2.3.4.1. Phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa in vitro
- Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH
Phƣơng pháp đƣợc thực hiện theo Blois et al (1958) [57].
* Nguyên tắc của phương pháp
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của hầu hết dƣợc
22
liệu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, đƣợc xác định bằng cách đo quang ở bƣớc sóng λ= 517nm [17].
* Cơ chế dọn gốc tự do DPPH
Là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển gốc tự do sang trạng thái ổn định. Nhƣ vậy khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ khử gốc tự do DPPH làm cho dung dịch giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm [57]. Z• + AH = ZH + A• NO2 NO2 O2N N N . 1: Diphenylpicrylhydrazyl (gốc tự do) NO2 NO2 O2N HN N 2: Diphenylpicrylhydrazine Tiến hành
Thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ sau:
+ Mẫu nghiên cứu gồm: Cao ethanol 50% của hạt Vải, Cao ethanol 80% của hạt Vải, cao chiết hạt Vải các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat, n- butanol. Quy trình chiết xuất đƣợc trình bày theo mục 3.2.1.
+ Pha dung dịch DPPH: Lấy 2mg DPPH pha trong 16,9 ml methanol đƣợc dung dịch 1. Từ dung dịch 1 pha loãng gấp đôi đƣợc dung dịch có nồng độ 150μM.
+ Quercetin (chất đối chiếu). + Hỗn hợp phản ứng gồm:
90 μl DPPH 150 μM (pha trong methanol) 10 μl Mẫu thí nghiệm (pha trong methanol)
23 Bảng 2.3. Hỗn hợp phản ứng Ống Mẫu thí nghiệm (μl) Methanol (μl) DPPH (μl) Trắng - 100 - Chứng - 10 90 Thử 10 - 90
+ Để hỗn hợp phản ứng trong bóng tối 30 phút ở 30oC. Sau đó đo giá trị mật độ quang (OD) bằng máy đọc ELISA của hãng Labsystems tại bƣớc sóng 517 nm.
Tất cả các mẫu đƣợc thực hiện 3 lần.
Tính kết quả
Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH tính theo công thức.
HTDG (%) = [(OD mẫu chứng - OD mẫu thử)/OD mẫu chứng]×100
Để xác định giá trị IC50, là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế đƣợc 50% giải phóng các gốc tự do, mỗi mẫu thử có tác dụng đƣợc pha thành 5 thang nồng độ. Giá trị IC50 của các mẫu đƣợc tính bởi phƣơng pháp hồi qui tuyến tính của đồ thị biểu diễn phần trăm loại gốc tự do DPPH tƣơng ứng với mỗi nồng độ của mẫu thử.
Bảng 2.4. Nồng độ mẫu thí nghiệm
Mẫu HVT1 HVT2 HVH HVB HVE Quercetin
Nồng độ μg/ml 200 200 200 200 200 200,0 100 100 100 100 100 40,0 50 50 50 50 50 8 25 25 25 25 25 1,6 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 0,32
24
2.3.4.2. Khảo sát tác dụng bảo vệ gan
-Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng carbon tetraclorid (CCl4)
Phƣơng pháp đƣợc thực hiện theo Turner R.A (1965), có cải tiến phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [17], [62].
- Nguyên tắc phương pháp khảo sát tác dụng bảo vệ gan:
+ CCl4 là một chất gây hủy hoại tế bào gan điển hình. Bản thân CCl4 không độc nhƣng khi vào cơ thể, trong quá trình chuyến hóa, CCl4 tạo thành các gốc tự do, chính các gốc tự do này sẽ liên kết với lipid và các protein trên hệ thống lƣới nội mô của tế bào gan, gây phá hủy cấu trúc và chức năng của hệ thống lƣới, làm tổn thƣơng gan [47], [55].
+ Mức độ tổn thƣơng phụ thuộc vào liều lƣợng CCl4, dạng tổn thƣơng thƣờng tập trung chủ yếu ở vùng trung tâm tiểu thùy.
+ Để thăm dò sự huỷ hoại tế bào gan thƣờng xác định hoạt độ của các enzym transaminase trong huyết thanh. Vì khi tế bào gan bị tổn thƣơng các enzym này thƣờng thay đổi sớm nhất và có tính chất đặc trƣng. Trong số đó có hai loại enzym đƣợc chú ý nhất đó là: AST (Aspartat aminotransferase) và ALT (Alanin aminotransferase) [12], [14].
Ngoài hai enzym AST và ALT thì một số chỉ số sinh hoá khác trong huyết thanh nhƣ bilirubin, protein toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần, phosphatase kiềm... cũng biến đổi khi gan bị tổn thƣơng [18].
Để góp phần tìm hiểu cơ chế tác dụng của dƣợc liệu có liên quan đến tác dụng chống oxy hoá hay không, thí nghiệm tiến hành định lƣợng đồng thời malondialdehyd (MDA), là sản phẩm sinh ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức trimethin (màu hồng) có độ hấp thụ cực đại ở = 532 nm.
Nguyên tắc định lượng MDA: Định lƣợng MDA theo phƣơng pháp Wasowich và Balahoroglu [19], [63].
25
Mẫu nghiên cứu: Lựa chọn mẫu nghiên cứu dựa vào kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa. Tiến hành thí nghiệm với 2 mức liều tƣơng đƣơng với 5g dƣợc liệu/ kg và 10 g dƣợc liệu/ kg thể trọng chuột.
Động vật: chuột nhắt trắng.
Thực nghiệm:
Chuột nhắt trắng đƣợc chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 12 con: Lô 1 (chứng sinh học- Csh): Uống nƣớc cất + tiêm dầu olive Lô 2 (chứng bệnh lý- Cbl ) : Uống nƣớc cất + tiêm CCl4
Lô 3 (chứng dƣơng- Csi) : Uống silymarin 100mg/kg + tiêm CCl4
Lô 4 (thử thuốc HV5) Uống cao hạt Vải với liều tƣơng đƣơng 5g dƣợc liệu/ kg thể trọng chuột nhắt trắng + tiêm CCl4.
Lô 5 (thử thuốc HV10) Uống cao hạt Vải với liều tƣơng đƣơng 10g dƣợc liệu/kg thể trọng chuột nhắt trắng + tiêm CCl4.
Trình tự tiến hành thực nghiệm
Gây tổn thƣơng gan chuột ở các lô 2, 3, 4, 5 bằng cách tiêm phúc mạc dung dịch CCl4 với liều 0,1 ml/ 10 g chuột pha trong dầu olive, tiêm cách ngày cụ thể tiêm vào ngày thứ 1, 3, 5 trong thời gian nghiên cứu.
Tất cả 5 lô đƣợc cho uống thuốc hay nƣớc cất theo quy định liên tục trong 8 ngày (trừ lô chứng sinh lý cho uống nƣớc cất và tiêm dầu olive tƣơng ứng với thể tích tiêm CCL4).
Đến ngày thứ 8, sau khi uống thuốc 1 giờ, giết chuột lấy huyết thanh định lƣợng AST, ALT, bilirubin bằng máy định lƣợng sinh hóa tự động sử dụng kit của hãng DIALAB GmbH (Áo). Đồng thời tách lấy gan để định lƣợng MDA.
Quy trình định lƣợng MDA đƣợc tóm tắt nhƣ sau: cân 100 mg gan, nghiền đồng thể trong 1 ml dung dịch KCl 0,15 M. Hút 300 l dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có 1ml H20, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25 % pha trong acid acetic, đun cách thủy nhiệt độ 100o
26
trong 60 phút, để nguội, thêm 25 µl HCl 5N, lắc đều, thêm vào 3,5 ml n- butanol, ly tâm 3000v/phút x 10 phút, hút phần n-butanol đo quang ở bƣớc sóng 532 nm. Hàm lƣợng MDA đƣợc tính theo phƣơng trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. Lƣợng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình POL của chất thử.
Hình 2.3. Sơ đồ thời gian làm thực nghiệm NC tác dụng bảo vệ gan