4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1. Vật liệu nghiên cứu
1.1.1. Môi trường sử dụng
2.1.1.1. Môi trường nhân giống cấp 1
- Môi trường PGA (Potato Glucosese Agar) Khoai tây: 200 (g)
Glucosese: 20 (g) Agar: 20 (g)
Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)
- Môi trường PGA + 10% nước dừa Khoai tây: 200 (g)
Glucosese: 20 (g) Agar: 20 (g)
Nước dừa: 100 (ml)
Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)
- Môi trường PGA + 10% nước giá Khoai tây: 200 (g)
Glucosese: 20 (g) Agar: 20 (g)
Nước giá: 100 (ml)
Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)
Các môi trường đều được khử trùng ở điều kiện 1210C áp suất 1,2atm trong thời gian 90 phút.
2.1.1.2. Môi trường nhân giống cấp 2
Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn vào trong các công thức thí nghiệm.
2.1.1.3. Môi trường giá thể mùn cưa cao su
Mùn cưa cao su được loại bỏ tạp chất, ủ với nước vôi 0,5% từ 15 – 20 ngày, sau đó tiến hành phối trộn dinh dưỡng theo các công thức thí nghiệm.
2.1.2. Thiết bị
Cân phân tích; Kính hiển vi; Máy chụp ảnh kỹ thuật số; Tủ cấy vô trùng; Nồi hấp; Tủ sấy
2.1.3. Hóa chất
- Các hóa chất vô cơ: NaNO3, KH2PO4, KCl, FeSO4, NaCl, HCl, CaCO3.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thực nghiệm 2.2.1. Phương pháp thực nghiệm
2.2.1.1. Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm HKG401 và HKG404 trên các môi trường nhân giống cấp 1
- Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404 các trên môi trường dinh dưỡng khác nhau
Để xác định môi trường thích hợp nhất cho việc bảo quản và nhân giống cấp 1 phù hợp với phòng thí nghiệm ở Việt Nam và chuẩn bị cho quá trình phát triển nuôi trồng sản xuất, chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404 trên 3 loại môi trường: PGA, PGA + 10% nước dừa và PGA + 10% nước giá,
Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức cho mỗi loại nấm, mỗi công thức với 3 lần lặp lại
- CT1: PGA (200g khoai tây + 20g glucose + 20g Aga + nước cất vừa đủ 1.000ml)
- CT2: PGA + 10% nước dừa - CT3: PGA + 10% nước giá
Các chỉ tiêu theo dõi sau khi cấy 3 ngày; 4 ngày và 5 ngày: - Đo hệ sợi nấm lan trên ống nghiệm (cm)
- Quan sát màu sắc và hình thái sợi nấm
Cách tiến hành thí nghiệm: Đổ môi trường vào ông nghiệm vô trùng với mức 1/3 ống nghiệm. Các loại môi trường đều hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1,2atm trong 90 phút. Sau khi hấp xong tiến hành để nghiêng một góc 50. Để nguội môi trường, cấy giống vào ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ phòng. Theo dõi và tiến hành đo mức độ lan trên môi trường của hệ sợi ở thời điểm 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày.
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Sau khi đánh giá khả năng phát triển của hệ sợi nấm trên các loại môi trường, lựa chon môi trường tốt nhất tiến hành sữ dụng để đánh giá mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm. Tiến hành nuôi ủ ở ba mức nhiệt độ là 200C; 250C và 300C. Sau đó tiến hành thu thập số liệu ở thời điểm 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày.
- Khảo sát ảnh hưởng của pH
Môi trường dùng làm thí nghiệm cũng là môi trường giống như môi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, điều chỉnh về các pH khác nhau: 5; 6; 7; 8. Sử dụng máy đo pH để xác định các mức pH cần nghiên cứu. Điều chỉnh pH bằng dung dịch acid HCl 1M và kiềm dùng NaOH 1M, sau 24h cấy giống, nuôi ủ giống ở nhiệt độ 25oC. và tiến hành thu thập số liệu ở thời điểm 3 ngày; 4 ngày và 5 ngày.
2.2.1.2. Khảo sát sự sinh trưởng của sợi nấm HKG401 và HKG404 trên môi trường nhân giống cấp 2
Nguyên liệu dùng là hạt lúa nấu chín, bổ sung các thành phần: cám gạo, cám ngô, đường glucosse, bột CaCO3 theo tỷ lệ của các công thức thí nghiệm.
Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức cho mỗi loại nấm và mỗi công thức với 3 lần lặp lại:
Các công thức môi trường nuôi cấy cụ thể như sau: - MT2.1: 90% lúa + 7% cám ngô + 3% Bột CaCO3 - MT2.2: 89%lúa + 10% cám ngô + 1% bột CaCO3
- MT2.3: 97% lúa + 3% bột CaCO3.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Đo tốc độ lan sâu của sợi nấm ở thời điểm 5 ngày, 10 ngày và 15 ngày
- Quan sát màu sắc, đặc điểm sợi nấm
Cách tiến hành thí nghiệm: Tiến hành phối trộn môi trường theo các công thức thí nghiệm sao cho độ ẩm đạt khoảng 65%, cho môi trường vào khoảng 3/4 chiều dài chai thủy tinh (chai có thể tích 400ml, chiều dài chai 18cm), khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,2atm trong thời gan 90 phút, để nguội và cấy giống vào. Tiến hành theo dõi và đo độ lan sâu của sợi nấm theo định kỳ vào thời điểm 5 ngày, 10 ngày và 15 ngày.
2.2.1.3. Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của nấm HKG401 và HKG404 trên môi trường giá thể mùn cưa cao su
Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức môi trường khác nhau, mỗi công thức 30 bịch với 3 lần lặp lại:
Công thức môi trường giá thể mùn cưa cao su được phối trộn như sau:
MT3.1 = 89% mùn cưa cao su + 5% cám gạo + 5% cám ngô + 1% bột CaCO3
MT3.2 = 79% mùn cưa cao su + 10% cám gạo + 10% cám ngô + 1% bột CaCO3
MT3.3 = 98% mùn cưa cao su + 1% đường + 1% bột CaCO3
Các chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi quá trình sinh trưởng và hình thành quả thể nấm Linh chi.
So sánh đặc điểm hình thái quả thể và trọng lượng quả thể ở các công thức nuôi cấy khác nhau.
Cách tiến hành:
- Mùn cưa cao su khô được bổ sung nước vôi 0,5% để đạt được độ ẩm 65%, trộn đều và ủ 15 đến 20 ngày.
- Trộn đều các loại phụ gia để có các tỷ lệ theo các công thức trên, tiến hành đóng vào túi PP kích thước 25 x 35cm, mỗi bịch nặng 1.300g. Hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1000C trong 6 giờ.
- Sau khi giá thể nguội, dùng giống trên môi trường cấp 2 cấy vào các bịch giá thể mùn cưa cao su. Tiến hành đánh giá trọng lượng quả thể của hai loại nấm HKG401 và HKG404 được nuôi trên 3 công thức môi trường khác nhau, trong điều kiện nuôi trồng ở Hà Tĩnh.
2.2.2. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTAT 5.0 và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excell.
2.3. Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2013 đến 9/2014 tại Trung tâm phát triển nấm ăn và nấm dược liệu Hà Tĩnh (Tổ dân phố 3 Thị trấn Thạch Hà - huyện Thạch Hà – tỉnh Hà Tĩnh).
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tốc độ phát triển của hệ sợi nấm Linh chi trên môi trường nhân giống cấp 1 giống cấp 1
3.1.1. Đánh giá sự phát triển của hệ sợi nấm Linh chi HKG401 và HKG404 trên môi trường nhân giống cấp 1 (môi tường thạch) HKG404 trên môi trường nhân giống cấp 1 (môi tường thạch)
Môi trường nhân giống cấp 1 là môi trường nhân giống cấp đầu tiên sau khi được phân lập, đây là thời gian hệ sợi nấm bắt đầu làm quen với điều kiện nhân tạo. Điều kiện nhân nuôi phù hợp sẽ tạo thuận lợi cho hệ sợi nấm phát triển tốt và là tiền đề cho quá trình sinh trưởng phát triển của nấm sau này. Để có cơ sở đánh giá mức độ phù hợp của các môi trường đưa vào thử nghiệm, chúng tôi tiến hành theo dõi khả năng phát triển của hệ sợi nấm trên các môi trường khác nhau theo thời gian và kết quả được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Chiều dài hệ sợi nấm lan trên môi trường nhân giống cấp 1
Tên nấm Môi trường
Chiều dài hệ sợi lan (cm) 3 ngày 4 ngày 5 ngày
HKG 401
PGA 5,36 ± 0,18 7,56 ± 0,48 9,09 ± 0,10 PGA + 10% nước dừa 5,45 ± 0,12 7,56 ± 0,32 9,13 ± 0,08 PGA + 10% nước giá 5,66 ± 0,10 7,71 ± 0,14 9,60 ± 0,26
HKG 404
PGA 5,11 ± 0,10 7,41 ± 0,07 8,86 ± 0,22 PGA + 10% nước dừa 5,18 ± 0,18 7,42 ± 0,17 9,19 ± 0,07
0 2 4 6 8 10 12
3 ngày 4 ngày 5 ngày
Thời gian C h iề u d à i h ệ s ợ i (c m ) HKG 401 PGA HKG 401 PGA + 10% dừa HKG 401 PGA + 10% nước giá HKG 404 PGA
HKG 404 PGA + 10% dừa HKG 404 PGA + 10% nước giá
Hình 3.1. Chiều dài hệ sợi nấm lan trên môi trường nhân giống cấp 1 theo thời gian
Hình 3.2. Ống nghiệm đựng môi trường cấp 1 trước khi đưa vào hấp thanh trùng.
Hình 3.3. Hệ sợi nấm phát triển trong ống nghiệm
Trong quá trình theo dõi sự phát triển của của hệ sợi nấm, HKG401 và HKG404 trên 3 loại môi trường, chúng tôi nhận thấy trong 2 ngày đầu hệ sợi tăng trưởng chậm, nhưng những ngày sau đó hệ sợi phát triển tương đối nhanh.
Trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau, hệ sợi nấm của cả hai loại nấm có tốc độ sinh trưởng không giống nhau. Trên môi trường PGA + 10% nước giá tốc độ hệ sợi nấm lan nhanh nhất và đến ngày thứ 5 nấm HKG401 đạt 9,60cm; nấm HKG404 đạt 9,33cm. Đối với môi trường PGA hệ sợi của cả hai loại nấm phát triển chậm nhất và đạt 9,09cm đối với nấm HKG401 và 8,86cm đối với nấm HKG404.
Sự sai khác về tốc độ sinh trưởng của hai loại nấm trên 3 loại môi trường khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê cùng với việc trong quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy ở môi trường PGA + 10% nước giá hệ sợi phát triển một cách dày đặc và có sự xuất hiện sắc tố sớm hơn các môi trường còn lại. Thời gian hệ sợi bắt đầu xuất hiện sắc tố (màu nâu vàng) là từ 6 - 7 ngày. Như vậy, để nhân giống nấm HKG401 và HKG404 hiệu quả,
trong 3 loại môi trường đưa vào nghiên cứu thì môi trường PGA + 10% nước giá là môi trường thích hợp nhất và thời gian nhân giống tốt nhất là khoảng từ 6 - 7 ngày sau khi cấy giống.
Chúng tôi sữ dụng môi trường PGA + 10% nước giá làm môi trường nhân giống cấp 1 để tiếp tục theo dõi các chỉ tiêu có liên quan.
3.1.2. Đánh giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404. triển của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404.
Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển của sinh vật nói chung và của các loại nấm nói riêng, mỗi loại sinh vật có ngưỡng nhiệt độ thích nghi riêng và chỉ sinh trưởng, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ tối ưu. Để có cơ sở cho việc đánh giá mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm chúng tôi tiến hành theo dõi tốc độ lan của hệ sợi nấm ở các nhiệt độ khác nhau và kết quả được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Sự phát triển của hệ sợi nấm ở các nhiệt độ khác nhau
Tên nấm Nhiệt độ
Chiều dài hệ sợi (cm)
3 ngày 4 ngày 5 ngày
HKG 401 200C 5,06 ± 0,19 7,18 ± 0,30 9,01 ± 0,22 250C 5,31 ± 0,17 7,66 ± 0,16 9,64 ± 0,18 300C 5,56 ± 0,11 7,59 ± 0,06 8,89 ± 0,21 HKG 404 200C 5,21 ± 0,22 7,27 ± 0,13 9,10 ± 0,16 250C 5,41 ± 0,08 7,35 ± 0,10 9,40 ± 0,15 300C 5,53 ± 0,15 7,62 ± 0,20 8,93 ± 0,07
Bảng 3.2 cho thấy: Ở thời điểm 3 ngày đầu chiều dài hệ sợi tăng dần theo nhiệt độ và biến động trong khoảng từ 5,06 đến 5,56cm đối với giống HKG401 và từ 5,21 đến 5,53cm đối với giống HKG404. Tuy nhiên sang ngày thứ 4 và ngày thứ 5 tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm có sự thay đổi: ở nhiệt độ 250C hệ sợi nấm phát triển tốt nhất và đạt 9,64cm đối với giống HKG401 và 9,40cm đối với giống HKG404; ở nhiệt độ 300C cả hai giống nấm đều phát triển chậm lại và đạt độ dài thấp nhất, sự sai khác này có ý nghĩa về mặt thống kê. Do vậy, có thể khẳng định nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình phát triển của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404 và nhiêt độ 250C là nhiệt độ thích hợp nhất để sợi nấm phát triển so với nhiệt độ 200C và 300C 0 2 4 6 8 10 12
3 ngày 4 ngày 5 ngày
Thời gian C h iề u d ài h ệ sợ i ( cm ) HKG 401 200C HKG 401 250C HKG 401 300C HKG 404 200C HKG 404 250C HKG 404 300C
Hình 3.4. Biểu diễn sự phát triển của hệ sợi nấm ở các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ oC
3.1.3. Đánh giá ảnh hưởng của pH đến quá trình phát triển của hệ sợi nấm. nấm.
Độ pH không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng phát triển của sinh vật mà còn là yếu tố ảnh hưởng đến các phản ứng hóa học và sinh học diễn ra trong mỗi cơ thể sinh vật, để có cơ sở lựa chọn độ pH thích hợp trong việc nhân giống nấm thu thập được từ khu bảo tồn thiên nhiên Kẻ Gỗ chúng tôi tiến hành theo dõi quá trình sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm ở các pH khác nhau và kết quả được thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Sự phát triển của hệ sợi nấm ở các pH khác nhau
Tên nấm Độ Ph
Chiều dài hệ sợi lan (cm)
3 ngày 4 ngày 5 ngày
HKG 401 pH = 5 4,26 ± 0,17 6,43 ± 0,29 7,43 ± 0,47 pH = 6 5,31 ± 0,09 7,66 ± 0,12 9,48 ± 0,16 pH = 7 5,31 ± 0,09 6,85 ± 0,28 9,14 ± 0,28 pH = 8 4,93 ± 0,08 6,44 ± 0,11 8,43 ± 0,23 HKG 404 pH = 5 4,30 ± 0,33 6,24 ± 0,18 7,43 ± 0,42 pH = 6 5,38 ± 0,26 7,45 ± 0,10 9,32 ± 0,16 pH = 7 5,36 ± 0,20 6,82 ± 0,31 8,90 ± 0,25 pH = 8 4,43 ± 0,08 6,62 ± 0,20 8,60 ± 0,50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3 ngày 4 ngày 5 ngày
Thời gian C h iề u d ài h ệ sợ i ( cm ) HKG 401 pH = 5 HKG 401 pH = 6 HKG 401 pH = 7 HKG 401 pH = 8 HKG 404 pH = 5 HKG 404 pH = 6 HKG 404 pH = 7 HKG 404 pH = 8
Hình 3.5. Biểu diễn sự phát triển của hệ sợi nấm ở các pH khác nhau Từ Bảng trên cho thấy pH khác nhau thì sự phát triển của hệ sợi nấm cũng khác nhau, ở thời điểm 3 ngày hệ sợi nấm HKG401 có chiều dài biến động trong khoảng 4,26cm đến 5.31cm và HKG404 biến động từ 4,30cm đến 5,38cm trong đó hệ sợi nấm của cả 2 giống nấm gần như phát triển tương đương nhau ở pH = 6 và pH = 7 (đều đạt 5,31cm đối với giống HKG401; 5,38cm và 5,36cm đối với giống HKG404). Kết quả xử lý thống kê cho thấy tại thời điểm này sự khác biệt về chiều dài hệ sợi ở các pH khác nhau không có ý nghĩa thông kê. Tuy nhiên đến thời điểm 5 ngày chiều dài hệ sợi đã có sự khác biệt đáng kể và đạt cao nhất ở pH = 6 đối với cả hai giống nấm (HKG401 đạt 9,48cm và HKG404 đạt 9,32). Đến thời điểm này (5 ngày) sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê. Như vậy có thể khẳng định sự phát triển của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404 tốt nhất ở pH = 6.
3.2. Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm HKG401 và HKG404 trên môi trường nhân giống cấp 2 trường nhân giống cấp 2
Trên môi trường nhân giống, hệ sợi nấm Linh chi ăn sâu vào khối cơ chất trong chai với tốc độ sinh trưởng tương đối chậm nhưng đồng đều mọi phía, sau 16 - 17 ngày hệ sợi lan hết khối cơ chất trong chai và bện chặt lại. Trên các môi trường nhân giống khác nhau thì tốc độ lan của hệ sợi nấm cũng khác nhau. Kết quả đo chiều dài hệ sợi lan trên môi trường nhân