4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
2.2.3. Phương pháp đánh giá tỷ lệ và mức độ đối kháng của 8 chủng
Trichoderma với nấm Aspergillus niger bằng phương pháp nuôi kép
Bước 1: Chuẩn bị
(1). Môi trường nuôi cấy (PDA)
(2). Nguồn chủng nấm thuần: Nấm Trichoderma và nấm bệnh (Aspergillus
niger) từ slope hoặc từ đĩa petri cấy thuần (nếu từ slope thì phải cấy thuần ra đĩa
petri sau 4- 5 ngày tuổi cấy đối kháng).
(3). Đĩa petri 9cm, môi trường PDA: Tổng số đĩa cần cho 1 lần thí nghiệm là 25 đĩa, trong đó:
- Dùng 10 đĩa nuôi thuần 2 chủng nấm: 5 đĩa cấy nấm Trichoderma và 5 đĩa cấy nấm A. niger.
- Dùng 5 đĩa nuôi đối kháng (Trichoderma và A. niger) - Dùng 5 đĩa nuôi đối chứng Trichoderma
- Dùng 5 đĩa nuôi đối chứng A. niger
(4). Điều kiện nuôi cấy:
- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp: từ 250C - 300C.
- Thiết bị, dụng cụ: Kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi quang học hai mắt, máy ảnh. Thước palme hiện số, giấy ôli,...
Dụng cụ: que cấy có 2R = 5mm để lấy khối nấm (2R = 5mm) từ đĩa cấy thuần. Bìa giấy làm khuôn để cấy nấm (2R = 9cm, đánh dấu đường chéo, đánh đấu 2 điểm đối diện cách mép đĩa 2cm). Sổ nhật ký và phiếu theo dõi.
Bước 2: Cấy đối kháng và cấy đối chứng
- Cấy đối kháng:
(1). Lấy một khối nấm đối kháng 2R = 5mm (Trichoderma đã nuôi thuần chủng sau 4 - 5 ngày tuổi (ở bước 1), chú ý lấy nấm ở vùng ngoại vi (đỉnh sinh trưởng).
(2). Lấy một khối nấm bệnh 2R = 5mm (A. niger) đã nuôi thuần chủng sau 4 - 5 ngày tuổi (ở bước 1), chú ý lấy nấm ở vùng ngoại vi (đỉnh sinh trưởng).
(3). Đặt cùng đồng thời hai khối nấm bệnh A. niger và nấm Trichoderma đối kháng trên một đĩa petri đã có môi trường PDA đặt trên bìa giấy khuôn mẫu có đánh dấu.
- Cấy đối chứng:
(4). Lấy một khối sợi nấm bệnh (A. niger) 2R = 5mm đã được nuôi cấy sau 4 - 5 ngày tuổi từ đĩa petri nuôi thuần chủng (ở bước 1), lấy vùng ngoài đĩa cấy.
(5). Đặt khối nấm A. niger trên một đĩa petri cách mép đĩa khoảng 2cm. (6). Lấy một khối sợi nấm đối kháng (Trichoderma) 2R = 5mm đã được nuôi cấy sau 4 - 5 ngày tuổi từ đĩa petri nuôi thuần chủng (ở bước 1), chú ý lấy vùng ngoại vi đĩa cấy.
(7). Đặt khối nấm đối kháng Trichoderma trên một đĩa petri cách mép đĩa 2cm.
Bước 3: Theo dõi sự phát triển
- Tất cả các đĩa petri cấy đối kháng, đĩa đối chứng, đĩa cấy thuần của nấm
Trichoderma và A. niger được nuôi ở nhiệt độ từ 250C - 300C. - Đo bán kính (mm) khuẩn lạc sau 3, 5, 7 ngày từ khi cấy nấm.
R1 = Bán kính (mm) khuẩn lạc của A. niger ở đĩa petri đối chứng. R2 = Bán kính (mm) khuẩn lạc A. niger ở đĩa petri thử nghiệm đối kháng. - Ghi chép vào sổ nhật ký thí nghiệm hoặc phiếu theo dõi nuôi kép. - Chụp ảnh vào ngày thứ 3, 5, 7 sau khi cấy nấm.
Bước 4: Nhận xét
- Xác định PIMG (tỷ lệ kìm hãm sự sinh trưởng sợi nấm)
- Nhận xét về tỷ lệ và cấp độ hoạt tính đối kháng dựa vào PIMG (tỷ lệ %, cấp độ hoạt tính đối kháng).
Các chỉ tiêu theo dõi
- Thời gian (ngày) để nấm Trichoderma đối kháng với nấm A. niger phát triển - Đặc điểm khuẩn lạc (chủ yếu màu sắc,…)
- PIMG (Percent Inhibition of Mycelial Growth/ Tỷ lệ kìm hãm sự tăng trưởng sợi nấm)
Trong đó:
+ R1 = Bán kính (mm) khuẩn lạc của A. niger ở đĩa petri đối chứng + R2 = Bán kính (mm) khuẩn lạc A. niger ở đĩa petri đối kháng - Với các cấp độ của hoạt tính đối kháng (4 cấp độ)
+ Cấp độ 4: Đối kháng rất cao PIMG > 75%
+ Cấp độ 3: Đối kháng cao 61% ≤ PIMG ≤ 75% + Cấp độ 2: Đối kháng trung bình 50% ≤ PIMG ≤ 60% + Cấp độ 1: Đối kháng thấp PIMG < 50%