Qua kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cho thấy phân đoạn ethyl acetat có tác dụng mạnh nhất. Vì vậy, để nghiên cứu kỹ hơn về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt Vải, chúng tôi tiến hành phân lập chất phân đoạn này. Kết quả thu đƣợc 2 chất MS1 và MS2.
Trong đó đã xác định đƣợc cấu trúc MS1 là Acid 3,4 dihydroxy benzoic Acid 3,4 dihydroxy benzoic hay Acid protocatechuic (PCA) là một axit phenolic phân bố rộng rãi trong thực vật. Acid protocatechuic đƣợc coi là một thành phần có tác dụng của một số loại thuốc thảo dƣợc truyền thống ở Trung Quốc nhƣ Cibotium barometz (L.) J.Sm, Stenoloma chusanum (L.) Ching, Ilex Sims chinensis.
Acid protocatechuic ( acid 3, 4 dihydroxybenzoic; PCA) là một acid phenolic đơn giản, đƣợc dùng làm tiền chất để tổng hợp các phân tử phức tạp hơn, chẳng hạn nhƣ cyanidin 3 -O- β -D- glucosid và vanillin. Hợp chất này đƣợc tìm thấy trong các loại rau, trái cây, các loại hạt và quả, trong đồ uống có nguồn gốc thực vật nhƣ trà và rƣợu nho trắng… Nghiên cứu trên động vật
71
gần đây đã cho thấy PCA có hiệu quả trong ức chế các hoạt động gây ung thƣ của diethylnitrosamine trong gan, Azoxymethane trong ruột kết, amin N- nitrosobis ( 2 - oxopropyl ) trong tuyến tụy và N-methyl- N- nitrosourea trong mô dạ dày. Trong các nghiên cứu in vitro, PCA có khả năng bắt giữ tế bào, tiêu diệt tế bào thông qua nhiều con đƣờng làm kích hoạt protein kinase ( MAPK) sau đó kích hoạt ty thể qua trung gian caspase trong ung thƣ dạ dày ngƣời và các tế bào khối u khác của cơ quan tiêu hóa.
Ngoài ra, PCA đƣợc nhiều công trình nghiên cứu báo cáo là có rất nhiều tác dụng dƣợc lý khác, có thể liên quan chặt chẽ với khả năng chống oxy hóa. Chất này đã đƣợc báo cáo có tác dụng bảo vệ chống lại nhiễm độc gan do các tác nhân hóa học gây ra trong cơ thể.
Chất MS2 đã đƣợc xác định là hỗn hợp của 2 đồng phân procyanidin A1 và procyanidin A2.
Procyanidin là một flavonoid có mặt phổ biến trong các loại trái cây, hạt, lá, hoa và vỏ của nhiều loài thực vật. Hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học và tác dụng dƣợc lý liên quan đến khả năng loại bỏ các gốc tự do, chẳng hạn nhƣ kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm, chức năng chống dị ứng và giãn mạch , cũng nhƣ ức chế sự peroxy hóa lipid, chống kết tập tiểu cầu và làm tăng tính thấm mao mạch, điều chỉnh hoạt động của hệ thống enzym, bao gồm cyclo- oxygenase và lipo-oxygenase.
Cả 2 hợp chất này đã đƣợc nhiều nghiên cứu trên thế giới báo cáo phân lập từ hạt Vải và nhiều loài thực vật khác. Tuy nhiên, đây là báo cáo đầu tiên, phân lập 2 chất này trong hạt Vải Việt Nam.
Cả hai chất xác định đƣợc thuộc nhóm các hợp chất polyphenol. Với cấu trúc có nhiều nhóm phenol, chúng có khả năng ngăn chặn chuỗi phản ứng dây chuyền gây ra bởi các gốc tự do bằng cách phản ứng trực tiếp với gốc tự do
72
thành một gốc tự do mới bền hơn. Do đó, các hợp chất này có hoạt tính chống oxy hóa đã đƣợc công bố trong nhiều nghiên cứu [54], [58].
Kết quả phân lập đƣợc 2 hợp chất đã góp phần chứng minh cho tác dụng chống oxy hóa của cao phân đoạn ethyl acetat và trong cao hạt Vải toàn phần. Khối lƣợng các chất tách đƣợc trong hạt Vải rất cao. Chứng tỏ, có thể thấy rằng hạt Vải là dƣợc liệu có tiềm năng chống oxy hóa.
73
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau thời gian thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của hạt Vải (Semen Litchi chinensis )’’bƣớc đầu chúng tôi thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau:
* Về thành phần hóa học
- Hạt Vải có một số nhóm hợp chất: flavonoid, coumarin, anthranoid, saponin, tanin, acid amin, đƣờng khử, polysaccharid, chất béo, sterol, caroten, acid hữu cơ.
- Cắn phân đoạn nƣớc (cắn N) có hàm lƣợng 1,50%, cắn phân đoạn N- hexan có hàm lƣợng 0,70%, cắn phân đoạn n- butano có hàm lƣợng 0,63%, cắn phân đoạn ethyl acetat có hàm lƣợng 0,27%.
- Cắn phân đoạn n-hexan có: Sterol, caroten, chất béo.
- Cắn phân đoạn ethyl acetat có: Flavonoid, anthranoid, saponin, tanin, acid hữu cơ.
- Cắn phân đoạn n- butanol có: Flavonid, saponin.
- Cắn phân đoạn nƣớc có: Flavonoid, acid amin, đƣờng khử, polysaccarid, tanin, coumarin, acid hữu cơ.
- Phân đoạn n-hexan cho các vết sắc ký tách rõ nhất với hệ dung môi chloroform: methanol (6:1). Sau khi hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 10% quan sát ở ánh sáng thƣờng thấy 8 vết xuất hiện với Rf lần lƣợt là 0,195; 0,275; 0,468; 0,574; 0,611; 0,709; 0,763; 0,869.
- Phân đoạn ethyl acetat cho các vết sắc ký tách rõ nhất với hệ dung môi chloroform: methanol (6:1). Sau khi hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 10% quan sát ở ánh sáng thƣờng thấy 6 vết xuất hiện rõ với Rf lần lƣợt là 0,128; 0,165; 0,474; 0,600; 0,747; 0,809.
- Phân đoạn n- butanol cho các vết sắc ký tách rõ nhất với hệ dung môi chloroform: methanol (4:1). Sau khi hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 10%
74
quan sát ở ánh sáng thƣờng thấy 3 vết xuất hiện rõ với Rf lần lƣợt là 0,153; 0,245; 0,415.
* Về tác dụng sinh học
- Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy: 4 mẫu cao chiết có tác dụng chống oxy trên in vitro với thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH với IC50 là: cao
ethanol 50% (36,994μg/ml); cao ethanol 80% (50,824μg/ml) ; cao phân đoạn n- butanol (47,4μg/ml); cao phân đoạn ethyl acetat (26,874μg/ml).
- Tác dụng bảo vệ gan: Cao chiết ethanol 50% hạt Vải với liều 10g dƣợc liệu /kg thể trọng chuột nhắt có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 7%/olive với liều tƣơng đƣơng 100mg/kg thể trọng ở chuột nhắt trắng, thông qua việc làm giảm rõ rệt hoạt độ enzyme AST, ALT, và nồng độ bilirubin trong máu.
* Phân lập chất tinh khiết
Đã phân lập đƣợc 2 chất có độ tinh khiết cao bằng phƣơng pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thƣờng.
Xác định công thức cấu tạo của chất MS1 (238mg) là Acid 3,4 dihydroxy benzoic, chất MS2 (534mg) là hỗn hợp của 2 đồng phân procyanidin A1 và procyanidin A2.
Kiến nghị
1. Tiếp tục phân lập hoạt chất trong dƣợc liệu hạt Vải.
2. Tiếp tục nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan trên nhiều mô hình khác nhau để làm cơ sở cho việc đƣa dƣợc liệu hạt Vải sử dụng trong y học.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta, Angiosperamae) ở Việt Nam, NXB nông nghiệp, tr. 42-43. 2. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, tr. 281-282. 3. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học.
4. Bộ môn dƣợc liệu - Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội (2010), Thực tập dược liệu phần kiểm nghiệm bằng phương pháp hiển vi và hóa học, Trung tâm thông tin, Thƣ viện trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội.
5. Bộ môn dƣợc liệu - Trƣờng đại học Y Dƣợc Thành Phố Hồ Chí Minh (2012), Phương pháp nghiên cứu dược liệu.
6. Bộ y tế (2004), Bài giảng dược liệu, Tập 1, NXB Trung tâm thông tin thƣ viện, Đại học Dƣợc Hà Nội.
7. Bộ y tế (2007), Dược liệu học, Tập 2, NXB Y học.
8. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập, NXB Y học, Pl 1309-1310.
9. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học.
10. Trần Thanh Hà, Ngô Thị Mai Anh, Trịnh Thị Điệp, Đỗ Thị Phƣơng, Phạm Nguyệt Hằng, Phí Thị Xuyến, Nguyễn Thị Phƣợng (2012), "Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết và hoạt tính độc tế bào của hạt và vỏ quả vải", Tạp chí dược liệu, 17(4), pp. 239-243.
11. Phạm Hoàng Hộ (2002), Cây cỏ Việt Nam, Tập 2, NXB Trẻ, tr. 310-328. 12. Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử Dƣơng (2001), Xét nghiệm sử dụng trong
lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, tr. 650-691.
14. Phan Hải Nam (2004), Một số xét nghiệm hoá sinh trong lâm sàng, Học viện Quân Y, tr. 22-36.
15. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 13-17.
16. Viện dƣợc liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB khoa học và kỹ thuật, tr. 1045-1047.
17. Viện dƣợc liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 289-290.
18. Vũ Đình Vinh (2001), Hướng dẫn sử dụng các xét nghiệm sinh hoá, Nhà xuất bản Y học, tr. 251-253.
Tiếng Anh
19. Balahoroglu R, Dulger H, Ozbek H. (2008), "Protective effects of antioxidants on the experimental liver and kidney toxicity in mice", European Journal of General Medicine, 5 (3), pp. 157-164.
20. Besra SE, Sharma RM, Gomes A (1996), "Antiinflammatory effect of petroleum ether extract of leaves of Litchi chinensis Gaertn. (Sapindaceae)",Journal of Ethnopharmacol, 54(1), pp. 1-6.
21. Bhoopat L, Srichairatanakool S, Kanjanapothi D, Taesotikul T, Thananchai H, Bhoopat T (2011), "Hepatoprotective effects of lychee (Litchi chinensis Sonn..): a combination of antioxidant and anti-apoptotic activities",Journal of Ethnopharmacol, 136(1), pp. 55-66.
22. C.P. Khare (2008), Indian Medicinal Plants: An Illustrated Dictionary, Springer, pp. 379.
23. Cai XQ, Chen W, Lin N, Lin T, Hu FP (2011), "Colonization and disease control and fruit preservation functions of endophytic bacterial strains in lychee",Ying Yong Sheng Tai Xue Bao, 22(8), pp. 2140-6.
24. Christophe Wiart (2006), Ethnopharmacology of Medicinal Plants: Asia and the Pacific, CRC Press, pp. 124.
25. Christopher M. Menzel, Geoff K. Waite (2004), "Litchi and Longan, Botany, Production and Uses, pp. 1- 30.
26. Chinese Pharmacopeia Commission (2010), "Pharmacopoeia of the people's republic of China", I, pp. 255-256.
27. D. Y. Hong & Wu, Z.Y., P.H.Raven, eds (2007), Flora of China (Hippocastanaceae through Theaceae), 12, pp. 1-20.
28. D.O.Gray, L.Fowden (1962), "α- (Methylencyclopropyl)glycine from Litchi seeds",Biochemistry Journal, 82, pp. 385-389.
29. Debasis Bagchi, Manashi Bagchi, Sidney J. Stohs, Dipak K. Das, Sidhartha D. Ray, Charles A. Kuszynski, Shantaram S. Joshi, Harry G. Pruess (2000), "Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention",Toxicology, 148, pp. 187-197.
30. Dhan Prakash, Garima Upadhyay, P Pushpangadan (2011), "Antioxidant Potential of Some Under-Utilized Fruits", Indo-Global Journal of Pharmaceutical Sciences, 1(1), pp. 25-32.
31. Douglas Darr and Irwin Fridovich (1994), "Free Radicals in Cutaneous Biology", Investigative Dermatology, 102(5), pp. 671-675.
32. F. Shahidi, M. Naczk (2004), "Phenolics in food and nutraceuticals", Press, Boca Raton, pp. 403.
33. Fanli Kong, Mingwei Zhang, Sentai Liao, Shujuan Yu, Jianwei Chi, Zhencheng Wei (2010), "Antioxidant activity of polysaccharide-enriched fractions extracted from pulp tissue of Litchi chinensis Sonn..", Molecules, 15(4), pp. 2152-2165.
34. Felix M. Ching (2007), Chinese Herbal Drug Research Trends, Tập, Nova Science Publishers.
35. Freeman BA, Crapo JD (1982), "Biology of disease: free radical and tissue injury",Lab Invest, 47(5), pp. 412-426.
36. Gontier E, Boussouel N, Terrasse C, Jannoyer M, Ménard M, Thomasset B, Bourgaud F (2000), "Litchi chinensis fatty acid diversity: occurrence of the unusual cyclopropanoic fatty acids",Biochem Soc Trans, 28(6), pp. 578-80. 37. Guo J, Li L, Pan J, Qiu G, Li A, Huang G, Xu L (2004), "Pharmacological
mechanism of Semen Litchi on antagonizing insulin resistance in rats with type 2 diabetes",Zhong Yao Cai, 27(6), pp. 435-8.
38. Hesham A.El-Beshbishy, Ph.D, Ahmed M.Mohanmadin, Ph.D.Ashraf B. Abdel-Naim Ph.D (2009), "In vitro Evaluation of the Antioxidant Activities of Grape seed (Vitis vinifera) extract, Black seed (Nigella sativa) extract and Curcumin",Medical sciences, 4(1), pp. 23-25.
39. Hsu CP, Lin CC, Huang CC, Lin YH, Chou JC, Tsia YT, Su JR, Chung YC (2012), "Induction of apoptosis and cell cycle arrest in human colorectal carcinoma by Litchi seed extract",J Biomed Biotechnol, pp. 341-479.
40. Hu XQ, Huang YY, Dong QF, Song LY, Yuan F, Yu RM (2011), "Structure characterization and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from pulp tissues of Litchi chinensis", Journal of Agric Food Chem, 59(21), pp. 11548-52.
41. Huang KW, Guo JW, Chen JM, Lin LJ, Xu F (2012), "Study on the chemical constituents in ethyl acetante extraction from semen litchi", Zhong Yao Cai, 35(1), pp. 64-6.
42. Jian Sun, Yueming Jiang, Xiaoyi Wei, Mouming, John Shi, Yanli You, Chun Yi (2007), "Identication of procyanidin A2 as polyphenol oxidase substrate in pericarp tissues of litchi fruit", Journal of Food Biochemistry, 31, pp. 300-313.
43. Jie-wen Guo, Jian-mei Chen, Li-jing Lin, Feng Xu (2012), "Five chemical constituents of the etyl acetate fraction from ethanol extract of semen lichi", Medical Plants Research, 6(1), pp. 168-170.
44. Jorge, De’bora Maria Moreo Luzia and Neuza (2011), "Evaluating of the activity antioxidant and fatty acids profile of Lychee seeds (Litchi chinensis
Sonn..)",Nutrition & Food Science, 41, no 4, pp. 261-267.
45. K. Nagendra Prasad, Bao Yang, Shaoyu Yang, Yulong Chen, Mouming Zhao, Muhammad Ashraf, Yueming Jiang (2009), "Identification of phenolic compounds and a praisal of antioxidant and antityrosinase activities of from Litchi (Litchi sinensis Sonn.) seeds", Food Chemistry, 116, pp. 1-7. 46. Kalgaonkar S, Nishioka H, Gross HB, Fujii H, Keen CL, Hackman RM.
(2010), "Bioactivity of a flavanol-rich lychee fruit extract in adipocytes and its effects on oxidant defense and indices of metabolic syndrome in animal models",Phytother Res, 24(8), pp. 1223-8.
47. Kathleen A.D. (1998), Toxicologic emergencies, Jeanmn M. Roche, pp. 197-209, 213-225.
48. Kaushik N, Kaur BP, Rao PS (2013), "Application of high pressure processing for shelf life extension of litchi fruits (Litchi chinensis cv. Bombai) during refrigerated storage",Food Sci Technol Int. .
49. Kohei Kamiya, Chiharu Watanabe, Hanani Endang, Mansur Umar, Toshiko Satake (2001), "Studies on the Constituents of Bark of Parameria laevigata Moldenke",Chem. Pharm. Bull., 49(5), pp. 551-557.
50. Li J, Jiang Y (2007), "Litchi flavonoids: isolation, identification and biological activity", Molecules, 12(4), pp. 745-58.
51. Lijun Wang, Guodong Lou, Zhongjum Ma, Xueming Liu, (2011), "Chemical consitituents with antioxidant activities from litchi (Litchi chinensis Sonn.) seeds",Food Chemistry, 126, pp. 1081-1087.
52. M.T. Mitjavila, J.J. Moreno (2012), "The effects of polyphenols on oxidative stress and the arachidonic acid cascade, implications for the prevention/treatment of high prevalence diseases", Biochemical Pharmacology, 84, pp. 1113-1122.
53. Malik I, Ahmad VU, Anjum S, Basha FZ., (2010), "A pentacyclic triterpene from Litchi chinensis",Nat Prod Commun, 5(4), pp. 529-30. 54. Miller AL (1992), "Antioxidant flavonoids: structure, function and
clinical usage",Alt. Med. Rev, 1, pp. 103-111.
55. Nagoev B.S., Abidw M.T., Ivanova M.R (2002), "LPO and freeradical oxidation parameters in patiens with acute viral hepatitis", Bull Exp. Bio med, 134 (6), pp. 557- 558
56. Orwa et al. (2009), "Litchi chinensis", Agroforestry Database, 4, pp. 1-5. 57. Philip Molyneux (2004), "The use of the stable free radical
diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimating antioxidantactivity", Songklanakarin Journal of Science Technology, 26 (2), pp. 211-219.
58. Shahidi F, Wanasundara PD (1992), "Phenolic antioxidants", Cri. Rev. Food. Sci. Nutr, 32, pp. 67-103.
59. Shen J (1988), "Identification of essential oil from semen litchi", Zhong Yao Tong Bao, 13(8), pp. 31-2, 63.
60. Shen Ren, Duoduo Xu, Zhi Pan, Yang Gao, Zehenguo Jiang, Qipin Gao (2011), "Two flavanone compounds from Litchi (Litchi chinensis Sonn.) seeds, one previously unreported and appraisal of their a- glucosidase inhibitory activities",Food Chemistry, 127, pp. 1760- 1767.
61. Soon-Ok Oh, Jung A Kim, Hae-Sook Jeon, Jong Cheol Park, Young Jin Koh, Hyun Hur, Jae-Seoun Hur (2008), "Antifungal activity of eucalyptus- derived phenolics against postharvest pathogens of kiwifruits", Plant Pathol. Journal, 24(3), pp. 322-327.
62. Turner R.A (1965), "Screening methods in pharmacology", Test for hematocity, 1, pp. 299-300.
63. Wasowich W, Neve J, Peretz A. (1993), "Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage",Clin Chem, 39, pp. 2522-2526.
64. William A. Pryor (1982), "Free radical biology: xenobiotics, cancer, and aging",Annals of the New York Academy of Sciences, 393, pp. 1-22.
65. Xinya Xu, Haichui Xei, Jing Hao, Yueming Jiang, Xiaoyi Wie, (2010), "Eudesmane sesquiterpene glucosides from Lychee seed and their cytoxic activity",Food Chemistry, 213, pp. 1123- 1126.
66. Xinya Xu, Haichui Xie, Jing Hao, Yueming Jiang, Xiaoyi Wei (2011), "Flavonoid Glycosides from the seeds of Litchi chinensis", Food