3. Nội dung nghiên cứu
3.3. Khuếch đại gen ctxA, rfb từ V Cholerae bằng phản ứng m-PCR1
Phản ứng PCR này sử dụng Phusion HF ADN polymerase (#K0191), đây là enzyme chịu nhiệt chính xác nhất hiện nay, với tỉ lệ lỗi thấp hơn 50 lần so với Taq polimeraza và 6 lần so với Pfu polimeraza. Tính năng này làm cho Phusion HF ADN polimeraza là sự lựa chọn tốt nhất cho việc nhân gen với hiệu suất cao. Theo tính toán lý
thuyết, đoạn ctxA và rfb (O1 và O139) sau khi được tổng hợp bằng kỹ thuật PCR với cặp
mồi thiết kế như trên sẽ có chiều dài khoảng 302 bp, 192bp và 449bp. Phản ứng m-PCR1
sử dụng 3 cặp mồi, cặp mồi thứ nhất được thiết kế dựa vào gen ctxA đặc trưng cho
V. cholerae, cặp mồi thứ 2 và thứ 3 được thiết kế để phân biệt hai serogroup O1 và O139
các mẫu dương tính đồng thời ít nhất 2 gen ctxA và rfbO1 được ghi nhận để tiếp tục thực hiện phản ứng m-PCR2 nhằm xác định biotype El Tor hoặc cổ điển của V. cholerae O1.
Tuy nhiên nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu với lượng lớn chúng tôi đã tiến hành các phản ứng PCR với sự thay đổi về nồng độ ADN khuôn, chu kì nhiệt, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ enzyme Phusion HF DNA polimeraza như sau:
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các thông số trong chu kỳ nhiệt đến phản ứng PCR
khuếch đại gen ctxA, rfb
Phản ứng PCR nhân gen Chu kì nhiệt Nhiệt độ gắn mồi (C) Nồng độ enzyme HF (u/µl) Nồng độ ADN khuôn (ng/ µl) Kết quả ctxA, rfb 35 47 1 u/ 50µl 1µl ADN khuôn - ctxA, rfb 35 50 1 u/ 50µl 1µl ADN khuôn - ctxA, rfb 30 50 1 u/ 50µl 5µl ADN - ctxA, rfb 30 50 1 u/ 50µl 1µl ADN - ctxA, rfb 35 52 1 u/ 50µl 1µl ADN - ctxA, rfb 30 52 1 u/ 50µl 2µl ADN - ctxA, rfb 30 52 1 u/ 50µl 3µl AND - ctxA, rfb 30 52 1 u/ 50µl 3µl ADN - ctxA, rfb 30 50 1 u/ 50µl 1µl ADN + ctxA, rfb 30 52 1 u/ 50µl 1µl ADN - ctxA, rfb 35 52 1 u/ 50µl 3µl ADN - ctxA, rfb 35 52 1 u/ 50µl 1µl AND - ctxA, rfb 30 52 2 u/ 50µl 3µl ADN +++ ctxA, rfb 30 52 1,5 u/ 50µl 3µl AND + ctxA, rfb 30 52 2 u/ 50µl 3µl AND + ctxA, rfb 20 52 2 u/ 50µl 3µl AND + ctxA, rfb 30 52 2 u/ 50µl 5µl AND ++ Ghi chú:
“ – ’’ Không có sản phẩm PCR “ + ’’ Có lượng nhỏ sản phẩm PCR
“ ++’’ Có lượng trung bình sản phẩm PCR “ +++’’ Có lượng lớn sản phẩm PCR
Sau khi điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi từ 47C lên 52C, nồng độ Phusion HF DNA polimeraza 1u/50µl lên 2u/50µl, 20 chu kì nhiệt lên 30 chu kì, 3µl ADN khuôn, sản phẩm
PCR nhân gen ctxA, rfb thu được là khá đặc hiệu (hình 3.17). Sản phẩm thu được của
phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm m-PCR1 nhân gen gen ctxA, gen rfb O1 và rfb O139
M: Thang ADN chuẩn 100bp ĐC-: Đối chứng âm
O1: Đối chứng dương mang gen ctxA (302bp) và rfbQ (192bp) O139: Đối chứng dương mang gen ctxA (302bp) và IS1358 (449bp)
1-10: các mẫu
Kết quả điện di 302 bp, 192bp, 449bp tương đương với kích thước của đoạn ctxA,
rfbO1 và rfbO139 cần khuếch đại theo tính toán lý thuyết. Các vệt mờ xung quanh là các
sản phẩm không đặc hiệu, tuy nhiên nồng độ của chúng không đáng kể để tạo thành các
băng/vạch rõ nét. Điều này chứng tỏ cặp mồi thiết kế cho các gen ctxA, rfbO1 và rfbO139
mang tính đặc hiệu cao và chương trình chạy m-PCR1 cho phản ứng này là hoàn toàn phù
M ĐC- ĐC+ ĐC+ 1 2 3 4 5 6 10 9 8 7 ĐC+ ĐC+ ĐC- M 449bp 302bp 192bp 192bp 302bp 449bp
hợp. Sản phẩm PCR này được sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
Chu trình phản ứng m – PCR1 đã được tối ưu để khuếch đại các đoạn gen ctxA,
rfbO1 và rfbO139 sử dụng cặp mồi đã được thiết kế ở mục 3.2 như sau: bước biến tính ở
94°C trong 1 phút 30 giây, kế tiếp là 30 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây) và kết thúc với pha hoàn tất ở 72°C trong 7 phút.
Thực nghiệm cho thấy các cặp gen mồi đều cho kết quả dương tính ở cả 2 chủng O1 và O139 vi khuẩn tả đã được phân lập từ các vụ dịch trước đây (đối chứng +) và các cặp gen mồi này không khuếch đại hệ gen của các vi khuẩn gặp ở đường tiêu hóa như vi
khuẩn Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp,
E. coli ATCC 11775 như kết quả ở hình trên (đối chứng – Hình 3.13).
Nhiều nghiên cứu gần đây xác định một số chủng vi khuẩn tả Vibrio cholerae O1 ở
trong môi trường tự nhiên không có độc tố, những chủng này có thể trở thành sinh độc tố khi nhiễm bởi một phage có mang đoạn gen độc tố CTX, sự biến đổi này chỉ xảy ra trong đường tiêu hóa của người hay động vật [6]. Như vậy việc khuếch đại 2 vùng gen đặc trưng của vi khuẩn tả (một vùng gen mã hóa cho kháng nguyên đặc hiệu O1, và một vùng gen cho độc tố tả) làm cho quy trình khuếch đại có thể dùng để xác định vi khuẩn tả với nguồn bệnh phẩm từ người bệnh và cả từ các nguồn nước trong môi trường.
Kết quả 16 mẫu trong 162 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu dương tính đồng thời gen
ctxA và gen rfbO1 hoặc/ và rfbO139 cho thấy khả năng hiện diện các V. cholerae mang
gen độc lực trong mẫu bệnh phẩm. Tần số xuất hiện của các serogroup mang gen độc lực
của V. cholerae trong mẫu bệnh phẩm rất thấp. Điều đó cho thấy các serogroup của V.
cholerae tồn tại trong mẫu bệnh phẩm cũng như trong môi trường chủ yếu là non-O1,
O139 [32] hoặc những dòng V. cholerae O1 và O139 không sinh độc tố CT [37]. Chúng
tôi tiến hành định biotype của 16 mẫu cho kết quả dương tính đồng thời với ít nhất 2 gen
của V. cholerae O1 bằng phản ứng m-PCR2.