3. Nội dung nghiên cứu
3.5. So sánh phương pháp chẩn đoán tả bằng kĩ PCR với kĩ thuật chẩn đoán tả bằng
kĩ thuật nuôi cấy kết hợp sử dụng kháng huyết thanh
Chẩn đoán tả bằng kĩ thuật nuôi cấy được xem là ”tiêu chuẩn vàng” để cho kết quả chính xác. Tuy nhiên với phương pháp này thời gian trả lời kết quả lâu và không thể phát
hiện được V. cholerae nếu bệnh nhân đã sử dụng thuốc kháng sinh. Mặt khác, các kháng
huyết thanh có thời hạn sử dụng ngắn, những năm gần đây không có dịch tả nên việc duy trì luôn có kháng huyết thanh gặp nhiều khó khăn. Trong khi đó, việc chẩn đoán tả bằng kĩ thuật PCR cho kết quả nhanh, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể sử dụng ngay cả khi bệnh nhân đã dùng thuốc kháng sinh.
KẾT LUẬN
Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu được một số kết quả sau:
1. Thiết kế được mồi xuôi và mồi ngược để nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR
đặc hiệu và chương trình khuếch đại gen phù hợp.
2. Tách chiết được ADN bộ gen từ V. cholerae sử dụng KIT, làm khuôn cho phản ứng nhân gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR bằng phản ứng m - PCR.
3. Tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng m – PCR1, 2 để nhân được gen ctxA,
rfbQ, IS1358, tcpA và rstR.
- Đối với gen ctxA, rfbQ, IS1358: biến tính ở 94°C trong 1 phút 30 giây, kế tiếp là
30 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây) và kết thúc với pha hoàn tất ở 72°C trong 7 phút.
- Đối với gen tcpA và rstR: biến tính ở 94°C trong 1 phút 30 giây, kế tiếp là 30 chu
kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 47°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây) và kết thúc với pha hoàn tất ở 72°C trong 7 phút.
4. Xác định được 16/162 mẫu bệnh phẩm dương tính với gen ctxA và rfbO1, rfbO139. 5. Chỉ phát hiện được gen tcpA đặc trưng cho V. cholerae O1 biotype El Tor ở 3/16 mẫu bệnh phẩm, không mẫu nào cho kết quả dương tính với rstR đặc trưng cho V. cholerae O1
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phương pháp phát triển kỹ thuật trên các mẫu bệnh khác để có được kỹ thuật PCR phát hiện nhiều các biến chủng của V. choleare.
- Mở rộng phương pháp nghiên cứu sang các đối tượng gây bệnh truyền nhiễm khác để xây dựng các quy trình tương tự.
- Nghiên cứu, kết hợp PCR với các phương pháp khác để cải tiến hiệu quả nghiên cứu và ứng dụng cho thực tế.
- Thử nghiệm phát hiện các mẫu bệnh nhiễm V. choleare với cỡ mẫu lớn hơn và đưa kỹ
thuật PCR xây dựng được áp dụng trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng để đánh giá hiệu quả chẩn đoán của kỹ thuật tạo ra.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Trần Linh Thước (2009), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục.
2. Nguyễn Vũ Trung và Nguyễn Thị Hồng Nhung (2008), Hoàn thiện kỹ thuật tách
chiết ADN của Shigella và EIEC trực tiếp từ phân, Nghiên cứu y học, 55(3):
p.104-109.
3. Nguyễn Vũ Trung và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2008), Phát triển và hoàn thiện qui
trình tách chiết AND xác định trực tiếp Escherichia coli gây tiêu chảy bằng PCR,
Nghiên cứu y học, 56(4): p. 92-97.
4. Phạm Thế Vũ (2008), Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh
Vibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008, Luận văn
thạc sĩ Sinh học: 29 – 31. Tài liệu tiếng Anh
5. Agarwal, V., et al., 1995. Rapid detection of Vibriocholerae 0139 in faecal
specimens by coagglutination. Indian J Med Res. 101: p. 55-6.
6. Albert, M. J. (1993). Personal reflections on the discovery of Vibrio cholerae 0139
synonym Bengal: a tribute to team work and international collaboration. J.
Diarrhoeal Dis. Res. 11:207-210.
7. Alvarez, J., et al., 2004. Development of a multiplex PCR technique for detection
and epidemiological typing of salmonella in human clinical samples. J Clin
Microbiol. 42(4): p. 1734-8.
8. Bani, S., et al., (2007). Molecular characterization of ICEVchVie0 and its
disappearance in Vibrio cholerae O1 strains isolated in 2003 in Vietnam. FEMS
Microbiol Lett 266(1): 42-88.
9. Bauer .A and L.M. Rørvik, (2003). A novel multiplex PCR for the identification of
Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus, Letters in Applied
10.Beltran, P., Delgado, G., Navarro, A., Trujillo, F., Selander, R. K. & Cravioto, A.
(1999). Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae. J Clin
Microbiol 37, 581–590.
11.Bhanumathi R, Sabeena F, Isac SR, Radhakutty G & Singh DV, (2002).
Characterization of a toxigenic Vibrio cholerae O139 strain belonging to a new ribotype and isolated from a diarrheal patient. J Clin Microbiol 40: 4779–4781.
12.Bik EM, Bunschoten AE, Gouw RD & Mooi FR, (1995). Genesis of the novel
epidemic Vibrio cholerae O139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis. EMBO J 14: 209–216.
13.Bik, E. M., A. E. Bunschoten, R. D. Gouw, and F. R. Mooi, (1995). Genesis of the
novel epidemic Vibrio cholerae O139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis. EMBO J. 14:209–216.
14.Calia KE, Murtagh M, Ferraro MJ & Calderwood SB, (1994). Comparison of
Vibrio cholerae O139 with V. cholerae O1 classical and El Tor biotypes. Infect
Immun 62: 1504–1506.
15.Chakraborty S, Garg P, Ramamurthy T et al. (2001). Comparison of antibiogram,
virulence genes, ribotypes and DNA fingerprints of Vibrio cholerae of matching serogroups isolated from hospitalised diarrhoea cases and from the environment during 1997–1998 in Calcutta, India. J Med Microbiol 50: 879–888
16.Chakraborty S, Mukhopadhyay AK, Bhadra RK et al, (2000). Virulence genes in
environmental strains of Vibrio cholerae. Appl Environ Microbiol 66: 4022–4028.
17.Chow, K. H., Ng, T. K., Yuen, K. Y. & Yam, W. C. (2001). Detection of RTX
toxin gene in Vibrio cholerae by PCR. J Clin Microbiol 39, 2594–2597.
18.Chow, K.H., et al., 2001. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR. J Clin Microbiol. 39(7): p. 2594-7.
19.Comstock, L. E., J. A. Johnson, J. M. Michalski, J. G. Morris, Jr., and J. B. Kaper,
(1996). Cloning and sequencing of a region encoding a surface polysaccharide of
Vibrio cholerae O139 and characterisation of the insertion site in the chromosome of Vibrio cholerae O1. Mol. Microbiol. 19:815–826.
20.DePaola, A. (1981). Vibrio cholerae in marine foods and environmen-tal waters: a
literature review. J. Food Sci, 66-70.
21.Devarati Dutta, Goutam Chowdhury, Gururaja P. Pazhani, Sucharita Guin,
Sanjucta Dutta, et al (2013). Vibrio cholerae Non-O1, Non-O139 Serogroups and
Cholera-like Diarrhea, Kolkata, India. www.cdc.gov/eid, Vol. 19, No. 3, March
2013.
22.Dong Tu Nguyen, Tuan Cuong Ngo, Huy Hoang Tran, Thanh Huong Le, Hoai Thu
Nguyen, (2012), Characterization of Vibrio cholerae O139 of an Aquatic Isolate in
Northern Vietnam. Open Microbiol J, 6: 14-21.
23.Dutta B, Ghosh R, Sharma NC, Pazhani GP, Taneja N, Raychowdhuri A, et al.
(2006). Spread of cholera with newer clones of Vibrio cholerae O1 El Tor,
serotype Inaba, in India. J Clin Microbiol; 44 : 3391-3.
24.Faruque SM, Roy SK, Alim ARMA, Siddique AK, Albert MJ. (1995). Molecular
epidemiology of toxigenic Vibrio cholera in Bangladesh studied by numerical analysis of rRNA gene restriction patterns. J Clin Microbiol; 33 : 2833-8.
25.Faruque SM, Sack DA, Sack RB, Colwell RR, Takeda Y & Nair GB
(2000).Emergence and evolution of Vibrio cholerae O139. Proc Natl Acad Sci
USA 100: 1304–1309
26.Faruque, S. M., Tam, V. C., Chowdhury, N., Diraphat, P., Dziejman, M.,
Heidelberg, J. F., Clemens, J. D., Mekalanos, J. J. & Nair, G. B. (2007). Genomic
analysis of the Mozambique strain of Vibrio cholera O1 reveals the origin of El Tor strains carrying classical CTX prophage. Proc Natl Acad Sci USA 104, 5151–
5156.
27.Fields, P.I., et al., 1992. Use of polymerase chain reaction for detection of
toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic. J
Clin Microbiol. 30(8): p. 2118-21.
28. Garg P, Nandy RK, Chaudhry P, Chaudhry NR, De K, Ramamurthy T, et al
(2003). Emergence of V. cholerae O1 biotype EI Tor serotype Inaba from
29.Goel, A. K., Jain, M., Kumar, P., Sarguna, P., Bai, M., Ghosh, N. & Gopalan, N.
(2011). Molecular characterization reveals involvement of altered El Tor biotype
Vibrio cholerae O1 strains in cholera outbreak at Hyderabad, India. J Microbiol
49, 280–284.
30.Hemant Kumar Khuntia, Bibhuti Bhusan Pal and Guru Prasada Chhotray, (2008).
Quadruplex PCR for Simultaneous Detection of Serotype, Biotype, Toxigenic Potential, and Central Regulating Factor of Vibrio cholera. J. Clin. Microbiol.
vol. 46 no. 7 2399-2401
31.Hoshino, K., Yamasaki, S., Mukhopadhyay, A. K., Chakraborty, S., Basu, A.,
Bhattacharya, S. K., Nair, G. B., Shimada, T. & Takeda, Y. (1998). Development
and evaluation of a multiplex PCR assay for rapid detection of toxigenic Vibrio c cholerae O1 and O139. FEMS Immunol Med Microbiol 20, 201–207.
32.Jacob John T, Mary V. Jesudason (1972). The First Epidemic of Vibrio cholerae
O139. J Clin Microbiol; Vol. 33, No. 7, 49-53.
33.Jiang SC, Matte M, Matte G, Huq A & Colwell RR (2012). Genetic diversity of
clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism fingerprinting. Appl Environ Microbiol 66: 148–
153
34. Joao P.S. Cabral (2010). International Journal of Environmental Research and
Public Health, 1660-4601.
35. Joao P.S. Cabral (2010). Water Microbiology. Bacterial Pathogens and Water. Int. J. Environ. Res. Public Health 7: 3657-3703.
36.Johnson, J. A., C. A. Salles, P. Panigrahi, M. J. Albert, R. J. Johnson, and J. G.
Morris, Jr, (1994). Vibrio cholerae O139 synonym Bengal is closely related to
Vibrio cholerae El Tor but has important differences. Infect. Immun. 62: 2108–
2110.
37.Karaolis, D. K., R. Lan, and P. R. Reeves, (1994). Molecular evolution of the
seventh pandemic clone of Vibrio cholerae and its relationship to other pandemic and epidemic V. cholerae isolates. J. Bacteriol. 176:6199–6206.
38.Knirel, Y. A., L. Paredes, P. E. Jansson, A. Weintraub, G. Widmalm, and M. J.
Albert, (1995). Structure of the capsular polysaccharide of Vibrio cholera O139
synonym Bengal containing D-galactose 4,6-cyclophosphate. Eur. J. Biochem.
232:391–396.
39.Kumar, P., Peter, W. A. & Thomas, S. (2010b). Rapid detection of virulence-
associated genes in environmental strains of Vibrio cholera by multiplex PCR.
Curr Microbiol 60, 199–202.
40.Kwang, J., E.T. Littledike, and J.E. Keen, 1996. Use of the polymerase chain
reaction for Salmonella detection. Lett Appl Microbiol. 22(1): p. 46-51.
41.Lee JH, Han KH, Choi SYet al, (2006). Multilocus sequence typing (MLST)
analysis of Vibrio cholerae O1 El Tor isolates from Mozambique that harbour the classical CTX prophage. J Med Microbiol 55: 165–170.
42. Lesmana M, Subekti DS, Tjaniadi P, Simanjuntak CH, Punjabi NH, Campbell JR,
et al (2002). Spectrum of Vibrio species associated with acute diarrhea in North
Jakarta, Indonesia. Diagn Microbiol Infect Dis. 43:91–7.
43.Makino S, Kurazono T, Okuyama Y, Shimada T, Okada Y & Sasakawa C, (1995).
Diversity of DNA sequences among Vibrio cholerae O139 Bengal detected by PCR-based DNA fingerprinting. FEMS Microbiol Lett 126: 43–48.
44.Mandomando, I., Espasa, M., Valle` s, X., Sacarlal, J., Sigau´ que, B., Ruiz, J. &
Alonso, P. (2007). Antimicrobial resistance of Vibrio cholerae O1 serotype Ogawa
isolated in Manhic¸a District Hospital, southern Mozambique. J Antimicrob
Chemother 60, 662–664.
45.Mehrabadi JF, Morsali P, Nejad HR, Imani Fooladi AA, (2012). Detection of
toxigenic Vibrio cholerae with new multiplex PCR. J Infect Public Health.
5(3):263-7.
46.Morita, M., Ohnishi, M., Arakawa, E., Bhuiyan, N. A., Nusrin, S., Alam, M.,
Siddique, A. K., Qadri, F., Izumiya, H. & other authors (2008). Development and
validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor.
47.Morita, M., Ohnishi, M., Arakawa, E., Yamamoto, S., Nair, G. B., Matsushita, S.,
Yokoyama, K., Kai, A., Seto, K. & other authors (2010). Emergence and genetic
diversity of El Tor Vibrio cholerae O1 that possess classical biotype ctxB among travel-associated cases of cholera in Japan. J Med Microbiol 59, 708–712.
48.Morris JG Jr, (1994). Non-O1 Vibrio cholerae strains not associated with
epidemic disease. Vibrio Cholerae and Cholera: Molecular to Global Perspectives (Wachsmuth PAB & Olsvik Ø, eds), ASM Press, Washington, DC pp. 103–115..
49.Nair GB, Faruque SM, Bhuiyan NA, Kamruzzaman M, Siddique AK, Sack DA,
(2002). New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the
classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J
Clin Microbiol. 40(9):3296-9.
50.Nair, G. B., Qadri, F., Holmgren, J., Svennerholm, A. M., Safa, A., Bhuiyan, N. A., Ahmad, Q. S., Faruque, S. M., Faruque, A. S. G. & other authors (2006).
Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J Clin
Microbiol 44, 4211–4213.
51.Nandi B, Nandy RK, Vicente AC & Ghose AC, (2000). Molecular
characterization of a new variant of toxin-coregulated pilus protein (TcpA) in a toxigenic non-O1/Non-O139 strain of Vibrio cholerae. Infect Immun 68: 948–952.
52.Neelam Taneja, Garima Sangar, Goutam Chowdhury, (2012). Meenakshi Singh &
Meera Sharma Molecular epidemiology of Vibrio cholerae causing outbreaks & sporadic cholera in northern IndiaIndian . J Med Res 136, pp 656-663
53. Nguyen BM, Higa N, Kakinohana S, Iwanaga M (2002). Characterization of
Vibrio cholerae O1 isolated in Vietnam. Japanese Journal of Tropical Medicine
and Hygiene: 103 – 107.
54.Nguyen, B. M., Lee, J. H., Cuong, N. T., Choi, S. Y., Hien, N. T., Anh, D. D., Lee,
H. R., Ansaruzzaman, M., Endtz, H. P. & other authors (2009). Cholera outbreaks
caused by an altered Vibrio cholerae O1 El Tor biotype strain producing classical cholera toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. J Clin Microbiol 47, 1568–1571.
55.Nicholas A.Daniels, MD, MPH, Alireza Shafaie, MD (2000). A Review of
56.Pachara Senachai, Chariya Chomvarin, Wises Namwat, Warawan Wongboot,
Suwin Wongwajana and Waraluk Tangkanakul, (2013). Application of tetraplex
PCR for detection of Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus and V. minicus in cockle, Southeast Asian J Trop Med Public Health, Vol 44 No.
57.Popovic T, Bopp C, Olsvik O, Wachsmuth K. (1993). Epidemiologic application
of a standardized ribotype scheme for Vibrio cholerae 01. J Clin Microbiol; 31 :
2474-82.
58.Rivera in, Chun J, Sack Rb and Colwell Rr, (2001). Genotypes associated with
virulence in environmental isolates of Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol.
67 (6) 2421–2429.
59.Safa A, Bhuiyan NA, Alam M, Sack DA & Nair GB, (2005). Genomic relatedness
of the new Matlab variants of Vibrio cholerae O1 to the classical and El Tor biotypes as determined by pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 43:
1401–1404.
60.Sharma C, Nair GB, Mukhopadhyay AK, Bhattacharya SK, Ghosh RK, Ghosh A.
(1997). Molecular characterization of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor strains
isolated between 1992 and 1995 in Calcutta, India: evidence for the emergence of a new clone of the El Tor biotype. J Infect Dis; 175 : 1134-41.
61. Stephanie AC, Robert JO, Louise T, Seth S (2001). PCR-Based Diagnosis of Helicobacter pylori Infection and Real-Time Determination of Clarithromycin Resistance Directly from Human Gastric Biopsy Samples. Journal of clinical microbiology, p. 1217–1220.
62.Taneja N, Biswal M, Tarai B, Sharma M. (2005). Emergence of Vibrio cholerae
O1 biotype El Tor serotype Inaba in North India. Jap J Infect Dis 58 : 238-40.
63.Tran, H. D., Alam, M., Trung, N. V., Kinh, N. V., Nguyen, H. H., Pham, V. C.,
Ansaruzzaman, M., Rashed, S. M., Bhuiyan, N. A. & other authors (2012). Multi-
drug resistant Vibrio cholerae O1 variant El Tor isolated in northern Vietnam between 2007 and 2010. J Med Microbiol 61, 431–437.
64. Vijayalakshmi .N, R. S.rao and S.Badrinath (1997). Minimum inhibitory
concentration (MIC) of some antibiotics against Vibrio cholerae O139 isolates from Pondicherry. Epidemiology and Infection. 119(1)25.
Các website 65.http://swissmodel.expasy.org 66. http://www.aaes.auburn.edu/comm/pubs/highlightsonline/spring99/phytase.html 67. http://www.ebi.ac.uk 68. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 69. http://www.soyte.hanoi.gov.vn/.../Infectious%20diseases%20in%20Vietnam%2