3. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Phân tích trình tự gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR
* Phân tích trình tự gen ctxA mã hóa cholera toxin từ V. cholerae
Trong kỹ thuật PCR, mồi là một trong các yếu tố quan trọng quyết định việc khuếch đại thành công một đoạn ADN từ hỗn hợp ADN khuôn. Để có thể phát hiện gen
ctxA thành công từ bộ gen của V. cholerae bằng phản ứng PCR, chúng tôi cần phải thiết
kế được cặp mồi đặc hiệu cho gen này.
Căn cứ vào sự tương đồng về trình tự nucleotit của gen ctxA từ 4 chủng Vibrio
cholerae đã được nghiên cứu (Bảng 3.4), các cặp mồi thích hợp phát hiện gen ctxA bằng
phản ứng PCR đã được thiết kế.
Bảng 3.4. Danh sách các chủng V. Cholerae đã được nghiên cứu để thiết kế mồi
STT Mã số gen ctxA trong ngân
hàng gen (gene bank) Tên chủng
1 AY376267 Vibrio cholerae strain B
2 DQ523223 Vibrio cholerae O1 strain R001 3 HM587310 Vibrio cholerae O139 strain TV258
4 AY376268 Vibrio cholerae strain F
gi|39612499|gb|AY376268.1| TGGGCAGATTCTAGACCTCCTGATGAAATAAAGCAGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGA gi|67255432|gb| DQ523223| TGGGCAGATTCTAGACCTCCTGATGAAATAAAGCAGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGA gi|51855461|gb| HM587310| TGGGCAGATTCTAGACCTCCTGATGAAATAAAGCAGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGA gi|39577446|gb|AY376267.1| CGGGCAGATTCTAGACCTCCTGATGAAATAAAGCAGTCAGGTGGTCTTATGCCAAGAGGA *********************************************************** gi|39612499|gb|AY376268.1| CAGAGTGAGTACTTTGACCGAGGTACTCAAATGAATATCAACCTTTATGATCATGCAAGA gi|67255432|gb| DQ523223 | CAGAGTGAGTACTTTGACCGAGGTACTCAAATGAATATCAACCTTTATGATCATGCAAGA gi|51855461|gb| HM587310 | CAGAGTGAGTACTTTGACCGAGGTACTCAAATGAATATCAACCTTTATGATCATGCAAGA gi|39577446|gb|AY376267.1| CAGAGTGAGTACTTTGACCGAGGTACTCAAATGAATATCAACCTTTATGATCATGCAAGA ************************************************************
gi|39612499|gb|AY376268.1| GATAGATATTACAGTAACTTAGATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGT gi|67255432|gb| DQ523223 | GATAGATATTACAGTAACTTAGATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGT gi|51855461|gb| HM587310 | GATAGATATTACAGTAACTTAGATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGT gi|39577446|gb|AY376267.1| GATAGATATTACAGTAACTTAGATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGT ************************************************************ gi|39612499|gb|AY376268.1| TTCCCTCCGGAGCATAGAGCTTGGAGGGAAGAGCCGTGGATTCATCATGCACCGCCGGGT gi|67255432|gb| DQ523223 | TTCCCTCCGGAGCATAGAGCTTGGAGGGAAGAGCCGTGGATTCATCATGCACCGCCGGGT gi|51855461|gb| HM587310 | TTCCCTCCGGAGCATAGAGCTTGGAGGGAAGAGCCGTGGATTCATCATGCACCGCCGGGT gi|39577446|gb|AY376267.1| TTCCCTCCGGAGCATAGAGCTTGGAGGGAAGAGCCGTGGATTCATCATGCACCGCCGGGT ************************************************************ gi|39612499|gb|AY376268.1| TGTGGGAATGCTCCAAGATCATCG gi|67255432|gb| DQ523223 | TGTGGGAATGCTCCAAGATCATCG gi|51855461|gb| HM587310 | TGTGGGAATGCTCCAAGATCATCG gi|39577446|gb|AY376267.1| TGTGGGAATGCTCCAAGATCATCG ************************
Hình 3.3. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của
4 gen mã hóa cholera toxin có nguồn gốc từ V. cholerae [68]
Dựa vào kết quả so sánh trình tự nucleotide của 4 gen mã hóa các cholera toxin có nguồn gốc từ V. cholerae (Hình 3.3) chúng tôi nhận thấy có sự sai khác ở trình tự
nucleotide 1 ở đầu 5’ không có sự khác nhau ở đầu 3’, tuy nhiên sự khác nhau này chỉ xảy ra giữa chủng Vibrio cholerae strain B (AY376267) với 3 cholera toxin còn lại, ba chủng
còn lại không có sự sai khác ở đầu C và đầu N nên có thể sử dụng trình tự ADN mã hóa
cho một trong 3 cholera toxin này để thiết kế mồi khuếch đại gen ctxA.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gen ctxA của V. cholerae strain F được
đăng ký trên Genbank mã số AY376268 đã được phân tích kĩ [68] và dịch mã trong hệ
biểu hiện của V. cholerae để thiết kế mồi. Trình tự gen này được thể hiện trong hình 3.4.
ORIGIN
1 CGGGCAGATT CTAGACCTCC TGATGAAATA AAGCAGTCAG GTGGTCTTAT GCCAAGAGGA 61 CAGAGTGAGT ACTTTGACCG AGGTACTCAA ATGAATATCA ACCTTTATGA TCATGCAAGA 121 GGAACTCAGA CGGGATTTGT TAGGCACGAT GATGGATATG TTTCCACCTC AATTAGTTTG 181 AGAAGTGCCC ACTTAGTGGG TCAAACTATA TTGTCTGGKC ATTCTACTTA TTATATATAT 241 GTTATAGCCA CTGCACCCAA CATGTTTAAC GTTAATGATG TATTAGGGGC ATACAGTCCT 301 CATCCAGATG AACAAGAAGT TTCTGCTTTA GGTGGGATTC CATACTCCCA AATATATGGA 361 TGGTATCGAG TTCATTTTGG GGTGCTTGAT GAACAATTAC ATCGTAATAG GGGCTACAGA 421 GATAGATATT ACAGTAACTT AGATATTGCT CCAGCAGCAG ATGGTTATGG ATTGGCAGGT 481 TTCCCTCCGG AGCATAGAGC TTGGAGGGAA GAGCCGTGGA TTCATCATGC ACCGCCGGGT 541 TGTGGGAATG CTCCAAGATC ATCG
Hình 3.4. Trình tự gen ctxA mã hóa cholera toxin từ
* Phân tích trình tự gen rfbQ từ V. cholera O1
Cặp mồi để phát hiện gen rfbQ nằm trong vùng gen rfb mã hóa cho kháng nguyên đặc hiệu O1 và IS1358 đặc hiệu cho chủng O139. Căn cứ vào sự tương đồng về trình tự nuclêôtít của rfbQ từ 2 chủng V. cholera O1 đã được nghiên cứu để thiết kế cặp mồi thích hợp nhằm khuếch đại đoạn gen rfbQ bằng phản ứng PCR.
Bảng 3.5. Danh sách các chủng V. cholera O1 đã được sử dụng để thiết kế mồi
STT Mã số trên ngân hàng
gen (Genbank NCBI) Tên chủng 1 CAA42147 Vibrio cholerae O1
2 AAA77031 Vibrio cholera O1 strain MO45
Sự tương đồng về trình tự gen mã hóa các rfbQ của 2 chủng Vibrio cholerae O1
trên được thể hiện trong hình 3.5
gi| CAA42147.1| ATGAGCGAGTCAATCAACCCATTTATGCATTTCCAAATCATTAAAGACTATCGACAAGAA gb| AAA77031.1| ATGAGCGAGTTAATCAACCCATTTATGCATTTCCAAATCATTAAAGACTATCGACAAGAA ********** ************************************************* gi| CAA42147.1| AGCAAAGTAGAACACAAATTATCAGACATTATTTTGCTGACAATATGTGGTGTTTTGTCG gb| AAA77031.1| AGCAAAGTAGAACACAAATTATCAGACATTATTTTGCTGACAATTTGTGGTGTTTTGTCG ******************************************** *************** gi| CAA42147.1| GGTCACGATGGCTGGGATGGCATTATCGATTTTGGTCATGCTCGCTTAGATTTCCTTAAA gb| AAA77031.1| TGTCACGATGGCTGGGATGGCATTATCGATTTTGGTAATGCTCGCTTAGATTTCCTTAAA *********************************** *********************** gi| CAA42147.1| CGATATGGTCACTTTTAA
gb| AAA77031 | CGATATGGTCAC--- ************
Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của 2 gen rfbQ có nguồn gốc từ V. cholerae O1 [68]
Dựa vào kết quả so sánh trình tự nucleotide của 2 gen rfbQ có nguồn gốc từ V.
cholerae O1 (Hình 3.5) chúng tôi nhận thấy có sự sai khác ở trình tự nucleotide 11 ở đầu
5’ không có sự khác nhau ở đầu 3’. Chúng tôi có thể sử dụng trình tự ADN mã hóa cho
rfbQ này để thiết kế mồi khuếch đại gen rfbQ.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gen rfbQ của Vibrio cholera O1 strain
MO45 được đăng ký trên Genbank mã số AAA77031 đã được phân tích kĩ [68] và dịch
mã trong hệ biểu hiện của V. cholerae để thiết kế mồi. Trình tự gen này được thể hiện trong hình 3.6.
ORIGIN
1 ATGAGC GAGTCAATCA
17 ACCCATTTAT GCATTTCCAA ATCATTAAAG ACTATCGACA AGAAAGCAAA GTAGAACACA 77 AATTATCAGA CATTATTTTG CTGACAATAT GTGGTGTTTT GTCGGGTCAC GATGGCTGGG 137 ATGGCATTAT CGATTTTGGT CATGCTCGCT TAGATTTCCT TAAACGATAT GGTCACTTTT 197 AA
Hình 3.6. Trình tự gen rfbQ từ V. cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi [68]. * Phân tích trình tự gen IS1358 từ V. cholera O139
Căn cứ vào sự tương đồng về trình tự nuclêôtít của gen IS1358 từ 3 chủng V.
cholera O139 đã được nghiên cứu để thiết kế cặp mồi thích hợp nhằm khuếch đại đoạn
gen IS1358 bằng phản ứng PCR.
Bảng 3.6. Danh sách các chủng V. cholera O139 đã được sử dụng để thiết kế mồi
STT Mã số trên ngân hàng
gen (Genbank NCBI) Tên chủng
1 U93597.1 Vibrio cholerae O139 strain Z17561
2 U93596.1 Vibrio cholera O139 strain H1
3 U93595.1 Vibrio cholerae strain CA401
Sự tương đồng về trình tự gen mã hóa IS1358 của 3 chủng Vibrio cholerae O139
trên được thể hiện trong hình 3.7
gi|4100119|gb|U93596.1| CAGGGAAACCGCATGAAGGTCGTTGATATATAAGGGCTGCGGTGATGCTTAGAATAAGTT gi|4100120|gb|U93597.1| CAGGGAAACCGCATGAAGGTCGTTGATATATAAGGGCTGCGGTGATGCTTAGAATAAGTT gi|4100118|gb|U93595.1| CAGGGAAACCGCATGAAGGTCGTTGATATATAAGGGCTGCGGTGATGCTTAGAATAAGTT ************************************************************ gi|4100119|gb|U93596.1| ACCAATGCTTCATTAATCTCAGTTTTTAGATGTAATCCGATGAAATTTAAGATCGCCTTG gi|4100120|gb|U93597.1| ACCAATGCTTCATTAATCTCAGTTTTTAGATGTAATCCGATGAAATTTAAGATCGCCTTG gi|4100118|gb|U93595.1| ACCAATGCTTCATTAATCTCAGTTTTTAGATGTAATCCGATGAAATTTAAGATCGCCTTG ************************************************************ gi|4100119|gb|U93596.1| GTCACTTTTAAGCTGGAATGCCTTCTGCGGATACGCTTTCTCGTGTGATGGGTATGATTA gi|4100120|gb|U93597.1| GTCACTTTTAAGCTGGAATGCCTTCTGCGGATACGCTTTCTCGTGTGATGGGTATGATTA gi|4100118|gb|U93595.1| GTCACTTTTAAGCTGGAATGCCTTCTGCGGATACGCTTTCTCGTGTGATGGGTATGATTA ************************************************************ gi|4100119|gb|U93596.1| ATCCTGTAGCTTTGCAAAGAAGCTTCATT gi|4100120|gb|U93597.1| ATCCTGTAGCTTTGCAAAGAAGCTTCATT gi|4100118|gb|U93595.1| ATCCTGTAGCTTTGCAAAGAAGCTTCATT *****************************
Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của gen IS1358 từ 3 chủng V. cholera O139 [68]
cholerae O139 [67] (Hình 3.7) chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác đầu 5’ và đầu 3’.
Vì vậy, chúng tôi có thể sử dụng trình tự ADN mã hóa cho gen IS1358 từ 1 trong 3 chủng
Vibrio cholerae O139 strain Z17561 (U93597.1), Vibrio cholera O139 strain H1
(U93596.1), Vibrio cholerae strain CA401 (U93595.1) này để thiết kế mồi khuếch đại gen
IS1358.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gen IS1358 của Vibrio cholera O139
strain H1 được đăng ký trên Genbank mã số U93596.1 đã được phân tích kĩ [68] để thiết kế mồi. Trình tự gen này được thể hiện trong hình 3.8.
ORIGIN
1 CAGGGAAACC GCATGAAGGT CGTTGATATA TAAGGGCTGC GGTGATGCTT AGAATAAGTT 61 ACCAATGCTT CATTAATCTC AGTTTTTAGA TGTAATCCGA TGAAATTTAA GATCGCCTTG 121 TAGATCATTT CTGTTGTTTT GTAATAGCTC CTAGACAATA TAGGAGCCTA AATATGAGCG 181 AGTCAATCAA CCCATTTATG CATTTCCAAA TCATTAAAGA CTATCGACAA GAAAGCAAAG 241 TAGAACACAA ATTATCAGAC ATTATTTTGC TGACAATATG TGGTGTTTTG TCGGGTCACG 301 ATGGCTGGGA TGGCATTATC GATTTTGGTC ATGCTCGCTT AGATTTCCTT AAACGATATG 361 GTCACTTTTA AGCTGGAATG CCTTCTGCGG ATACGCTTTC TCGTGTGATG GGTATGATTA 421 ATCCTGTAGC TTTGCAAAGA AGCTTCATT
Hình 3.8. Trình tự gen IS1358 từ V. cholerae O139 được sử dụng để thiết kế mồi [68].
* Phân tích trình tự gen tcpA mã hóa toxin coregulated pilus từ V. cholera O1
El Tor
Cặp mồi để phát hiện gen tcpA và rstR đặc hiệu để phân biệt biotype V. cholera O1 El Tor và biotype V. cholera O1cổ điển (Classical) cũng được thiết kế căn cứ vào sự tương đồng về trình tự nuclêôtít của tcpA và rstR.
Từ 6 chủng V. cholera O1 El Tor đã được nghiên cứu chúng tôi so sánh trình tự nucleotit để thiết kế cặp mồi thích hợp nhằm khuếch đại đoạn gen tcpA đặc hiệu cho biotype V. cholera O1 El Tor bằng phản ứng PCR.
Bảng 3.7. Danh sách các chủng V. cholera O1 El Tor đã được sử dụng để thiết kế mồi
STT Mã số trên ngân hàng
gen (Genbank NCBI) Tên chủng
1 KC918816 Vibrio cholerae O1 strain IDH03532
2 KC918812 Vibrio cholerae O1 strain M15175
4 KC918810 Vibrio cholerae O1 strain K8833
5 KJ437651 Vibrio cholerae strain MJ-51
6 EU362122 Vibrio cholerae strain A199
Sự tương đồng về trình tự gen mã hóa của các gen tcpA của 6 chủng V. cholera O1 biotype El Tor trên được thể hiện trong hình 3.9.
gi| gb|KC918816.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |KC918812.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |KC918811.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |KC918810.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |KJ437651.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA gi| |EU362122.1| ATGCAATTATTAAAACAGCTTTTTAAGAAGAAGTTTGTAAAAGAAGAACACGATAAGAAA ************************************************************ gi| |KC918816.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACATTACTCGAAGTAATCATTGTTCTGGGTATTATGGGTGTG gi| |KC918812.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACATTACTCGAAGTAATCATTGTTCTGGGTATTATGGGTGTG gi| |KC918811.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACATTACTCGAAGTAATCATTGTTCTGGGTATTATGGGTGTG gi| |KC918810.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACATTACTCGAAGTAATCATTGTTCTGGGTATTATGGGTGTG gi| |KJ437651.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACGCTACTCGAAGTGATCATCGTTCTAGGCATTATGGGTGTG gi| |EU362122.1| ACCGGTCAAGAGGGTATGACACTACTCGAAGTGATCATCGTTCTAGGTATTATGGGTGTG ******************** ********** ***** ***** ** ************ gi| |KC918816.1| GATGCTGCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAAC gi| |KC918812.1| GATGCTGCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAAC gi| |KC918811.1| GATGCTGCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAAC gi| |KC918810.1| GATGCTGCTACTGGCGCTGGCGTAATTAAGTCCATTGCACCAGGAAGTGCCAACTTAAAC gi| |KJ437651.1| GTTGGTAATACAGGTAAAGGTGTTATTAAGTCTATAGCTACAGG---TGTTAATTTAAAC gi| |EU362122.1| GTTGGTAATACAGATAAAGGTGTTATTAAGTCTATAGCTACAGG---TGTTAATTTAAAC * ** * *** * ** ** ******** ** ** **** ** ** ****** gi| |KC918816.1| CTAACTAATATCACGCATGT--- gi| |KC918812.1| CTAACTAATATCACGCATGT--- gi| |KC918811.1| CTAACTAATATCACGCATGT--- gi| |KC918810.1| CTAACTAATATCACGCATGT--- gi| |KJ437651.1| TTAACAGACGTAACGCACGTGGA gi| |EU362122.1| TTAACAGACGTAACGCACGTGGA
**** * * ***** ****** **
Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của gen tcpA từ 6 chủng V.
cholera O1 biotype El Tor [68]
Dựa vào kết quả so sánh trình tự nucleotide từ 6 chủng V. cholera O1 biotype El
Tor ( Hình 3.9) chúng tôi nhận thấy chỉ có sự sai khác ở trình tự nucleotide 434, 441 và
448 ở đầu 3’, không có sự khác nhau ở đầu 5’. Tuy nhiên sự khác nhau này chỉ xảy ra giữa chủng Vibrio cholerae strain MJ-51 (KJ437651) và Vibrio cholerae strain A199
cholerae O1 strain M15175 (KC918812), Vibrio cholerae O1 strain L4706 (KC918811), Vibrio cholerae O1 strain K8833 (KC918810) nên có thể sử dụng trình tự ADN mã hóa cho một trong 4 chủng này để thiết kế mồi khuếch đại gen tcpA.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gen tcpA của Vibrio cholerae O1 strain
IDH03532 được đăng ký trên Genbank mã số KC918816 đã được phân tích kĩ [68] và
dịch mã trong hệ biểu hiện của V. cholerae để thiết kế mồi. Trình tự gen này được thể hiện trong hình 3.10.
ORIGIN
1 ATGCAATTAT TAAAACAGCT TTTTAAGAAG AAGTTTGTAA AAGAAGAACA CGATAAGAAA 61 ACCGGTCAAG AGGGTATGAC ACTACTCGAA GTGATCATCG TTCTAGGTAT TATGGGTGTG 121 GTTTCGGCGG GGGTTGTTAC TCTGGCGCAG CGTGCGATTG ATTCGCAGAA TATGACCAAG 181 GCCGCGCAAA ATCTAAATAC AATTCAAGTT GCAATGACTC AAACCTATCG TAGTCTAGGT 241 TCGTACCCTA CAACAGCTGA TGCAAATGCG GCCGGACGTT TGACATCTGG ATTGGTAAGT 301 TTGGGTAAGA TTTCTGCAGA CGAAGCAAAA AACCCATTTA CTGGGACTAA TATGAACATC 361 TTTGCTTTCA GCCGAAATAC AGCACCTCAG AAAGCCTTTG CTATTGCAGT TGACGGTTTG 421 ACAAAAGCAC AATGTAAATC GCTTGTTACA AGTGTCGGTG AAATGTTCCC TTACATTGTA 481 GTTAAGGAAG GTGCTGCTGT CGAAAATGCT GACCTAAAGG ACTTTGAAAC AGAAGCTCCT 541 GTTGGTAATA C
Hình 3.10. Trình tự gen tcpA từ V. cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi [68].
* Phân tích trình tự gen rstR mã hóa toxin coregulated pilus từ V. cholera O1 biotype Classical
Căn cứ vào sự tương đồng về trình tự nucleotit của gen rstR mã hóa toxin coregulated pilus từ 6 chủng V. cholera O1 biotype Classical đã được nghiên cứu để phân biệt biotype El Tor với V. cholera O1 biotype classical (Bảng 3.8), các cặp mồi thích hợp nhân đoạn gen rstR bằng phản ứng PCR đã được thiết kế.
Bảng 3.8. Danh sách các chủng V. cholera O1 đã được nghiên cứu để thiết kế mồi nhân gen rstR
STT Mã số gen appA trong ngân
hàng gen (gene bank) Tên chủng
1 EU860439 Vibrio cholerae O1 biovar Classical strain VC44 RS1
2 KB663057 Vibrio cholerae O1 str. AG-8040
3 KJ540268 Vibrio cholerae strain PM13
4 KJ437641 Vibrio cholerae strain MJ-51
5 JX312669 Vibrio cholerae strain MCM168
6 CM001786 Vibrio cholerae O1 str. Inaba G4222
Sự tương đồng về trình tự gen mã hóa của gen rstR mã hóa toxin coregulated pilus từ 8 chủng V. cholera O1 biotype Classical trên được thể hiện trong hình 3.14 và 3.15.
gi| |EU860439| GACGGAATGAAGCATAAGGAACCGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG
gi| |KB663057| GACGGAATGAAGCATAAGGAACCGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG gi| |KJ540268| GACGGAATGAAGCATAAGGAACCGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG gi| |KJ437641| GACGGAATGAAGCATAAGGAACGGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG gi| |JX312669| GACGGAATGAAGCATAAGGAACCGACCAAGCAAGATAATCGACAAAAACAAACGGAGAAG gi| |CM001786| GACGGAATGAAGCATAAGGAAGCGACCAAGCAAGATGATCGACAAAAACAAACGGAGAAG ********************* ************* ***********************
gi| | EU860439| CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA
gi| | KB663057| CGTTTGTATCGAGTTGTAAATCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA gi| | KJ540268| CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA gi| | KJ437641| CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA gi| | JX312669| CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAATCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA gi| | CM001786 CGTTTGTATCGAGTTGTAATTCATCAAGAGTGAAAACCTGCTTTTTCATTAGCCTTCAAA ******************* ****************************************
gi| | EU860439| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA
gi| | KB663057| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA gi| | KJ540268| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA gi| | KJ437641| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA gi| | JX312669| GTCAGCGATAGCGAAACAAACATTGACGAA gi| | CM001786 GTCAGCGATAGGGAAACAAACATTGACGAA **********************************
Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự nucleotide (đầu 5’ và 3’) của 6 gen mã hóa toxin coregulated pilus có nguồn gốc từ V. cholera O1 biotype Classical [68]
Dựa vào kết quả so sánh trình tự trình tự nucleotide của 6 gen mã hóa toxin coregulated pilus có nguồn gốc từ V. cholera O1 biotype El Tor (Hình 3.11) chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác trình tự nucleotit nào ở 5’ và đầu 3’, như vậy cả 6 chủng
đều có thể sử dụng trình tự ADN để thiết kế mồi khuếch đại gen rstR.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng gen rstR của Vibrio cholerae strain
MCM168 được đăng ký trên Genbank mã số JX312669 đã được phân tích kĩ [68] và dịch
mã trong hệ biểu hiện của V. cholera để thiết kế mồi. Trình tự gen này được thể hiện
trong hình 3.12.
ORIGIN
1 ATGAAGATAA AAGAAAGGCT AGCCAACCAA AGAAAGGCAA TTAATAAGAC TCAGGCACAA 61 ATGGCTGATG AAATTGGAAT TAGTCTAACA TCGTACAAAA AATACGAATC TGGGGAAGGT 121 TTGCCTACAA TGGAAAACCT TGTGAAGATC GCAGATGCTC TGGAGATCTC AATTGATGAA 181 CTATGCGGAA GATGGGCCAC AGATGAAAAT CAAGAGCTTA TGCTCAGGTT AAAAAAAATC 241 CAACAGTTAG ATGAAGAAGA GCAAAAAGCA ATAAGCATGG TTTTAGAAAG TATGCTGATA 301 AGACATTCTA CCAAGAGCAT CTTAAATCAT GGTGCTTAGT GCTGCTGAGA TGCTCAGGTT 361 TGCTCAGGTT AAATTGGAAT AGATGAAAAT CAAGAGCTTA TTTTAGAAAG AATTGATGAA 421 AGATGAAAAT GATGGGCCAC ACCTCGTACA CAAGAGCTTA TGCTCAGGTT AATTGATGAA 481 AATTGATGAA TGGAAAACCT TGTGAAGATC TCGTACAAAA AATACGAATC TGGGGAAGGT 541 TCGTACAAAA AATACGAATC TGGGGAAGGT TCGTACAAAA AATACGAATC TGGGGAAGGT 601 caacagttag cttaaatcat
Hình 3.12. Trình tự gen rstR từ V. cholerae O1 được sử dụng để thiết kế mồi [68].