2.3.2.1. Phương pháp thu thập mẫu bệnh
Chọn ruộng lúa xác ựịnh bị bệnh do nấm Fusarium, thu thập những cây có triệu chứng ựiển hình, vết bệnh mới. Mỗi ruộng cho riêng vào 1 túi nylon ghi rõ tên ruộng, ngày thu mẫu.
2.3.2.2. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm trong phòng thắ nghiệm * Phương pháp khử trùng dụng cụ
Các dụng cụ bằng thuỷ tinh như: ống nghiệm, bình tam giác, hộp petri ựược khử trùng bằng hơi nước nóng ở nhiệt ựộ 1610C trong 3h bằng tủ sấy. Dao kẹp, que cấy ựược khử trùng trên ngọn lửa ựèn cồn. Môi trường nuôi cấy ựược khử trùng trong nước nóng ở 1210C, 1,5 atm từ 35 - 45 phút trong nồi hấp.
* Phương pháp phân lập mẫu bệnh
Mẫu nấm bệnh sau khi thu thập ựược ngoài ựồng ruộng, rửa sạch bằng nước máy sau ựó rửa lại bằng nước cất.
Sau khi rửa sạch có thể thấy rõ những triệu chứng ựiển hình của vết bệnh, cắt những mẩu có vết bệnh dài khoảng 1-3 cm gồm cả phần mô bệnh và mô khoẻ.
Nhúng các mẫu có vết bệnh vào dung dịch cồn 700 ựể khử trùng bề mặt trong khoảng 30 phút. Sau ựó chuyển sang rửa lại bằng nước cất vô trùng.
Rửa xong ựể lên giấy thấm sạch và thấm khô. Cắt những mẫu nhỏ là gianh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ, cấy những mẫu này vào môi trường phân lập ựặc hiệu.
Sau 2 - 3 ngày khi tản nấm mọc và có ựường kắnh khoảng 1 - 2 cm thì tiến hành cấy truyền sang môi trường khác như PDA, PCA,CLA, CMA, WA,... Làm thuần nấm dựa vào tài liệu phân loại ựể chuẩn ựoán giám ựịnh các loại nấm gây hại.
*. Phương pháp nghiên cứu khả năng phát triển nấm Pyricularia oryzae Cav. trên các môi trường nhân tạo
* Chuẩn bị 4 loại môi trường: Cám-agar, Mận agar, bột mỳ agar., PSA - Bước 1: Chuẩn bị ựĩa Petri
đĩa Petri rửa sạch, ựể khô, sấy ở 1600C trong 3 giờ. - Bước 2: Nấu môi trường:
+ Môi trường PSA: 200 gam khoai tây ựã gọt vỏ, cắt lát mỏng + 1.000 ml nước cất ựun sôi 30 phút sau ựó dung lớp vải màn mỏng (2 lớp) lọc lấy nước khoai tây (PB = Potato Broth), thêm nước cất cho ựủ 1.000 ml ựun sôi cho vào 20 gam Sacarose, 20 gam agar vào ựun sôi cho tan.
+ Môi trường cám gạo agar: 20 gam cám gạo + 1.000 ml nước cất, ựun sôi 20 phút, lọc bằng vải màn kép, thêm nước cất cho ựủ 1.000 ml ựem ựun sôi và cho 5 gam glucose, 20 gam agar vào ựun sôi cho tan
+ Môi trường bột mỳ agar: 20 gam bột mỳ + 1.000 ml nước ựun sôi 30 phút, lọc bằng vải màn kép, thêm nước cất cho ựủ 1000 ml, ựun sôi sau ựó thêm 20 gam Sacarose và 20 gam agar ựun sôi cho tan.
+ Môi trường mận agar: đun sôi 40 gam quả mận khô với 1.000 ml nước cất trong 45 phút, lọc, ựổ thêm cho ựủ 1.000 ml., ựun sôi, cho 5 gam ựường lactose, 20 agar, ựun sôi cho tan.
- Bước 3: Hấp khử trùng:
Cho môi trường ựã chuẩn bị vào bình tam giác, bịt nút bông vô trùng, bọc nắp bằng giấy bạc, cho vào nồi hấp. Hấp ở 1210C trong 20 phút.
- Bước 4: đổ môi trường
ựều rồi ựổ ra ựĩa petri.
* Chuẩn bị nguồn nấm: Cấy nấm từ ống nghiệm (ống nguồn) vào ựĩa petri chứa môi trường cám-agar (cấy 1 ựiểm ở chắnh giữa ựĩa) sau 4 - 6 ngày dùng ựĩa ựó ựể làm nguồn cấy nấm.
* Cấy nấm lên các môi trường khác nhau: Từ nguồn nấm thuần ựã chuẩn bị làm nguồn cấy ở trên, ta dung ựột tròn có ựường kắnh 5 mm ựột nấm ở ựĩa theo ựường tròn ựồng tâm sau ựó dùng que cấy lấy từng khoanh cấy trên các môi trường ựã chuẩn bị (mỗi ựĩa cấy 1 khoanh ở chắnh giữa ựĩa petri, mỗi môi trường cấy 3 ựĩa.)
* Các chỉ tiêu theo dõi
- đo ựường kắnh của tản nấm sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày, ựo gián tiếp ở phắa ngoài ựĩa petri, không mở hộp, ựo 2 lần theo chiều vuông góc ựia qua tâm của ựĩa theo hình dấu cộng (+)
- đo ựường kắnh của tản nấm 10 ngày sau khi cấy.
- Xác ựịnh số lượng bào tử ựược hình thành: Sau khi cấy 14 ngày, rửa sạch sợi nấm trên bề mặt ựĩa petri bằng chổi lông vô trùng và nước cất. để khô sau ựó ựặt ựĩa vào trong tủ ựể 12 giờ sáng, 12 giờ tối trong 3 ngày ựể nấm sinh bào tử. Sau ựó dùng 20 ml nước cất có Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 ựể rửa và lọc lấy bào tử cho vào 1 hộp petri, lấy 1 giọt dung dịch bào tử nhỏ lên lam ựậy lamen lại ựưa lên kắnh hiển vi quan sát, ựếm bào tử của 5 quang trường X10, sau ựó tắnh số bào tử/ml. (Bào tử/ml = Bào tử/quang trường x 2.103)