2.2.1. Đối tượng
Gà IsaBrown hướng trứng mắc bệnh CRD từ 18 – 59 tuần tuổi
2.2.2.Địa điểm nghiên cứu, thời gian nghiên cứu
Cáctrại gà đẻ thương phẩm tại khu vực Chương Mỹ, Hà Nội
Số lượng trại theo dõi: 13 trại. Số mẫu quy định: 20 mẫu/ trại
Bộ môn Bệnh lý thú y Khoa thú y –Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phòng thí nghiệm C.P. Việt Nam
2.2.3.Thời gian nghiên cứu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
2.24. Bố trí thí nghiệm
Gà Isa Brown trong các trại được theo dõi về triệu chứng lâm sàng. Sau đó những gà có triệu chứng hô hấp sẽ được tách riêng và đánh dấu. Ban đầu chúng tôi sẽ lấy mẫu máu kiểm tra sự có mặt của Mycoplasma gallisepticumbằng phản
ứng ngưng kết nhanh.
Chúng tôi chọn riêng những gà có phản ứng dương tính với phản ứng ngưng kết nhanh, tiến hành theo dõi và lấy mẫu gà mắc bệnh.
2.3. Nguyên liệu nghiên cứu 2.3.1.Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu là: máu, khí quản, phổi, của gà Isa Brown mắc bệnh CRD tại trại.
2.3.2.Hóa chất
Hóa chất thông thường trong phòng thí nghiêm: nước cất, formalin 10% dùng để bảo quản mẫu, cồn nguyên chất, xylen, parafin, thuốcnhuộm Haematoxylin – Eosin (HE),…
2.3.3.Dụng cụ lấy mẫu
Các loại dụng cụ lấy mẫu thông thường như: bông cồn, bơm kim tiêm nhựa, hộp đựng mẫu,….
Các dụng cụ khác gồm: lam kính, kính hiển vi, máy cắt mẫu, găng tay, lamen, bộ cốc, lọđựng hóa chất và các dụng cụ khác.
2.3.4.Máy móc
Máy móc phục vụ cho nghiên cứu: tủ ấm 370C, máy đúc block, khuôn
đúc, máy cắt mảnh microtom, kính hiển vi quang học, máy đo chỉ tiêu huyết học
2.4.Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
Bệnh CRD là gây ra trạng thái miễn dịch mang trùng, gà mắc bệnh thường
ở thể mãn tính do đó nếu phát hiện cơ thể gà có kháng thểđặc hiệu trong máu có thể thì kết luận gà mắc bệnh. Để phát hiện sự có mặt của kháng thể trong máu gà, chúng tôi tiến hành làm phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 Nguyên lý của phản ứng: kết hợp kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, dùng kháng nguyên chuẩn để tìm kháng thể có trong huyết thanh của gà nghi mắc bệnh.
* Các bước tiến hành phản ứng:
+ Chuẩn bị
- Nguyên liệu: Huyết thanh của gà nghi mắc CRD lấy ngẫu nhiên trong
đàn giống Isa Brown, các lứa tuổi. Các phiến kính sạch vô trùng.
- Cách lấy máu: Dùng bơm tiêm lấy máu tĩnh mạch cánh (0,5-1ml), sau đó bơm từ từ lên thành ống nghiệm, để nghiêng 450 đậy nút để yên cho đông, các mẫu máu mang về phòng thí nghiệm để ở tủ lạnh 40C trong 2h, sau đó chắt lấy huyết thanh. Có thểđể nguyên trong bơm tiêm và được mang thẳng về phòng thí nghiệm trong ngày.
- Kháng nguyên chuẩn Mycoplasma gallisepticum do Intervet Hà Lan sản xuất kháng nguyên đảm bảo đúng tiêu chuẩn: không có hạt hoặc sự kết tủa nào, tuyệt đối vô trùng, không có vi trùng, nấm mốc.
- Kháng thể chuẩn do Phòng thí nghiệm công tyC.P chế tạo, đựng trong
ống epandof 1ml, kháng thểđược bảo quản ở 60C. + Tiến hành phản ứng
Trước khi làm phản ứng, kháng nguyên và kháng thể phải được đểở nhiệt
độ phòng, kháng nguyên phải lắc nhẹ cho đều.
- Phản ứng chuẩn dương: giữa kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn khi kết hợp với nhau sau 1-2 phút xuất hiện ngưng kết điển hình hạt ngưng kết màu xanh lấm tấm nổi lên trên, nước xung quanh trong.
- Phản ứng chuẩn âm: giữa kháng nguyên chuẩn với nước sinh lý không có hiện tượng ngưng kết và dung dịch vẫn giữ màu như cũ.
* Kỹ thuật xét nghiệm
Dùng xi lanh hút 1 giọt kháng nguyên, nhỏ lên phiến kính sau đó nhỏ tiếp 1 giọt huyết thanh, trộn đều thành vòng tròn, để yên theo dõi và đọc kết quả.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38
* Đọc kết quả
- Phản ứng dương tính: sau khi trộn kháng nguyên và huyết thanh 1-2 phút (hoặc hơn tùy theo hàm lượng kháng thể nhiều hay ít). Hiện tượng ngưng kết xảy ra tương tự như phản ứng chuẩn dương kết luận gà mắc bệnh.
- Phản ứng âm tính: sau khi trộn 2-5 phút không có các hạt ngưng kết, dung dịch giữ màu như cũ, kết luận gà không nhiễm bệnh.
- Trại gà được coi là dương tính : trên 50% số mẫu dương tính trên tổng số
20 mẫu của trại kiểm tra
-Trại gà được coi là nghi ngờ: có số mẫu dương tính nhỏ hơn 50% tổng số
20 mẫu của trại kiểm tra
-Trại âm tính: không có mẫu nào dương tính. (Quy định phòng thí nghiệm C.P)
2.4.2. Quan sát và khám lâm sàng gà mắc bệnh
Theo dõi tình trạng chung của đàn gà, phát hiện những biểu hiện khác thường. Đặc biệt là những triệu chứng điển hình.
Gà có kết quả ngưng kết nhanh trên phiến kính dương tính được quan sát và khám lâm sàng như:
- Tình trạng ăn, uống (nhiều hay ít hoặc bỏăn). - Dáng đứng, hoạt động của đàn gà.
- Biểu hiện trạng thái của lông, màu sắc của mào, tích. - Trạng thái, màu sắc của phân
- Trạng thái hô hấp của gà
2.4.3. Mổ khám và quan sát các tổn thương đại thể
Một số gà có phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính dương tính quá yếu và gà chết được mổ khám để kiểm tra bệnh tích.
Quan sát tổn thương đại thể sau khi mổ khám.
2.4.4. Làm tiêu bản bệnh lý vi thể
* Mẫu cơ quan nội tạng : khí quản, phổi của gà mắc bệnhđược lấy mẫu và bảo quản trong formalin 10%. Trên mỗi lọ mẫu đều có ghi các thông tin về: tuổi giống, địa điểm và ngày tháng lấy mẫu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 *Quy trình làm tiêu bản vi thểđược tóm tắt qua các bước sau:
1. Các mẫu phủ tạng cắt mỏng 0,5 cm (mẫu nhỏ để nguyên) ngâm trong dung dịch formalin 10% trong 48h (chú ý thể tích formalin gấp 10 lần thể tích mẫu và bệnh phẩm phải ngập trong formalin).
2. Miếng tổ chức cốđịnh trong formalin được lấy ra và cắt mỏng 2 - 3µm, rửa dưới nước chảy trong 2 - 3 h.
3. Chuyển sang ngâm trong cồn 700 trong 2 - 3h. 4. Ngâm sang cồn 900 trong 2 - 3h.
5. Ngâm sang cồn tuyệt đối trong 2 - 3h. 6. Ngâm sang xylen 1 để trong 2 - 3h. 7. Ngâm sang xylen 2 để trong 2 - 3h. 8. Ngâm tẩm nến 3 lần, mỗi lần 2 - 3h.
9. Đúc block: đặt miếng bệnh phẩm nằm vào chính giữa khuôn block, đổ
nhanh paraffin lỏng vào khuôn block. Để nguội cho đến khi block đông đặc. 10. Cắt và tãi mảnh
a) Cắt gọt khối block nến vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá. b) Đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt 2 - 5µm.
c) Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi chưng cất nhiệt độ nước 480C – 520C. Dùng lam kính vớt lát cắt đã phẳng. Để khô.
11. Nhuộm tiêu bản bằng Hematoxylin - Eosin a) Tẩy nến trong xylen 3 lần, mỗi lần 3 - 5 phút. b) Ngâm trong cồn tuyệt đối 3 - 5 phút.
c) Ngâm trong cồn 900 3 - 5 phút. d) Ngâm trong cồn 700 3 - 5 phút. e) Rửa dưới vòi nước chảy 3 - 5 phút.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 g) Rửa dưới vòi nước chảy 3 - 5 phút. Kiểm tra màu sắc nếu thấy xanh tím là được.Nếu nhạt màu, nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).Nếu thấy đậm màu, nhúng tiêu bản qua cồn axit (cồn 960 + HCl 1%) trong 30 giây.
h) Ngâm trong thuốc nhuộm Eosin 60 – 90 giây.
i) Rửa dưới vòi nước chảy 3 - 5 phút (chú ý màu của eosin).
k) Để khô trong nhiệt độ phòng hoặc ngâm trong cồn 900 và cồn tuyệt đối (mỗi lọ 1 phút), chuyển sang xylen 2 lần (mỗi lần 2-3 phút).
m) Gắn lamen bằng Baume canada: Nhỏ 1 giọt baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lamen lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹđể dồn hết bọt khí ra ngoài.
12. Soi kiểm tra dưới kính hiển vi.
2.4.5. Xác định sự biến đổi các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu: máy đo các chỉ tiêu huyết học chỉ tiêu huyết học
Tên máy: Cell – dyn 3700
Các chỉ tiêu sinh lý máu cần xác định:
- Số lượng bạch cầu tổng số, số lượng bạch cầu trung tính, số lượng bạch cầu lympho, số lượng bạch cầu đơn nhân. % bạch cầu trung tính, % bạch cầu lympho, % bạch cầu đơn nhân.
- Số lượng hồng cầu, thể tích khối hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, nồng độ Hb trung bình của hồng cầu, độ phân bố hồng cầu.
- Số lượng tiểu cầu, thể tích trung bình tiểu cầu, thể tích khối tiểu cầu, Độ phân bố tiểu cầu.
Các chỉ tiêu sinh hóa máu: protein máu, albumin, các loại globulin và tỷ lệ A/G
2.4.6. Xử lý số liệu
Số liệu thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học theo chương trình Excel 2007 và Minitab 17
- Số trung bình: n X X n 1 i i ∑ = =
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 X: Số trung bình n: Dung lượng mẫu - Độ lệch chuẩn: Với n < 30 - Sai số trung bình: mx = ± Với n < 3 ( ) 1 n X Xi 2 − − Σ = δ 1 n S −
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tỷ lệ mắc bệnh CRD do Mycoplasma gallisepticum của các trại gà Isa Brownhướng trứng
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh CRD doMycoplasma gallisepticumgây ra
Thông thường, gà mắc CRD doMycoplasma gallisepticum gây ra theo con
đường từ gà bố mẹ truyền sang và từ những gà ốm đã mắc bệnh trong chuồng nuôi gây ra. Đối với gà bố mẹ được kiểm soát riêng bằng chương trình vaccine và an toàn sinh học để hạn chế tối đa sự có mặt của Mycoplasma gallisepticumtrong trứng ấp. Mặt khác với gà con giai đoạn 1 và 8 tuần tuổi có sử
dụng thuốc phòng và điều trị Mycoplasma gallisepticum. Do vậy, nếutheo dõi vấn đề nhiều Mycoplasma gallisepticum ở trang trại gà đẻ trứng là theo con
đường truyền ngang. Bệnh CRD do Mycoplasma gallisepticum gây ra được coi là bệnh chỉ thị về chăm sóc quản lý chất lượng gà kém, vệ sinh chuồng nuôi hay vấn đề thông thoáng kém.
Theo tổ chức sức khỏe động vật thế giới năm 2008, phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính(RSA: rapid slide agglutination test) là một phương phápđược áp dụng rộng rãi nhằm xác định tỷ lệ nhiễm Mycoplasma galliseticum (MG) gây ra ở đàn gà. Đây là phản ứng được sử dụng nhiều nhất trong các phương pháp chẩn đoán CRD (OIE, (2011)). Phản ứng có thể tiến hành ở nhiệt
độ phòng trong vòng 72h kể từ khi lấy mẫu. Phản ứng được sử dụng để phát hiện kháng thể chống Mycoplasma gallisepticumtrong huyết thanh gà.
Theo dõi triệu chứng lâm sàng và tiến hành lấy máu kiểm tra phản ứng huyết thanh học định kì theo tháng bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính các trại gà để xác định tỷ lệ nhiễm Mycoplasma gallisepticum. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43
Kết quả âm tính(-) Kết quả dương tính(+)
Hình 3.1.Phản ứng ngưng kết nhanh
Bảng 3.1.Tỷ lệ nhiễm Mycopalsma gallisepticumở gà Isa Brown hướng trứng thuộc huyện Chương Mỹ, Hà Nội
Thời gian Số mẫu kiểm tra Số mẫtính u dương Tỷ lệ (%)
7-12/2013 1484 498 33,56
1-6/2014 1542 469 30,41
Tổng 3026 967 31,96
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy tỷ lệ nhiễm Mycoplasma gallisepticum ở gà Isa Brown hương trứng đối với 2 đợt theo dõi là 31,96%.
Theo tác giả Shukla và cs, 1985 khi dùng phản ứng ngưng kết đánh giá tỷ
lệ nhiễm Mycoplasma gallisepticumở Nhật Bản là 42,5%. Theo tác giả Đào Trọng Đạt (1974-1975) tỷ lệ nhiễm Mycoplasama gallisepticum qua phản ứng ngưng kết nhanh trong 3 trại thí nghiệm lần lượt là 57%; 52%; 51,41%. Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1984 – 1985) tỷ lệ dương tính là 20- 60%.
So sánh với các tác giả trước đây, kết quả trong nghiên cứu này của chúng tôi thấp hơn. Điều này được giải thích vì hiện nay mô hình chăn nuôi công nghiệp tại huyện Chương mỹ đã có sự đầu tư về chuồng trại nên đạt lượng chất
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 lượng tiểu khí hậu chuồng nuôi tốt hơn so với trước đây (chăn nuôi nhỏ lẻ, chuồng hở). Đồng thời với kinh nghiệm chăn nuôi lâu năm, người chăn nuôi đã chú ý vệ sinh chuồng nuôi.
Tại Bangladesh, Talha và cs. (2003) cho biết tỷ lệ nhiễm Mycoplasma gallisepticumở các giống gà giao động từ 22,0% - 77,0%.
Đối với những mẫu dương tính,huyết thanh đượcpha loãng theo cơ số 2 để định lượng hàm lượng kháng thể và đánh giá chung trại gà bị mắc bệnh hay chỉở
mức nghi ngờ cần theo dõi hay là mức độ âm tính. Đối với các trại không có mẫu dương tính được coi là trại âm tính, trại có ít hơn 50% số mẫu dương tính trước khi pha loãng được coi là trại nghi ngờ và trại có trên 50% mẫu huyết thanh dương tính được coi là trại mắc bệnh. (Quy định phòng thí nghiệm C.P)
Bảng 3.2.Tỷ lệtrại dương tính vớiMycoplasma gallisepticumqua các tháng
Thời gian
Số trại âm tính Số trại nghi ngờ Số trại dương tính
Trại % Trại % Trại % 7/2013 13 100 0 0 0 0 8/2013 11 84,62 2 15,38 0 0 9/2013 9 69,23 3 23,08 1 7,69 10/2013 2 15,38 10 76,93 1 7,69 11/2013 0 0 5 38,46 8 61,54 12/2013 0 0 1 7,69 12 92,31 1/2014 3 23,08 2 15,38 8 61,54 2/2014 3 23,08 1 7,69 9 69,23 3/2014 0 0 5 38,46 8 61,54 4/2014 8 61,54 2 15,38 3 23,08 5/2014 8 61,54 3 23,08 2 15,38 6/2014 9 69,23 4 30,77 0 0
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45
Hình 3.2.Tỷ lệ các trại gà có kết quả dương tính (%) với Mycoplasma gallisepticumkhi kiểm tra bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
Kết quả ở bảng 3.2 vàhình3.2cho thấy, tỷ lệ các trại dương tính với
Mycoplasma gallisepticum thường vào tháng 11,12 và tháng 1,2,3. Mùa đông, ở
miền bắc nước ta, nhiệt độ ngoài trời nhiều khi xuống dưới 100C điều này cũng
ảnh huởng đến tiểu khí hậu trong chuồng gà. Khi tiến hành kiểm tra các trại gà đẻ
với kiểu chuồng bán kín thấy nhiệt độ có trại xuống tới 14-150C. Với mức nhiệt
độ trên gà sẽ dễ dàng bị stress nhiệt và dễ mắc bệnh. Vào mùa xuân ở miền bắc, khí hậu có độ ẩm cao, nhiệt độ thấp thích hợp cho Mycoplasma gallisepticum
phát triển. Do đó, bệnh CRD đã xảy ra nhiều.
3.1.2. Tỷlệ gà Isa Brown hướng trứng mắc CRD do Mycoplasma gallisepticumtheo lứa tuổi lứa tuổi
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã dùng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính theo định kì hàng tháng và ghi chép về lứa tuổi gà mắc bệnh. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.3. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 % trại dương tính Tháng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46
Bảng 3.3. Tỷ lệ mắc bệnh CRD do Mycoplasma gallisepticumtrên gà Isa Brown hướng trứng theo lứa tuổi
Lứa tuổi (tuần) Số gà theo dõi (con) Số gà mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc (%) Số gà chết (con) Tỷ lệ tử vong (%) 18 – 22 804 350 43,53a 283 80,86a 23- 40 798 314 39,34b 288 91,72b 41 - 50 736 201 27,30c 97 48,25c >50 688 102 14,83d 41 40,20d Tổng hợp 3026 967 31,95 709 73,32
(Các chữ cái a,b,c,d trong cùng cột biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa với P < 0,05) Kết quảở bảng 3.3 cho thấy ở lứa tuổi gà hậu bị lên đẻ (18- 22 tuần tuổi) tỷ lệ mắc là 43,53%. Trong đó, tỷ lệ tử vong là 80,86%. Ở lứa tuổi gà đẻ đỉnh (23- 40 tuần tuổi) tỷ lệ mắc là 39,34%. Trong đó, tỷ lệ tử vong là 91,72%.