Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các cao chiết toàn phần hạt Vải và các phân đoạn chiết xuất, cho thấy phân đoạn cắn chiết ethyl acetat (HVE) có tác dụng mạnh nhất (IC50= 26,87μg/ml) so với các phân đoạn còn lại. Kết hợp với kết quả khảo sát thành phần hóa học và sơ bộ định lƣợng các chất tan trong cắn HVE, Đề tài lựa chọn cắn HVE để phân lập chất tinh khiết.
+ Phƣơng pháp sắc ký cột Pha tĩnh:
Silica gel pha thƣờng (0,04-0,063mm, Merck)
Cân khoảng 250g silica gel, hoạt hóa ở nhiệt độ 1100
trong 1h. Chất hấp phụ đƣợc để đến thật nguội trong bình hút ẩm.
Chuẩn bị cột sắc ký:
Cột sắc ký là một cột thủy tinh có van khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy, kích thƣớc 7cmx80cm. Cột đƣợc rửa sạch, sấy khô, gắn trên một giá vững chắc.
Pha động:
Dung môi rửa giải lần lƣợt là 100% dichloromethan
dichloromethan : methanol tỷ lệ từ (50:1), (25: 1); (10:1); (1:1);v:v Phƣơng pháp nhồi ƣớt:
Cột sắc ký đƣợc lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột để ngăn cho chất hấp phụ chảy xuống khi mở khóa cột.
Chất hấp phụ là silica gel pha thƣờng, đƣợc hòa trong một lƣợng dung môi dicloromethan tạo thành hỗn dịch tƣơng đối loãng, sau đó đƣợc rót cẩn thận vào trong cột đã chứa một lớp dung môi diclromethan trên lớp bông. Mở khóa cột tối đa, loại trừ bong bóng khí bằng cách rót từ từ và thƣờng xuyên vỗ nhẹ cột bằng quả bóp cao su.
53
Ổn định cột: nén cột bằng quả bóp cao su gõ nhẹ đều quanh cột đến khi không còn bọt khí trong cột, mặt thoáng phẳng và lớp silica gel lắng xuống đã ổn định.Tiếp cho dung môi dicloromethan chảy qua cột khoảng 2h, thì khóa cột lại.
Chuẩn bị mẫu sắc ký:
+ 30 g cắn chiết phân đoạn ethyl acetat thu đƣợc trong quá trình chiết xuất dƣợc liệu trình bày trong mục 3.2.1. đƣợc hòa tan trong 1 lƣợng tối thiểu hỗn hợp dung môi Dicloromethan và methanol tỷ lệ 10: 1. Sau đó trộn với một lƣợng silica gel thích hợp (khoảng 10g), thu hồi hết dung môi trong máy cô áp xuất giảm đến khô, đƣợc khối bột mịn tơi xốp.
Đƣa mẫu lên cột và tiến hành sắc ký.
Cột sắc ký đã ổn định đƣợc mở khóa cho dung môi trên cột chảy xuống cách bề mặt silica gel một khoảng 3cm sau đó khóa cột lại. Tiến hành rắc đều toàn bộ mẫu sắc ký đã chuẩn bị lên cột, gõ nhẹ xung quanh thành cột cho bột mẫu lắng xuống từ từ, khi đã ổn định thì mở khóa cột. Rửa lớp bột bám trong lòng cột bằng dung môi dicloromethan:methanol (10:1).
Tiến hành sắc ký với hệ dung môi đã lựa chọn . Phát hiện và thu nhận kết quả sắc ký.
Dịch thu đƣợc trong quá trình rửa giải đƣợc hứng vào bình nón 100ml. Theo dõi bằng SKLM bản mỏng silica gel F254 soi UV và phun thuốc thử hiện màu.Thuốc thử hiện màu sử dụng hơi ammoniac và dung dịch H2SO4 10%
Gộp các bình hứng có sắc ký đồ giống nhau, ghi lại thể tích của phân đoạn mới gộp, thu hồi dung môi.
Kết quả: Quá trình sắc ký thu đƣợc 6 phân đoạn ký hiệu lần lƣợt là: PĐ1 (2,26g); PĐ2(2,30g); PĐ3(3,5g); PĐ4 (4,2g); PĐ5(5,88g); PĐ6 (6,3g) và phần dội cột bằng 100% methanol.
Phân lập MS1:
+ Từ phân đoạn PĐ3 (3,5g) tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột kích thƣớc 3cm x 60cm, với silica gel pha thƣờng cỡ hạt ( 0,040- 0,063mm, merck), dung
54
môi rửa giải là hỗn hợp 2 dung môi diclhoromethan:methanol (12:1; v:v). Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm 10 ml và kiểm tra quá trình sắc ký bằng SKLM. Gộp các ống có sắc ký đồ giống nhau thu đƣợc 3 phân đoạn: PĐ3-1 (1,3 g); PĐ3-2 (0,36g); PĐ3-3 (0,54g).
+ Phân đoạn PĐ3-2 (0,36g) sau khi bay hơi hết dung môi, thấy xuất hiện kết tinh hình kim, màu vàng nâu. Tiến hành kết tinh lại nhiều lần trong dung môi methanol, thu đƣợc chất MS1 (238mg).
Phân lập MS2:
+ Phân đoạn PĐ5 (5,88g) đƣợc tiếp tục sắc ký trên cột kích thƣớc 4cmx60cm, với silica gel pha thƣờng cỡ hạt 0,040- 0,063mm. Hệ dung môi rửa giải là dicloromethan/ methanol với tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 20:1- 1:1; v:v. Quá trình sắc ký thu đƣợc 4 phân đoạn nhỏ: PĐ5-1 (0,82g); PĐ5-2 (0,87g); PĐ5-3 (2,52g); PĐ5-4 (0,4g).
+ 2,52g phân đoạn PĐ5-3 tiếp tục đƣợc sắc ký trên cột kích thƣớc 3cm x 60cm, với silica gel pha thƣờng cỡ hạt 0,04-0,063mm. Hệ dung môi rửa giải là dicloromethanol:methanol tỷ lệ (6:1; v:v). Dịch rửa giải đƣợc hứng vào ống nghiệm 10ml và kiểm tra bằng SKLM. Gom các ống có sắc ký đồ giống nhau lại thu đƣợc 150ml dịch rửa giải cho sắc ký đồ chỉ có một vết. Thu hồi dung môi thấy xuất hiện kết tinh dạnh bột vô định hình, màu vàng nâu . Tiến hành kết tinh lại nhiều lần trong dung môi methanol thu đƣợc chất MS2 (534mg) có màu sắc từ vàng nâu đậm đến vàng nhạt.
55 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tóm tắt quy trình phân lập chất theo sơ đồ hình
SKC, silicagel thƣờng, CH2Cl2:MeOH (20:1, 10:1, 1:1, v:v)
SKC, silicagel thƣờng, CH2Cl2:MeOH (12:1, v:v)
Kết tinh lạ i trong dung mô i Me OH
SKC, silicagel thƣờng, CH2Cl2:MeOH (6:1, v:v ) Kết tinh nhiều lần/ MeOH
Hình 3.11. Sơ đồ phân lập chất tinh khiết
SKC, silicagel thƣờng,
Dic loro methan:MeOH (100% CH2Cl2, 50:1, 25:1,10:1,1:1,100% MeOH;v:v), khoảng 2l/tỷ lệ DM Cắn PĐ Ethyl acetat (HVE) (30g) PĐ5 (5,88g ) 500m g) PĐ2 (2,30g) PĐ1 (2,26g) PĐ3-2 (0,36g) Hợp chất MS1(0,238g) PĐ5-3 (2,52g) PĐ6 (6,3g) PĐ3 (3,50g) PĐ4 (4,2g) PĐ5-2 (0,87g) ) PĐ5-4 (0,40g) PĐ5-1 (0,82g) Hợp chất MS2 (0,534g) PĐ3-1 (1,3g) PĐ3-3 (0,54g)