- Mó di truyền là mó bộ ba (triplet code) Cỏc bộ ba cuả mARN gọi là codon (mó) và bộ ba
2. Cỏc cụng cụ và phương phỏp tạo dũng ADN tỏi tổ hợp
2.5. Tổng hợp và tạo dũng cADN
Đối với trường hợp cần cho biểu hiện một gen lạ (sản xuất một protein) mong muốn trong vi khuẩn, người ta cú thể tổng hợp gen của nú dựa trờn khuụn mẫu mARN và enzyme phiờn mó ngược tinh chế từ retrovirus. Sau đú cho xen gen này vào plasmid, rồi đem cấy vào vi khuẩn và xỏc định cỏc dũng cADN đặc hiệu. Ởđõy ta chỉ xột hai bước đầu:
Bước 1: Tổng hợp cADN (Hỡnh 8.15A)
Hỡnh 8.15A. Tổng hợp cADN từ một ARN nhờ enzyme phiờn mó ngược.
Nhưđó biết, cỏc mARN eukaryote đều cú cỏi đuụi poly(A) ở đầu 3'. Chớnh trỡnh tự này tạo
điều kiện thuận lợi cho việc tổng hợp sợi ADN bổ sung, cADN. Khi đem trộn lẫn cỏc đoạn ngắn
Tế bào + pUC19 Tế bào + pUC19 + đoạn xen Mụi trường + ampicillin + X-gal Tế bào khụng được biến nạp Cỏc khuẩn lạc trắng: pUC19 + đoạn xen Cỏc dũng khỏng ampicillin Sinh trưởng qua đờm
Cỏc dũng chọn lọc Màng Màng Phim tia X Cỏc khuẩn lạc xanh: chỉ cú pUC19 Mẩu dũ phúng xạ
gồm cỏc nucleotide thymine (oligodT) với mARN này sẽ xảy ra sự lai hoỏ giữa nú với vựng đuụi mARN. Đoạn oligo(dT) làm mồi cho enzyme phiờn mó ngược (reverse transcriptase) tổng hợp sợi cADN mà sản phẩm là sợi kộp lai ARN- cADN. Ở đầu 3' của sợi cADN được tổng hợp cú cỏi ‘chúp’ (tương tựđầu 5' của mARN). Tiếp theo, bằng cỏch xử lý với NaOH, sợi mARN bị loại ra; kế đú cỏi ‘chúp’ ởđầu 3' của cADN lại làm mồi cho ADN polymerase I tổng hợp sợi thứ hai dọc theo sợi khuụn vốn cú của nú. Sản phẩm cADN bõy giờ cũn mang cỏi ‘vũng’ sợi đơn. Sau đú, cỏi vũng này được cắt bỏ bằng cỏch xử lý với nuclease S1 để tạo ra cADN sợi kộp.
Bước 2: Xen đoạn cADN vào plasmid (Hỡnh 8.15B)
Để xen đoạn cADN vào plasmid người ta cú thể dựng enzyme end transferase để gắn thờm “đuụi” homopolymer (vớ dụ, CCCC....) vào cỏc đầu 3' của cADN. Và plasmid sau khi được mở
vũng, cũng phải lắp thờm ởđầu 3' những trỡnh tự tương ứng là GGGG... cũng với enzyme trờn. Tuy nhiờn, cỏch phổ biến hơn cả là gắn thờm vào cả hai ‘đầu bằng’ của sợi kộp cADN này bằng cỏc oligonucleotide gồm 8-10 cặp bazơ, nhờ xỳc tỏc của ADN ligase T4. Sau đú, dựng enzyme giới hạn thớch hợp để cắt “đoạn nối” này tạo ra cỏc đầu dớnh. Đồng thời cắt plasmid bởi cựng một enzyme đú tại gen TetR. Hai ADN núi trờn được nối với nhau bằng ADN ligase để tạo ra plasmid lai.
Hỡnh 8.15B. Tạo dũng cADN