3. Nội dung nghiên cứu
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp mô tả
- Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang: Nhằm đánh giá tình hình dịch tễ liên quan đến yếu tố mắc bệnh của bệnh nhân, mô tả hiện tượng sức khỏe và các yếu tố nguy cơ có liên quan đến sức khỏe đó một cách chính xác để tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm, điều tra cắt ngang sự phân bố tình trạng mắc bệnh tại thời điểm đang xảy ra dịch
[37].
- Nghiên cứu thực nghiệm labo để đánh giá tỷ lệ phát hiện V.cholerae O1 đồng
thời phân tích đánh giá hiệu quả của các phương pháp nghiên cứu để đưa ra tính ưu việt, phù hợp nhằm áp dụng thực tiễn tại cơ sở [37].
2.4.1.1. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
Tính cỡ mẫu : Áp dụng công thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu mô tả
(1 /2) 2 p(1-p) n Z d n: cỡ mẫu α = 0,05 ; độ tin cậy 95%
Z(1-α/2) : hệ số tin cậy. Với độ tin cậy là 95% thì hệ số tin cậy Z(1-α/2) = 1,96
p = 0,5 : Tỷ lệ bệnh nhân bị tiêu chảy cấp phải nằm viện (giả định). d : sai số tuyệt đối chấp nhận = 6 % = 0,06
Thay vào công thức (1) có n = 136 Cỡ mẫu thu thập được là: 162
Chọn mẫu có chủ đích là những bệnh nhân bị bệnh tiêu chảy cấp có triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh tả. Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 12.0 với các test thống kê thường dùng trong y tế, gồm: tần suất, tỷ lệ %, tỷ suất chênh OR, so sánh sự khác nhau giữa các phương pháp bằng test 2.
2.4.1.2. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm
* Kỹ thuật lấy mẫu
Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm là một bước quan trọng trong quá trình phân lập và phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm không đúng cách sẽ ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán tác nhân gây bệnh và điều trị, mẫu bệnh phẩm là phân hoặc chất nôn, thức ăn, chất chứa trong ruột non, ruột già sau khi mổ tử thi và người tiếp xúc với bệnh nhân, mẫu được thu thập càng sớm càng tốt trước khi điều trị kháng sinh.
Mẫu bệnh phẩm là phân phải được lấy càng sớm vì vi khuẩn ở trong phân rất nhiều trong những ngày đầu của bệnh và trước khi bắt đầu điều trị kháng sinh, sau khi lấy cho
vào lọ không có chất khử khuẩn hoặc chất tẩy rửa, nút lọ được đậy chặt chống rò rỉ, có thể lấy phân bằng ống thông trực tràng hoặc tăm bông vô trùng, bệnh phẩm cần được giữ nhiệt độ 4oC - 8oC và đưa ngay đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ, nếu ở ổ dịch xa phòng xét nghiệm, bệnh phẩm cần lấy bằng tăm bông vô trùng sau đó cho vào lọ có chứa môi trường vận chuyển Carry - Blair và đưa về phòng xét nghiệm sớm trong điều kiện không cần giữ lạnh.
Mẫu thực phẩm cần đảm bảo tính đại diện, thu thập mẫu tại nhiều vị trí trên thực phẩm, khối lượng mỗi mẫu khoảng 25 gam, mẫu được chuyển về phòng xét nghiệm sớm. Mẫu nước thu thập có tính đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm, chọn nhiều vị trí mẫu khác nhau, tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu thập, lấy nước vào bình thuỷ tinh vô trùng 500-1000ml, nếu lấy ở sông cần chọn nơi nước chảy giữa dòng độ sâu 20-30 cm.
Giám sát người lành mang trùng trong một vụ dịch tả, tất cả những người tiếp xúc gần gũi với bệnh nhân tả đều được coi là có thể mang mầm bệnh và vì vậy cần được theo dõi sức khỏe liên tục trong vòng 5 ngày kể từ lần tiếp xúc cuối cùng, để kịp thời phát hiện ca bệnh mới. Với những người tiếp xúc ở đầu vụ dịch cần được lấy phân xét nghiệm tìm vi khuẩn tả. Những người tiếp xúc gần và người lành mang vi khuẩn tả (phát hiện qua xét nghiệm phân) phải được điều trị dự phòng bằng kháng sinh. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh được lấy 2 lần trong giai đoạn cấp tính và giai đoạn hồi phục.
* Bảo quản bệnh phẩm
Cần được giữ vào môi trường bảo quản và vận chuyển khi ở xa phòng xét nghiệm và bệnh phẩm không được làm xét nghiệm sau 2 giờ (tính từ khi thu thập mẫu). Môi trường vận chuyển Carry-Blair là môi trường tốt nhất để bảo quản và vận chuyển, có thể dùng dung dịch đệm glyxerin, môi trường vận chuyển đã thu thập mẫu được chuyển sớm tới phòng xét nghiệm hoặc giữ ở tủ lạnh 40C (nếu chưa được xét nghiệm ngay). Trong vụ dịch tả nguy hiểm mẫu bệnh phẩm cần được lưu giữ trong hộp sắt kín để tránh lây lan trong quá trình vận chuyển.
2.4.2. Phương pháp cấy truyền và giữ giống vi sinh vật
Nuôi cấy và giữ giống V. cholerae đối chứng dương
Nuôi vi khuẩn V. cholerae trên môi trường môi trường thạch TCBS ở 37°C qua
quản ở 4°C, cấy chuyển 1 lần mỗi tháng. Để giữ giống trên 1 năm, sinh khối VSV được hòa đều trong dung dịch 15% glycerol và bảo quản trong tủ lạnh sâu -80C.
2.4.3. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen appA và phyC
Trình tự các gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR của V. choleare được thu thập
từ ngân hàng gen NCBI của Viện Thông tin Y sinh, Mỹ, để phân tích và thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR. Các trình tự nucleotide và protein của gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR trong các chủng vi khuẩn khác nhau này được so sánh với nhau bằng chương trình ClustalW2 [65]. Đoạn trình tự axit amin giống nhau nhất về phía hai đầu của các protein đã được chọn và chuyển thành trình tự các nucleotide để sử dụng làm mồi.
2.4.4. Tách chiết ADN khuôn mẫu bằng KIT QIAGEN
Tách chiết từ chủng vi khuẩn
+ Lấy 4-5 khuẩn lạc trộn đều với 200µl nước cất.
+ Đun cách thủy ở 950C trong 10 phút sau nhấc ra cho ngay vào đá.
+ Ly tâm 10.000 vòng/2 phút lấy nước nổi làm khuôn mẫu AND cho phản ứng PCR.
Tách chiết trực tiếp từ phân: Sử dụng kit QIAGEN
+ Nhỏ 300µl dịch phân tiêu chảy vào týp eppendorf 1,5ml có chứa 600µl NaCL 0.09%.
+ Ly tâm 2500 vòng x 2 phút để loại bỏ cặn. + Hút dịch nổi sang một týp eppendorf mới.
+ Ly tâm 13.000 vòng x 10 phút để loại bỏ nước nổi, thu cặn vi khuẩn. + Trộn đều cặn vi khuẩn trong 180µl dung dịch ALT.
+ Nhỏ 20µl protein K trộn đều bằng máy trộn voltex.
+ Ủ 560C trong máy ủ nhiệt cho đến khi vi khuẩn ly giải hoàn toàn (thỉnh thoảng mix nhẹ bằng máy trộn voltex).
+ Trộn đều bằng máy trộn voltex trong 15 giây, nhỏ 200µl dung dịch AL, trộn đều sau đó nhỏ 200µl cồn tuyệt đối và trộn đều.
+ Hút toàn bộ hỗn hợp nhỏ vào cột DNeasy Mini spin coumn, ly tâm 8000 vòng x 1 phút.
+ Nhỏ 500µl dung dịch rửa AW1, ly tâm 8000 vòng x 1 phút.
+ Rửa cột bằng cách nhỏ 500µl dung dịch rửa AW2, ly tâm 14000 vòng x 3 phút.
+ Chuyển cột sang týp eppendorf sạch và nhỏ 75µl dung dịch AE vào trung tâm cột, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 8000 vòng x 1 phút thu ADN tách chiết để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.
2.4.5. Phương pháp m-PCR dùng để xác định nhanh serogroup O1, O139 và hai
biotype của V. cholerae serogroup O1
2.4.5.1. Phản ứng m-PCR1
Bảng 2. 2. Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR1 đa mồi bằng Master-Mix (promega)
Thành phần phản ứng 1 mẫu (µl) 10 mẫu (µl) 2X Master-Mix: 15 150 Primers (mồi) ctxA-F ctxA-R 1µl/mồi (0.5µM) 20 O1rfb-F O1 rfb-R 1µl/mồi (0.25µl) 20 O139rfb-F O139rfb-R 1µl /mồi (0.167µM) 20 Nước siêu sạch 6 60 Tổng số: 27 270
+ Trộn đều chia mỗi tube 27µl.
Sau bước biến tính ở 94°C trong 1 phút 30 giây, kế tiếp là 30 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây) và kết thúc với pha hoàn tất ở 72°C trong 7 phút.
2.4.5.1. Phản ứng m-PCR2
Bảng 2. 3. Hỗn hợp phản ứng cho m-PCR2 đa mồi bằng Master-Mix (promega) Thành phần phản ứng 1 mẫu (µl) 10 Mẫu (µl) 2X Master-Mix 15 150 Cặp primers tcpA-F tcpA-R 1 20 rstR -F rstR –R 1 20 Nước siêu sạch 8 80 Tổng số: 27 270
+ Trộn đều chia mỗi tube 27µl.
+ Cho 3µl ADN khuôn mẫu vào các tube chứa hỗn dịch PCR.
Thực hiện phản ứng m-PCR2 trên máy luân nhiệt Các bước Nhiệt độ Thời gian Chu trình nhiệt Biến tính 940C 1 phút 30 giây 30 chu kì Biến tính 940C 30 giây Gắn mồi 470C 30 giây Tổng hợp 720C 30 giây Kết thúc 720C 7 phút Giữ ở nhiệt độ 40C
2.4.6. Điện di sản phẩm PCR
Điện di ADN là phương pháp điện di ngang trên bản gel agarose, nhằm phân tách các đoạn ADN có kích thước phân tử khác nhau. Quy trình điện di được tiến hành theo 3 bước: chuẩn bị bản gel, chạy điện di, nhuộm và soi gel.
(1) Chuẩn bị bản gel 0,8% agarose: Cân 0,8 gam agarose cho vào 100 ml dung dịch 1x TAE, đun sôi trong lò vi sóng. Khi dung dịch nguội đến khoảng 50-55C thì đổ vào khuôn đã cắm sẵn lược.
(2) Chạy điện di: Khi gel đông, tháo bản gel ra cho vào buồng điện di, tháo lược và đổ dung dịch đệm chạy 1x TAE sao cho dung dịch đệm cao hơn mặt gel khoảng 2- 5 mm. Đưa mẫu ADN chuẩn và các mẫu cần điện di lần lượt vào các giếng riêng biệt, đậy nắp và cắm điện cực. Chạy điện di trong khoảng 40 - 60 phút với điện thế 80 - 100 V. Khi vạch mầu trong mẫu đã chạy được 2/3 chiều dài gel, dừng điện di.
(3) Nhuộm và soi gel: nhuộm gel trong dung dịch 0,5 mg/l ethidium bromide trong khoảng 30 phút. Soi gel trên bàn soi gel, dưới ánh sáng đèn cực tím để kiểm tra kết quả điện di.
Kết quả điện di là các băng ADN có kích thước đúng với kích thước của gen đích (ctxA, rfbO1, O139).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính, lứa tuổi
Giới tính và lứa tuổi là một trong những đặc điểm được chúng tôi quan tâm kết hợp với yếu tố dịch tễ khi tiến hành lấy mẫu xem khả năng bị mắc bệnh tả ở giới nào hoặc độ tuổi bao nhiêu. Nên trong quá trình tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm trên bệnh nhân, chúng tôi thu thập được một số thông tin về sự phân bố theo giới tính và nhóm tuổi như sau:
Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi Giới n X ± SD Trung vị min - max
P> 0,05 Nữ 94 34,2±14,5 33(24-45) 8 - 67
Nam 68 31,8±15,5 33(17-44) 5 - 68 Tổng 162 33,3±14,9 35(21-45) 5 - 68
Bảng phân bố đối tượng nghiên cứu ( Bảng 3.1; bảng 3.2; hình 3.1) cho thấy nhóm tuổi thấp nhất đối với nữ là 8 và đối với nam là 5; độ tuổi cao nhất đối với nữ là 67 đối với nam là 68. Kết quả cho thấy sự khác biệt về tuổi giữa các bệnh nhân nam và nữ không có ý nghĩa thống kê ( P > 0,05 ).
Phân bố nhóm đối tượng theo giới tính
Nữ Nam
Hình 3.1. Biểu đồ phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính
Lứa tuổi 5-10 thu thập được 6 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 3,7 %. Lứa tuổi này có tỷ lệ nghi mắc tả thấp cũng phù hợp với các nghiên cứu khác vì sự biến động của lứa tuổi này không lớn mọi sinh hoạt phụ thuộc gia đình, nếu có thời gian chúng tôi đánh giá thêm tác nhân do virut Rota ở lứa tuổi mới sinh đến 10 tuổi thì ý nghĩa nghiên cứu sẽ mở rộng hơn.
41.98%
Nghiên cứu của M.Ehara và cộng sự (2004) cho rằng nguy cơ mắc bệnh tả của trẻ em dưới 15 tuổi thường tăng vào đầu vụ dịch [55]. Nghiên cứu của Thẩm Chí Mục (1994) cho kết quả ngược lại cho rằng nhóm tuổi này lại tăng vào cuối vụ dịch [28]. Tuy nhiên các kết quả trên cũng chỉ dừng lại đánh giá một vụ dịch nhưng cũng có thể là những gợi mở cho các nghiên cứu tiếp theo trong chương trình phòng chống các bệnh tiêu chảy ở nhóm tuổi này.
Bảng 3.2. Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi
Tuổi Số mẫu Tỷ lệ (%) 5 -10 6 3,70 11-20 13 8,02 21 -30 57 35,18 31-40 48 29,64 41-50 28 17,28 >50 10 6,18 Tổng cộng 162 100
Lứa tuổi từ 21- 30 thu thập được 57 mẫu chiếm tỷ lệ 35,18 % lứa tuổi 31- 40 thu thập được 48 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 29,64 % sau đến lứa tuổi 41 – 50 chiếm tỷ lệ 17,28 % (Bảng 3.2). Đây là những lứa tuổi lao động quan trọng trong xã hội và có tỷ lệ mắc tả cao nhất so với các lứa tuổi khác, ở lứa tuổi này có nhiều mối liên quan về yếu tố dịch tễ như đi học, đi công tác, đi làm…và điều đặc biệt sinh hoạt ăn uống ở quán cơm bình dân nên yếu tố vệ sinh không đảm bảo. Nghiên cứu Thẩm Chí Mục (1996) đã đánh giá vai trò của thực phẩm và vệ sinh của người phục vụ kết quả là 28,7 % số mẫu thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh và 20 % mẫu bàn tay nhân viên không đạt tiêu chuẩn [27]. Phan Đạo và cộng sự cho rằng trong thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ phân lập được vi khuẩn tả cao trên 50% [1]. Với nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ phân lập dương tính vi khuẩn tả là 9,88%. Qua điều tra yếu tố dịch tễ của các bệnh nhân trước khi vào viện có 11 bệnh nhân mắc bệnh tả có nguồn lây nhiễm mầm bệnh từ Hà Nội chiếm tỷ lệ 68,75 %.
Hình 3.2. Biểu đồ đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu
Nhìn chung bệnh tả không phân biệt theo giới tính, mọi người đều có thể mắc bệnh. Nghiên cứu của Vũ Minh Hương và cộng sự (1994) cho biết tỷ lệ dương tính ở nữ là 57,88 % và ở nam giới là 42,12 % [3]. Theo nghiên cứu của Dalsgaard A và cộng sự
(1997) ở Peru đã xảy ra vụ dịch tả tác nhân do V. cholerae O1 đã có 230 người mắc tiêu
chảy cấp trong đó tỷ lệ nữ mắc bệnh là 59,24 % và nam giới mắc bệnh là 40,76 % [54]. Kết quả (hình 3.1) cho thấy tỷ lệ nữ mắc tiêu chảy cấp là 58,02% và nam 41,98% cũng phù hợp với nhận xét của các tác giả trên.
Bảng 3.3. Phân bố bệnh nhân dương tính V. cholerae theo giới tính
Giới tính Mắc tả Tỷ lệ %
Nữ 7 43,75
Nam 9 56,25
Tổng 16 100
Phân bố bệnh nhân dương tính V. cholerae theo giới tính cho kết quả 9 bệnh nhân
nam mắc chiếm tỷ lệ 56,25 % trong khi đó nữ có 7 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 43,75 % (Bảng 3.3). Tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc tả, nhưng có tác giả cho rằng ở lứa tuổi trẻ và tuổi cao trên 50 tuổi có tỷ lệ mắc cao [18, 45], nghiên cứu của CDC (2004) nhận xét khi không kiểm soát yếu tố dịch tễ dịch sẽ lan rộng trong cộng đồng lúc đó lứa tuổi từ 26-50 tỷ lệ
mắc sẽ thấp hơn so với lứa tuổi từ 1-18 tuổi hoặc tuổi trên 50 [49], phải chăng sức đề kháng của trẻ em và người cao tuổi yếu nên tỷ lệ mắc bệnh cao.
Hiện nay chưa có nghiên cứu nào đưa ra một thang tuổi nhất định có tính chất mẫu về các trường hợp mắc tả. Nhận xét của chúng tôi cũng phù hợp với nhận xét nghiên cứu của Thẩm Chí Mục về đánh giá đặc điểm dịch tễ học bệnh tả qua các vụ dịch ở Hà Nam tỷ lệ nam giới chiếm tỷ lệ 54,38 % [27].
3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen mã hóa cholera toxin ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và
rstR.
3.2.1. Phân tích trình tự gen ctxA, rfbQ, IS1358, tcpA và rstR
* Phân tích trình tự gen ctxA mã hóa cholera toxin từ V. cholerae
Trong kỹ thuật PCR, mồi là một trong các yếu tố quan trọng quyết định việc khuếch đại thành công một đoạn ADN từ hỗn hợp ADN khuôn. Để có thể phát hiện gen
ctxA thành công từ bộ gen của V. cholerae bằng phản ứng PCR, chúng tôi cần phải thiết
kế được cặp mồi đặc hiệu cho gen này.