách chiết được có hàm lượng DHA (axit docosahexaenoic axit) là 38,04% so với axit béo tổng số, đảm bảo làm nguyên liệu cho quá trình tách chiết và thủy phân dầu.
2.Đã xác định được điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân dầu thô để tạo ra
hỗn hợp các axit béo tự do gồm: Nồng độ NaOH 1,8N (tương đương với 21,6g NaOH cho 100 g dầu tảo);
Hỗn hợp axit béo tự do thu được có chất lượng bảo đảm để sản xuất dầu sinh
học giàu axit béo omega-3 và omega-6 như: có màu vàng đậm và trong; chỉ số axit
là 136,5 mg KOH/g; chỉ số peroxyt là 1,486 meq O2/kg; tổng số axit béo omega-3
và omega-6, EPA, DHA là 60,94%, 14,30% và 22,43% so với axit béo tổng số, tương ứng.
3.Đã xác định được điều kiện thích hợp cho quá trình làm giàu axit béo omega-3 và
omega-6 từ hỗn hợp axit béo tự do gồm: Tỷ lệ axit béo tự do: urê là 1: 4; Tỷ lệ urê: cồn là 1: 9 và nhiệt độ kết tinh với urê là 4°C.
Dầu sinh học giàu axit béo omega-3 và omega-6 thu được có màu vàng sẫm, trong; có chỉ số axit là 143 mg KOH/g; chỉ số peroxyt là 2,82 meq O2/kg; hàm lượng các axít béo omega-3 và omega-6, đặc biệt là hàm lượng DHA, DPA