3. Nội dung nghiên cứu
1.3.4. Ứng dụng kĩ thuật PCR tron gy học
Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn ADN rất nhỏ như: một giọt máu, một sợi tóc hay một tế bào… người ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự một lượng lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng. Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN…
PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học: trong chẩn đoán bệnh ung thư (tìm
HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA 1 -
BRCA 2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen IgH và TCRy trong
u lympho không Hodgkin, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ
thần kinh…), nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…
Trong Vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu dụng để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh trong các trường hợp:
* Tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, erpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1…), các vi khuẩn
(Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).
* Tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm: M. tuberculosis.
* Tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị kháng sinh trước đó (vd: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu…).
PCR cũng được dùng để xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố
ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli và gần đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic Escherichia coli, ETEC); vt1 và vt2 của E. coli gây chảy máu đường ruột (enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E. coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của E.coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại Escherichia coli gây tiêu chảy.
PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn. Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT - cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng. PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó,
có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio
cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG). Clostridium difficile cũng được định
PCR còn được dùng để nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn. Từ trước đến nay, tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh được xác định bằng các kỹ thuật dựa trên nuôi cấy như kháng sinh đồ theo Kirby Bauer (khuếch tán trên thạch) và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimal Inhibitory Concentration). Các kỹ thuật này chiếm nhiều thời gian nên khó cho phép có định hướng điều trị kịp thời trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp. Ngoài ra, các kỹ thuật nuôi cấy có hiệu quả phục vụ điều trị không cao đối với một
số vi sinh vật, như Mycobacterium tuberculosis, có thời gian tăng trưởng rất dài (nhiều
tuần lễ). Với kỹ thuật PCR, người ta có thể phát hiện nhanh tính kháng thuốc của các
chủng vi khuẩn gây bệnh qua khảo sát gen kháng thuốc. Ví dụ, khảo sát gen pbp1a và 2a của Streptococcus pneumoniae bằng kỹ thuật PCR-SSCP, kỹ thuật PCR phát hiện đột biến kháng Rifamicin ở gen rpoB , phát hiện kháng INH do thiếu gen catalase (gen Kat
G) của vi khuẩn Lao...
Trong lĩnh vực ký sinh trùng, người ta dùng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lỵ
amíp, Leishmania, Echinococcus, Microsporidia, Giardia, Cryptosporidium, Toxoplasma
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 7 năm 2013.
Thu thập mẫu nghiên cứu từ những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp nghi ngờ mắc tả tại khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn tại bệnh viện Quân y 103.
Chẩn đoán xác định V. cholerae và thực hiện kỹ thuật PCR tại khoa Kiểm soát nhiễm
khuẩn tại bệnh viện Quân y 103. 2.2 Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Chủng giống vi sinh vật
Gồm các chủng V. Cholerae phân lập được từ bệnh nhân trong quá trình nghiên
cứu.
Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
+ V. cholerae O1: VN01/07
+ V. cholerae O139: AI4450
Các chủng này do Viện Các bệnh Truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia cung cấp được dùng làm mẫu chứng dương tính để kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi. + Chủng Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter spp, E. coli ATCC 11775 gây tiêu chảy. Các chủng này do Đề án Lưu
giữ nguồn gen Vi sinh vật Y học, Bộ môn Vi sinh vật, Đại học Y Hà Nội cung cấp, được dùng làm mẫu chứng âm tính để kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi.
2.2.2. Mồi PCR
Bảng 2.1. Các đoạn mồi dùng trong kỹ thuật m-PCR phát hiện gen đặc hiệu
của V. cholerae
Tên mồi Trình tự mồi Mã
hóa gen Xác định chủng Kích thước gen (bp) ctxA-F ctxA-R 5’ TGGGCAGATT CTAGACCTCC TG 3’
5’ CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC 3’ ctxA V. cholerae 302
O1rfb-F O1 rfb-R 5’AGCGAGTCAATCAACCCATC 3’ 5’ CCCAGCATTCGTGACCCGAC 3’ rfbQ V. cholerae O1 192 O139rfb-F O139rfb-R 5’ CAGGGAACCGCATGAAGGTCG 3’ 5’AATGAAGCTTCTTGCAAAGCTAACGG 3’
IS1358 V. cholerae O139 449
tcpA-F tcpA-R 5’ CAATTATTAAACGCTTTAAGAG 3’ 5’ TCCACGTGCGTTACGTCTGTTAAG 3’ tcpA V. cholerae O1 El Tor 451 rstR -F rstR -R 5’AAGATAAGAAGGCTAGCC 3’ 5’TGTACGAAGGAGGCCATC 3’ rstR V. cholerae O1 Classical 620 2.3. Hóa chất và thiêt bị 2.3.1. Hóa chất
Môi trường Carry-blair, TCBS, Thạch kiềm pH 8,5-9,5 (Mecrk – Đức), Tris-base
(Sigma, Mỹ); axit axetic, axit clohidric, natri hidroxit, ethanol, iso-propanol, glycerol, canxi clorua, natri clorua, chloroform, iso-amyl alcohol, phenol, SDS, EDTA, glucose (Merk,
học phân tử khác đều tinh khiết ở mức phân tích.
Các bộ kit tách chiết ADN, HF ADN polymeraze (Fermentas, Đức).
2.3.2. Thiết bị
Các thiết bị, máy móc dùng trong nghiên cứu thuộc khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn tại bệnh viện Quân y 103, bao gồm: tủ ấm, tủ sấy (Binder, Đức); nồi hấp thanh trùng (Tommy, Nhật); máy li tâm (Sorval, Mỹ); quang phổ kế (UV- VIS, Shimazdu, Nhật); máy lắc ổn nhiệt (BR300LF 25 và Memmert, Đức); máy đo pH (MP200R, Thụy Sĩ); cân điện (Shimadzu, Nhật); cân phân tích (Precisa XT 320M, Thụy Sĩ); máy lọc nước siêu sạch (Millipore, Mỹ); máy làm đá (Brema, Đức); tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu - 70C (Sanyo, Nhật); máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ); tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật); máy vortex (Kika, Đức); bộ điện di ADN (Bio Rad, Mỹ); bàn UV soi ADN (ETX-20C, Mỹ). Các loại pipet từ 0,2 µl - 5 ml (Gilson, Pháp) và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.3.3. Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm
Môi trường nuôi cấy
Môi trường Carry-blair, TCBS. Các môi trường trên đều được chuẩn bị trong nước cất 1 lần, bổ sung thạch 20g/l (nếu cần), hòa tan đều bằng khuấy từ có gia nhiệt và đem khử trùng trong chai thủy tinh trung tính ở 121C, 1at trong 15 phút.
Dung dịch đệm
Dung dịch TE: 1M Tris- HCl, pH 8; 0,5M EDTA, pH 8.
Dung dịch TAE 50X đậm đặc: 242 g Tris- base; 57,1 ml axit axetic; 100 ml dung dịch
0,5M EDTA, pH 8; thêm nước cất cho đến 1000 ml.
Dung dịch thuốc nhuộm mẫu chạy điện di ADN (Loading dye): 0,25% bromphenol blue; 0,25% xylene cyanol FF; 30% glycerol.
2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp mô tả 2.4.1. Phương pháp mô tả
- Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang: Nhằm đánh giá tình hình dịch tễ liên quan đến yếu tố mắc bệnh của bệnh nhân, mô tả hiện tượng sức khỏe và các yếu tố nguy cơ có liên quan đến sức khỏe đó một cách chính xác để tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm, điều tra cắt ngang sự phân bố tình trạng mắc bệnh tại thời điểm đang xảy ra dịch
[37].
- Nghiên cứu thực nghiệm labo để đánh giá tỷ lệ phát hiện V.cholerae O1 đồng
thời phân tích đánh giá hiệu quả của các phương pháp nghiên cứu để đưa ra tính ưu việt, phù hợp nhằm áp dụng thực tiễn tại cơ sở [37].
2.4.1.1. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
Tính cỡ mẫu : Áp dụng công thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu mô tả
(1 /2) 2 p(1-p) n Z d n: cỡ mẫu α = 0,05 ; độ tin cậy 95%
Z(1-α/2) : hệ số tin cậy. Với độ tin cậy là 95% thì hệ số tin cậy Z(1-α/2) = 1,96
p = 0,5 : Tỷ lệ bệnh nhân bị tiêu chảy cấp phải nằm viện (giả định). d : sai số tuyệt đối chấp nhận = 6 % = 0,06
Thay vào công thức (1) có n = 136 Cỡ mẫu thu thập được là: 162
Chọn mẫu có chủ đích là những bệnh nhân bị bệnh tiêu chảy cấp có triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh tả. Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 12.0 với các test thống kê thường dùng trong y tế, gồm: tần suất, tỷ lệ %, tỷ suất chênh OR, so sánh sự khác nhau giữa các phương pháp bằng test 2.
2.4.1.2. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm
* Kỹ thuật lấy mẫu
Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm là một bước quan trọng trong quá trình phân lập và phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm không đúng cách sẽ ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán tác nhân gây bệnh và điều trị, mẫu bệnh phẩm là phân hoặc chất nôn, thức ăn, chất chứa trong ruột non, ruột già sau khi mổ tử thi và người tiếp xúc với bệnh nhân, mẫu được thu thập càng sớm càng tốt trước khi điều trị kháng sinh.
Mẫu bệnh phẩm là phân phải được lấy càng sớm vì vi khuẩn ở trong phân rất nhiều trong những ngày đầu của bệnh và trước khi bắt đầu điều trị kháng sinh, sau khi lấy cho
vào lọ không có chất khử khuẩn hoặc chất tẩy rửa, nút lọ được đậy chặt chống rò rỉ, có thể lấy phân bằng ống thông trực tràng hoặc tăm bông vô trùng, bệnh phẩm cần được giữ nhiệt độ 4oC - 8oC và đưa ngay đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ, nếu ở ổ dịch xa phòng xét nghiệm, bệnh phẩm cần lấy bằng tăm bông vô trùng sau đó cho vào lọ có chứa môi trường vận chuyển Carry - Blair và đưa về phòng xét nghiệm sớm trong điều kiện không cần giữ lạnh.
Mẫu thực phẩm cần đảm bảo tính đại diện, thu thập mẫu tại nhiều vị trí trên thực phẩm, khối lượng mỗi mẫu khoảng 25 gam, mẫu được chuyển về phòng xét nghiệm sớm. Mẫu nước thu thập có tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm, chọn nhiều vị trí mẫu khác nhau, tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu thập, lấy nước vào bình thuỷ tinh vô trùng 500-1000ml, nếu lấy ở sông cần chọn nơi nước chảy giữa dòng độ sâu 20-30 cm.
Giám sát người lành mang trùng trong một vụ dịch tả, tất cả những người tiếp xúc gần gũi với bệnh nhân tả đều được coi là có thể mang mầm bệnh và vì vậy cần được theo dõi sức khỏe liên tục trong vòng 5 ngày kể từ lần tiếp xúc cuối cùng, để kịp thời phát hiện ca bệnh mới. Với những người tiếp xúc ở đầu vụ dịch cần được lấy phân xét nghiệm tìm vi khuẩn tả. Những người tiếp xúc gần và người lành mang vi khuẩn tả (phát hiện qua xét nghiệm phân) phải được điều trị dự phòng bằng kháng sinh. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh được lấy 2 lần trong giai đoạn cấp tính và giai đoạn hồi phục.
* Bảo quản bệnh phẩm
Cần được giữ vào môi trường bảo quản và vận chuyển khi ở xa phòng xét nghiệm và bệnh phẩm không được làm xét nghiệm sau 2 giờ (tính từ khi thu thập mẫu). Môi trường vận chuyển Carry-Blair là môi trường tốt nhất để bảo quản và vận chuyển, có thể dùng dung dịch đệm glyxerin, môi trường vận chuyển đã thu thập mẫu được chuyển sớm tới phòng xét nghiệm hoặc giữ ở tủ lạnh 40C (nếu chưa được xét nghiệm ngay). Trong vụ dịch tả nguy hiểm mẫu bệnh phẩm cần được lưu giữ trong hộp sắt kín để tránh lây lan trong quá trình vận chuyển.
2.4.2. Phương pháp cấy truyền và giữ giống vi sinh vật
Nuôi cấy và giữ giống V. cholerae đối chứng dương
Nuôi vi khuẩn V. cholerae trên môi trường môi trường thạch TCBS ở 37°C qua
quản ở 4°C, cấy chuyển 1 lần mỗi tháng. Để giữ giống trên 1 năm, sinh khối VSV được hòa đều trong dung dịch 15% glycerol và bảo quản trong tủ lạnh sâu -80C.
2.4.3. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen appA và phyC
Trình tự các gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR của V. choleare được thu thập
từ ngân hàng gen NCBI của Viện Thông tin Y sinh, Mỹ, để phân tích và thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR. Các trình tự nucleotide và protein của gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR trong các chủng vi khuẩn khác nhau này được so sánh với nhau bằng chương trình ClustalW2 [65]. Đoạn trình tự axit amin giống nhau nhất về phía hai đầu của các protein đã được chọn và chuyển thành trình tự các nucleotide để sử dụng làm mồi.
2.4.4. Tách chiết ADN khuôn mẫu bằng KIT QIAGEN
Tách chiết từ chủng vi khuẩn
+ Lấy 4-5 khuẩn lạc trộn đều với 200µl nước cất.
+ Đun cách thủy ở 950C trong 10 phút sau nhấc ra cho ngay vào đá.
+ Ly tâm 10.000 vòng/2 phút lấy nước nổi làm khuôn mẫu AND cho phản ứng PCR.
Tách chiết trực tiếp từ phân: Sử dụng kit QIAGEN
+ Nhỏ 300µl dịch phân tiêu chảy vào týp eppendorf 1,5ml có chứa 600µl NaCL 0.09%.
+ Ly tâm 2500 vòng x 2 phút để loại bỏ cặn. + Hút dịch nổi sang một týp eppendorf mới.
+ Ly tâm 13.000 vòng x 10 phút để loại bỏ nước nổi, thu cặn vi khuẩn. + Trộn đều cặn vi khuẩn trong 180µl dung dịch ALT.
+ Nhỏ 20µl protein K trộn đều bằng máy trộn voltex.
+ Ủ 560C trong máy ủ nhiệt cho đến khi vi khuẩn ly giải hoàn toàn (thỉnh thoảng mix nhẹ bằng máy trộn voltex).
+ Trộn đều bằng máy trộn voltex trong 15 giây, nhỏ 200µl dung dịch AL, trộn đều sau đó nhỏ 200µl cồn tuyệt đối và trộn đều.
+ Hút toàn bộ hỗn hợp nhỏ vào cột DNeasy Mini spin coumn, ly tâm 8000 vòng x 1 phút.
+ Nhỏ 500µl dung dịch rửa AW1, ly tâm 8000 vòng x 1 phút.
+ Rửa cột bằng cách nhỏ 500µl dung dịch rửa AW2, ly tâm 14000 vòng x 3 phút.
+ Chuyển cột sang týp eppendorf sạch và nhỏ 75µl dung dịch AE vào trung tâm cột, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 8000 vòng x 1 phút thu ADN tách chiết để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.
2.4.5. Phương pháp m-PCR dùng để xác định nhanh serogroup O1, O139 và hai
biotype của V. cholerae serogroup O1
2.4.5.1. Phản ứng m-PCR1
Bảng 2. 2. Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR1 đa mồi bằng Master-Mix (promega)
Thành phần phản ứng 1 mẫu (µl) 10 mẫu (µl) 2X Master-Mix: 15 150 Primers (mồi) ctxA-F ctxA-R 1µl/mồi (0.5µM) 20 O1rfb-F O1 rfb-R 1µl/mồi (0.25µl) 20 O139rfb-F O139rfb-R 1µl /mồi (0.167µM) 20 Nước siêu sạch 6 60 Tổng số: 27 270
+ Trộn đều chia mỗi tube 27µl.
Sau bước biến tính ở 94°C trong 1 phút 30 giây, kế tiếp là 30 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây) và kết thúc với pha hoàn tất ở 72°C trong 7 phút.
2.4.5.1. Phản ứng m-PCR2
Bảng 2. 3. Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR2 đa mồi bằng Master-Mix (promega) Thành phần phản ứng 1 mẫu (µl) 10 Mẫu (µl) 2X Master-Mix 15 150 Cặp primers tcpA-F tcpA-R 1 20 rstR -F rstR –R 1 20 Nước siêu sạch 8 80 Tổng số: 27 270
+ Trộn đều chia mỗi tube 27µl.
+ Cho 3µl ADN khuôn mẫu vào các tube chứa hỗn dịch PCR.
Thực hiện phản ứng m-PCR2 trên máy luân nhiệt Các bước Nhiệt độ Thời gian Chu trình nhiệt Biến tính 940C 1 phút 30 giây 30 chu kì Biến tính 940C 30 giây Gắn mồi 470C 30 giây Tổng hợp 720C 30 giây Kết thúc 720C 7 phút Giữ ở nhiệt độ 40C
2.4.6. Điện di sản phẩm PCR
Điện di ADN là phương pháp điện di ngang trên bản gel agarose, nhằm phân tách các đoạn ADN có kích thước phân tử khác nhau. Quy trình điện di được tiến hành theo 3